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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir que a quantificação exata de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com um pipeline de análise de bioinformatic que pode ser usado para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial causada pela estrutura secundária do DNA mitocondrial.

Resumo

Quantificação de metilação do DNA pode ser conseguida usando sequenciamento de bissulfito, que aproveita a propriedade de bissulfito de sódio para converter unmethylated citosina em uracil, num contexto single-stranded DNA. Sequenciamento de bissulfito pode ser direcionado (usando PCR) ou executadas no genoma inteiro e fornece quantificação absoluta de metilação de citosina na única base-resolução. Dada a natureza distinta de DNA nuclear e mitocondrial, nomeadamente a estrutura secundária, devem ser feitas adaptações de métodos de sequenciamento de bissulfito para investigar a metilação de citosina no DNA mitocondrial. Estrutura secundária e terciária de DNA mitocondrial de fato pode levar a bissulfito artefatos levando a falso-positivos devido a acesso de pobres incompleta desnaturação de bissulfito de ADN single-stranded de sequenciamento. Aqui, descrevemos um protocolo usando uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com pipeline de análise de bioinformatic para permitir a quantificação exata da citosina níveis de metilação no DNA mitocondrial. Além disso, podemos fornecer diretrizes para projetar os primers de sequenciamento de bissulfito específicos para DNA mitocondrial, para evitar a segmentação segmentos NUclear mitocondrial indesejáveis (NUMTs) inserido no genoma nuclear.

Introdução

O genoma mitocondrial é uma estrutura circular, double-stranded de aproximadamente 16,5 kg base (kb), constitui um pesado e um fio de luz. O genoma mitocondrial está presente em várias cópias dentro de cada célula, herdado maternalmente e codifica componentes essenciais da cadeia respiratória complexos1. Semelhantes aos genomas bacterianas e ao contrário do genoma nuclear, o genoma mitocondrial é organizado em numerosas estruturas secundárias e terciárias, como em estruturas enrolado e supercoiled2, que pode tornar o acesso difícil durante o sequenciamento experiências3.

No núcleo, metilação do DNA é uma marca epigenética extensivamente estudada que desempenha um papel em vários processos, nomeadamente na regulação da expressão gênica. Em genomas de mamíferos, a metilação do DNA ocorre principalmente na posição 5 do anel pirimidina de deoxycytidines, principalmente de dinucleotídeos CG (ou CpG). Metilação de citosina é encontrada em 70% de todos os CpG no genoma de células somáticas e contas para ~ 1% do totalque 4bases de DNA. Methylations de DNA também tem sido descrita em contextos não-CpG, como CpA, CpT e CpC e existem em várias quantidades no DNA nuclear, com valores até 25% de todas as Citosinas metiladas em células-tronco embrionárias5,6,7.

Enquanto o methylation do cytosine do genoma nuclear é amplamente aceito, a existência de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial é ainda controversa. O primeiro estudo investigar methylation DNA mitocondrial foi realizado em pilhas cultivadas onde a metilação do DNA mitocondrial foi prontamente detectada, embora em níveis mais baixos em comparação com nuclear DNA8. Em células humanas e murino, metilação de DNA mitocondrial também foi detectada em níveis baixos (2-5%). Utilizando ensaios contando com 5 metilcitosina captura, tais como imunoprecipitação de DNA metilada (MeDIP) seguida por PCR quantitativo, metilação de DNA mitocondrial também foi detectada em vários rato e humanos e células linhas9,10, 11,12. Usando anticorpos contra 5-metilcitosina em um ensaio de ELISA ou espectrometria de massa, níveis substanciais de metilação do DNA foram detectados purificada fracções mitocondrial13,14,15, 16. no entanto, a maioria dos ensaios nos estudos acima mencionados utilizado técnicas que não foram projetadas para fornecer a quantificação absoluta de metilação do DNA na única base-resolução.

Análise de metilação de DNA quantitativo e resolutiva pode ser alcançado por uma técnica chamada "bissulfito de sequenciamento", que aproveita a propriedade de bissulfito de sódio para converter unmethylated citosina em uracil em single-stranded DNA contexto17 . Usando o sequenciamento de bissulfito, uma constelação de estudos detectou a presença de metilação de citosina em vários níveis. DNA mitocondrial de metilação na região D-loop, a 12S ou região 16S prontamente foi detectado em humano18,19,20,21,22,mouse de23 e24 tecidos e células, no entanto, com uma variabilidade de intrigante, de 1-20% do totais citosinas através de estudos.

Em comparação com estes numerosos estudos, poucos estudos, incluindo do nosso grupo, têm disputado a presença de DNA mitocondrial metilação3,25,26,27 ou questionado a relevância biológica de níveis muito baixos de mtDNA níveis (abaixo de 2%)28. Recentemente, nós relatamos a observação de um artefato de bissulfito-sequenciamento potencial em toda mitocondrial bissulfito sequenciamento3. Nós fornecemos evidências de que a estrutura secundária do DNA mitocondrial pode levar a resultados falsos positivos sequenciamento de bissulfito, desse modo, superestimando os níveis de metilação. Nós fornecemos aqui um protocolo para evitar um artefato de bissulfito-conversão de DNA mitocondrial. Este protocolo utiliza uma simples digestão enzimática do DNA para interromper estruturas secundárias do DNA mitocondrial e permitir o acesso total ao bissulfito, seguindo um protocolo de sequenciamento de bissulfito. Além disso, nós fornecemos um pipeline de bioinformatic acompanhamento para a análise do sequenciamento de bissulfito.

Protocolo

1. tratamento enzima de restrição

  1. Linearizar mtDNA tratando o DNA humano total com a enzima de restrição BamHI, que corta na posição 14258 no DNA mitocondrial humano.
    Nota: Para mouse DNA, use a enzima de restrição BglII sob condições idênticas como abaixo.
  2. Para cada amostra onde a metilação do DNA mitocondrial é para ser avaliado, preparar um tubo de reacção de 0,2 mL e adicionar o seguinte mistura: 3 μg DNA genômico (quantificado pelo fluorometry), 15 μL tampão 3, 3 μL BamHI e água acima de 150 μL
  3. Coloque os tubos em um termociclador por 4 h a 37 ° C.

2. bissulfito conversão

  1. Converta o DNA BamHI-Tratado usando bissulfito de sódio, conforme descrito em outro lugar,29.
  2. Use 200-500 ng DNA BamHI-Tratado para cada reação de conversão em um volume total de 20 μL. A recuperação do DNA é 50-70%.
  3. Eluir o DNA de bissulfito-convertido em tampão de eluição 10 μL.
  4. Quantificar o ADN single-stranded por fluorometry.
  5. Opcional: Armazenar DNA bissulfito-convertido a-20 ° C antes de prosseguir para o restante do protocolo. Para armazenamento a longo prazo, armazenar DNA bissulfito-convertido a-80 ° C

3. projeto de sequenciamento de Primers de bissulfito

  1. Desenho de primers para sequenciamento de bissulfito, usando as ferramentas on-line Methprimer30 e31,de BiSearch32.
    Nota: Methprimer e BiSearch permitem para procurar sequências de vinculação da primeira demão sobre sequências genomic onde citosinas são convertidas em timinas, similarmente ao pós-bissulfito tratamento.
  2. Para a amplificação da ideal e imparcial, evite dinucleotídeos CpG em primers e projetar o tamanho do amplicon entre bp 100-300.
  3. Que sejam projetados primers específicos para o DNA mitocondrial, usando a função do BiSearch Busca de Primer. Inserir as primeiras demão já projetado bissulfito convertido, marque a caixa de bissulfito e incluem um genoma de referência e parâmetros PCR.
    Nota: Será exibida uma lista de possíveis produtos PCR.
  4. Copie o top sequências de 1 a 5 da primeira demão e colá-los em um formulário de pedidos para a síntese do oligonucleotide.
    Nota: Uma lista de humanos e sequências de cartilha de DNA mitocondrial de rato validado no laboratório é exibido na tabela 1.
  5. Iniciadores de teste usando bissulfito convertido PCR após eletroforese em gel de agarose, conforme descrito na etapa 4. Testar e otimizar todos os pares da primeira demão separadamente e verifique o tamanho correto do amplicon aparece sobre o gel de agarose.
    Nota: Se multiplexação primários são necessários, adicionar múltiplos primers para uma única reação de PCR e visualizar os produtos PCR na electroforese do gel do agarose ou, um método mais resolutiva como eletroforese em gel de poliacrilamida, para distinguir produtos de semelhante tamanho.

4. bissulfito convertido do PCR e extração do Gel

  1. Para amplificar as regiões de interesse, realize PCR usando uma começo quente Taq polimerase. Brevemente, mistura 100 ng convertido DNA, 500 cartilhas de sentido e anti-sentido µM, 1 µ l do dNTP mix (10 µ m de cada dNTP) e polimerase em 7,5 U/reação em um volume total de 50 µ l. executar o PCR com as seguintes condições: 5 min a 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) figure-protocol-3590 35 ciclos; 10 min 72 ° C. Também usar primers separadamente ou multiplexado.
  2. Opcional: Quando as primeiras demão de multiplexação, uso 200 ng convertido DNA e as seguintes condições de ciclismo: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) figure-protocol-3911 35 ciclos; 10 min 72 ° C.
    Nota: A temperatura pode variar dependendo da temperatura de fusão de primers.
  3. Produtos PCR sujeitos ao gel eletroforese em agarose 2% em 100 volts.
  4. Suave luz UV, extrair produtos PCR com um bisturi e adicionar para microtubos. Não exponha os produtos de PCR de luz UV em excesso para evitar danos ao DNA. Evitar o tempo de exposição acima de 30 s.
  5. Purifica os produtos PCR usando gel de purificação conforme descrito anteriormente3.
  6. Quantificar o DNA purificado da etapa 4.5 usando fluorometry. Prossiga para o passo 5 ou amostras de armazenamento-20 ° c.

5. bissulfito sequenciamento biblioteca preparação

  1. Execute a preparação da biblioteca de produtos PCR bissulfito-convertido.
    Opcional: multiplex produtos do PCR nesta fase.
  2. Executar reparação final usando até 100 ng do produto do PCR. Adicione 3 µ l final prep enzima e amortecedor da reação reparação final 6,5 µ l (10 x) para 55,5 µ l de produto PCR em um tubo de 0,2 mL. Coloque e incubar o tubo em um termociclador por 30 min a 20 ° C, seguido de 30 minutos a 65 ° C.
  3. Ligate adaptadores de sequenciamento, misturando o DNA final-reparado com 15 mix µ l Blunt/TA ligase, 2,5 µ l adaptador e potenciador de ligadura 1 µ l. Se usar < 100 produto PCR do ng como entrada, diluir adaptador 10 vezes.
  4. Coloque a mistura (etapa 5.3) em um termociclador e incubar 15 min a 20 ° C. Pausar o termociclador e adicione 3 µ l usuário enzima ao tubo. Misture e coloque o tubo de volta no termociclador e incubar 15 min a 37 ° C.
  5. Tamanho selecione o adaptador-ligado DNA usando contas de fase sólida reversível imobilização (SPRI) com razões diferentes das esferas para DNA, dependendo do tamanho do produto do PCR.
  6. Adicione 13,5 µ l H2O para adaptador-ligado DNA de passo 5.4 e 55 µ l resuspended SPRI missanga. Incube a temperatura ambiente por 5 min e coloque o tubo num suporte magnético. Quando a solução é clara, transferir o sobrenadante para um tubo novo e descartar o tubo contendo os grânulos.
    Nota: O sobrenadante contém o DNA de adaptador-ligados e grandes fragmentos indesejados são vinculados aos talões descartados.
  7. Adicione 25 µ l resuspended SPRI grânulos para o sobrenadante da etapa 5.6, misturar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Colocar o tubo no stand magnético e descartar o sobrenadante, quando a solução é clara.
    Nota: O sobrenadante Descartado contém DNA indesejado, Considerando que o DNA de adaptador-ligado está vinculado a grânulos.
  8. Enquanto o tubo é o suporte magnético, adicione 200 µ l 80% de etanol (preparado) para lavar os grânulos. Incubar 30 s e remover e descartar o sobrenadante. Repita esta etapa para um total de 2 lavagens.
  9. Ar secos grânulos por 5 min, enquanto o tubo é em suporte magnético com uma tampa aberta.
  10. Retire o tubo do ímã, Eluir o DNA em tampão de eluição 23 µ l e misture. Incube a temperatura ambiente por 2 min.
  11. Coloque o tubo num suporte magnético e quando a solução é clara, 2 µ l de transferência para um prato PCR de 96 poços para a amplificação do pre-PCR (etapa 5.14).
  12. Transferi o restante de aproximadamente 21 µ l para um novo tubo de 0,2 mL para amplificação por PCR (etapa 5.17).
    Nota: Certifique-se de não transferir qualquer grânulos como grânulos podem inibir reações enzimáticas dos próximos passos.
  13. Prossiga para a etapa 5.14 ou amostras de armazenamento-20 ° c.
  14. Execute a amplificação do pre-PCR por RT-qPCR para estimar o número de ciclos necessários para amplificar o DNA do adaptador-ligados. Por reação, adicionar o seguinte no PCR de 96 poços da placa contendo 2 µ l DNA (etapa 5.11): cartilha de índice 0,4 µ l, 0,4 µ l universal do PCR da primeira demão, 7,2 µ l H2O, 10 µ l RT-qPCR mestre mix.
  15. Coloque a placa em uma máquina PCR em tempo real e sujeito a placa para as seguintes condições: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) figure-protocol-8055 20 ciclos; 5 min 65 ° C.
  16. Estime o número de ciclos de amplificação necessária para cada amostra subtraindo um valor de Ct para o Ct-valor do pré-amplificação RT-qPCR correspondente ao fim da fase linear da reação de PCR.
  17. Amplificar o DNA adaptador-ligados da etapa 5.12 misturando: 21 µ l DNA, 25 µ l PCR master mix, 1 µ l índice da primeira demão, 1 µ l do PCR Universal da primeira demão e 2 µ l H2O. Em um termociclador, sujeito cada amostra para as seguintes condições: 30 s a 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) figure-protocol-8662 [Ct calculado da etapa 5.16] ciclos; 5 min 65 ° C.
    Nota: Lembre-se de utilizar somente uma primeira demão de índice por amostra para permitir a multiplexação. O índice é inserido durante a PCR.
  18. Purificar os grânulos SPRI DNA amplificados e eluir em tampão de eluição 22 µ l.
  19. Controlar a qualidade da biblioteca pelo método de gel de eletroforese ou alternativa. Procure por tamanhos de pico de biblioteca correta (tamanho do produto (s) PCR mais adaptador).
  20. Estimar o tamanho médio de pares de base do produto de biblioteca pela análise do esfregaço: em avançada configurações globais, clique duas vezes em "tabela" sob análise do esfregaço. Definir a região de 100-1000 bp e clicar Okey. Sob a Mesa da região, a região definida aparece e biblioteca de tamanho médio (bp) é calculada.
  21. Quantificar as bibliotecas por fluorometry. Prossiga para o passo 6 ou bibliotecas de armazenamento-20 ° c.

6. na próxima geração de sequenciamento

  1. Calcule a concentração de nM de bibliotecas, usando a fórmula:
    figure-protocol-9860
  2. Diluir as bibliotecas para o mesmo nM nM de concentração por exemplo 2 (escolher 4 nM, 2 nM, 1 nM, ou 0,5 nM, dependendo da concentração de biblioteca). Todas as bibliotecas para alcançar uma piscina de 2 bibliotecas nM da piscina.
  3. Desnaturar e diluir bibliotecas seguindo o guia de instrumento de sequenciamento. Em suma: desnaturar o pool nM 2 adicionando 0,2 N NaOH e incubar a temperatura ambiente por 5 min. diluir a piscina desnaturada para uma diluição final de 22:00. Desnaturar e diluir uma biblioteca de controle comercialmente disponível para uma diluição final de 12:05. Para um novo tubo, misture o pool de 22:00 com a biblioteca de controle 12:05 20%.
    Nota: Conversão de bissulfito introduz complexidade muito baixa. 20% de controle de biblioteca spike resultará em melhor qualidade de sequenciamento.
  4. Execute um 150 bp emparelhado-final em sequência usando um instrumento de sequenciamento profunda.

7. computacional análise - níveis de metilação de estimativa

  1. Gerar arquivos de .fastq (aqui chamados de sample1_R1.fastq.gz e sample1_R2.fastq.gz), gerar um índice de bismark do genoma inteiro de interesse (aqui em uma pasta chamada bismarkIndex) e certifique-se de que a sequência genômica de chrM está disponível em fasta formato (aqui em uma pasta chamada chrM).
  2. Pré-processar leituras para remover adaptadores e viés introduzido por primers: Use a ferramenta Trim_galore33. Remova os dois nucleotídeos da extremidade 5' do lê ambos frente e verso.
    trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o. / --trim1 - emparelhado sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz
  3. Alinhar o pre-processed leituras para o genoma inteiro usando Bismark34
    Bismark - andorinha..--bam -o. /. / bismarkIndex / o-1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz
    Nota: Se outro alinhador é usado, certifique-se de que lê o que não pode ser alinhado com exclusividade é descartadas.
  4. Extrato lê o mapeamento para o cromossomo M, aqui usando Samtools35
    samtools classificar -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam
    sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam
    samtools índice sample1_sorted.bam
    samtools Ver os chrM de sample1_sorted.bam -u | samtools classificar - n - O BAM -o sample1_chrM.bam
  5. Extrair as informações de metilação
    bismark_methylation_extractor -p - CX..--cytosine_report..--abrangente..--genome_folder. /./sample1_chrM.bam chrM
  6. Use o .bedGraph, os COV ou os arquivos de CX_report.txt para uma análise mais aprofundada. Use o arquivo sample1_chrM.CX_report.txt para visualização e teste.
  7. Execute o recorte ainda mais na etapa de pré-processamento, se várias regiões são interrogadas e um viés de primeira demão pode ser visível nas tramas M-viés geradas durante o mapeamento. Consulte a documentação do Bismark para obter mais informações.

8. computacional análise - teste de diferenças

  1. Certifique-se de que o arquivo CX_report.txt contém 7 colunas, cromossomo (chrM aqui), posição, vertente, número de leituras metilados, número de leituras unmethylated, C contexto e sequência circundante, para todos os C no cromossomo M.
  2. Como o CX_report cobre chrM em sua totalidade, verifique o subconjunto para a região (ões) que é amplificado.
  3. Use testes não-paramétricos para as diferenças entre as amostras, tais como o teste exato de um pescadores do C individual ou um teste de sinal-para toda uma região.
    Nota: Quantificação será frequentemente perto de 0% de metilação, que é a razão por que supondo que a normalidade não é apropriado.
  4. Da mesma forma, para visualização, ou Visualizar quantiles ou calcular intervalos de confiança de proporção binomial.

Resultados

Duas etapas neste protocolo são cruciais ao investigar a metilação do DNA mitocondrial. 1) a abertura da estrutura secundária e 2) o projeto de primers de específicas de DNA mitocondriais.

Digerindo o DNA genômico humano com a enzima de restrição BamHI (Figura 1), a estrutura de DNA mitocondrial será cortada no nucleotídeo posição 14.258 e estrutura secundária será aberta.

Discussão

Aqui, nós fornecemos um protocolo de bissulfito-sequenciamento que é projetado especificamente para interrogar a metilação do DNA mitocondrial. As diferenças com bissulfito-sequenciamento protocolos usados para DNA genômico situa-se na utilização de uma enzima de restrição prévia etapa de digestão e uma análise de bioinformatic acórdão fora falsos positivos decorrentes NUMT sequências.

Nós fornecemos um protocolo para evitar artefatos de bissulfito-sequenciamento ao investigar...

Divulgações

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes para declarar.

Agradecimentos

A Novo Nordisk Fundação Centro de pesquisa metabólica básica é um centro de pesquisa independente da Universidade de Copenhagen, parcialmente financiados por uma doação irrestrita da Novo Nordisk Foundation.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BamHINew England BioLabs# R0136
EZ DNA methylation-lightning kitZymo Research# D5030 
Qubit ssDNA assayThermo Fisher Scientific# Q10212
Qubit assay tubesThermo Fisher Scientific# Q32856
HotStarTaq plus DNA polymerase kitQiagen# 203603 
QIAquick Gel Extraction KitQiagen# 28704
NEBNext Ultra DNA Library Kit for IlluminaNew England BioLabs# E7370S
NEBNext Multiplex Oligoes for IlluminaNew England BioLabs# E7335S
AMPure XP BeadsBeckman Coulter# A63881
High Sensitivity DNA chipAgilent# 5067-4626
Qubit high sensitivity dsDNA assayThermo Fisher Scientific# Q33230
MiSeq reagent kit v2 300 cyclesIllumina# MS-102-2003
PhiX control v3Illumina# FC-110-3001
Sodium hydroxide Sigma# S5881
Thermal cycler C1000Biorad# 1851148
CFX96 Real-Time PCR detection systemBiorad #1855195
Qubit FluorometerThermo Fisher Scientific# Q33226
Bioanalyzer 2100Agilent# G2939BA
MiSeq instrumentIllumina# SY-410-1003

Referências

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