Méthodologie pour une détection précise de la méthylation de l’ADN Mitochondrial

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour permettre une quantification précise de la méthylation de l’ADN (ADN mitochondrial) mitochondriale. Dans ce protocole, nous décrivons une digestion enzymatique de l’ADN avec BamHI couplé avec un pipeline d’analyse bio-informatique qui peut être utilisé pour éviter une surestimation des niveaux de méthylation de l’ADNmt causée par la structure secondaire de l’ADNmt.

Résumé

Quantification de la méthylation de l’ADN peut être réalisée en utilisant le séquençage de bisulfite, qui tire parti de la propriété de bisulfite de sodium pour convertir non méthylé cytosine en uracile, dans un contexte d’ADN simple brin. Le séquençage du bisulfite peut être ciblée (par PCR) ou effectuée sur l’ensemble du génome et fournit une quantification absolue de la méthylation de la cytosine à la résolution de base unique. Compte tenu de la nature distincte de l’ADN nucléaire et mitochondrial, notamment dans la structure secondaire, adaptations des méthodes de séquençage de bisulfite pour étudier la méthylation de la cytosine dans l’ADN mitochondrial se référera. Structure secondaire et tertiaire de l’ADNmt peut en effet conduire à bisulfite de séquençage des artefacts conduisant à des faux positifs en raison de la piètre accès incomplet dénaturation de bisulfite à l’ADN simple brin. Nous décrivons ici un protocole utilisant une digestion enzymatique de l’ADN avec BamHI couplé avec pipeline analyse bioinformatique pour permettre une quantification précise de la cytosine niveaux de méthylation de l’ADN mitochondrial. En outre, nous fournissons des lignes directrices pour concevoir les amorces de séquençage de bisulfite spécifiques d’ADN mitochondrial, afin d’éviter de cibler les segments nucléaire MiTochondrial indésirables (NUMTs) inséré dans le génome nucléaire.

Introduction

Le génome mitochondrial est une structure circulaire double brin de base environ 16,5 kilos (Ko), constituant un lourd et un brin de lumière. Le génome mitochondrial est présent en plusieurs exemplaires dans chaque cellule, maternellement hérité et encode les éléments essentiels de la chaîne respiratoire des complexes¹. Semblables aux génomes bactériens et à la différence du génome nucléaire, le génome mitochondrial est organisé dans nombreuses structures secondaires et tertiaires, comme structures enroulé et surenroulé², qui peuvent rendre l’accès difficile pendant le séquencement expériences,³.

Dans le noyau, la méthylation de l’ADN est une marque épigénétique étudiée qui joue un rôle dans de nombreux processus, notamment dans la régulation de l’expression des gènes. Dans les génomes de mammifères, la méthylation de l’ADN se produit principalement sur la position de l’anneau de pyrimidine de deoxycytidines, pour la plupart sur des dinucléotides CG (ou CpG) 5. Méthylation de la cytosine se trouve à 70 % de tous les CpG dans le génome des cellules somatiques et représente environ 1 % du total que des bases de l’ADN⁴. Méthylations de l’ADN ont également été recensés dans des contextes non-CpG, tels que le CpA, CpT et CpC et existent en différentes quantités dans l’ADN nucléaire, avec des valeurs jusqu'à 25 % de tous les cytosines méthylées dans les cellules souches embryonnaires^5,6,7.

Alors que la méthylation de la cytosine du génome nucléaire est largement acceptée, l’existence de méthylation de l’ADN (ADN mitochondrial) mitochondriale est encore controversée. La première étude d’instruction ADNmt méthylation a été réalisée dans des cellules cultivées où la méthylation de l’ADN mitochondrial a été facilement détectée, mais à des niveaux inférieurs par rapport à l’ADN nucléaire⁸. Dans les cellules humaines et murines, méthylation de l’ADN mitochondrial a été également détectée à faibles doses (2-5 %). À l’aide d’essais en s’appuyant sur 5 méthylcytosine capture comme immunoprécipitation d’ADN méthylée (MeDIP) suivie d’une PCR quantitative, méthylation de l’ADN mitochondrial a aussi détectée dans diverses souris et les humains et les cellules lignes^{9,10, 11,},¹². Utilisant des anticorps contre la 5-méthylcytosine dans une analyse ELISA ou spectrométrie de masse, des niveaux importants de méthylation de l’ADN ont été détectés des fractions mitochondriales purifiée^{13,14,15, 16}. Toutefois, la plupart des essais dans les études susmentionnées a utilisé des techniques qui ne visaient pas à procurer une quantification absolue de méthylation de l’ADN à la résolution de base unique.

Analyse quantitative et résolutoire méthylation d’ADN peut être réalisée par une technique nommée « bisulfite de séquençage », qui tire parti de la propriété de bisulfite de sodium pour convertir non méthylé cytosine en uracile en simple brin ADN contexte¹⁷ . Moyen du séquençage de bisulfite, une constellation d’études a détecté la présence de la méthylation de la cytosine à différents niveaux. Méthylation de l’ADN mitochondrial dans la région de la boucle D, de la 12 s ou de la région de 16 s était facilement détectable à l’humain^{18,19,20,21,22,23} et souris²⁴ tissus et cellules, cependant, avec une variabilité intrigante, de 1 à 20 % du totales cytosines dans toutes les études.

En comparaison avec ces nombreuses études, seules quelques études, y compris de notre groupe, ont contesté la présence de l’ADN mitochondrial méthylation^3,25,26,27 ou conteste la pertinence biologique de niveaux très faibles d’ADNmt niveaux (inférieur à 2 %)²⁸. Récemment, nous avons rapporté l’observation d’un artefact de bisulfite de séquençage potentiel au bisulfite ensemble mitochondrial séquençage³. On a démontré que la structure secondaire de l’ADN mitochondrial pourrait conduire à de faux positifs dans le séquençage de bisulfite, surestimant ainsi des niveaux de méthylation. Nous fournissons ici un protocole visant à prévenir un artefact de bisulfite de conversion de l’ADNmt. Ce protocole utilise une simple digestion enzymatique de l’ADN afin de perturber les structures secondaires de l’ADNmt et autorise l’accès complet au bisulfite selon un protocole de séquençage de bisulfite. En outre, nous fournissons un accompagnement pipeline bioinformatiques pour l’analyse du séquençage de bisulfite.

Protocole

1. traitement de l’Enzyme de Restriction

1. Linéariser ADNmt en traitant l’ADN humain total avec l’enzyme de restriction BamHI, qui coupe à position 14258 dans l’ADN mitochondrial humain.
   Remarque : Pour souris ADN, utiliser l’enzyme de restriction BglII dans des conditions identiques comme ci-dessous.
2. Pour chaque échantillon où la méthylation de l’ADN mitochondrial doit être évaluée, préparer un tube de réaction de 0,2 mL et ajouter le mélange : 3 suivant μg ADN génomique (quantifié par fluorimétrie), 15 μl tampon de 3, 3 μL BamHI et l’eau jusqu'à 150 μL
3. Placer les tubes dans un thermocycleur pendant 4 h à 37 ° C.

2. Conversion de bisulfite

1. Convertir BamHI-a traité l’ADN à l’aide de bisulfite de sodium comme décrit ailleurs²⁹.
2. Utiliser 200-500 ng BamHI-a traité l’ADN de chaque réaction de conversion dans un volume total de 20 μL. La récupération de l’ADN est de 50 à 70 %.
3. Éluer l’ADN Bisulfite-converti en tampon d’élution 10 μL.
4. Quantifier l’ADN monocaténaire par fluorimétrie.
5. En option : Stocker ADN bisulfite-converti à-20 ° C avant de passer le reste du protocole. Pour le stockage à long terme, stocker l’ADN bisulfite-converti à-80 ° C

3. conception du Bisulfite de séquençage des amorces

1. Concevoir des amorces pour l’ordonnancement de bisulfite en utilisant les outils en ligne Methprimer³⁰ et BiSearch^31,32.
   Remarque : Methprimer et BiSearch permettent de rechercher des séquences de liaison d’amorces sur les séquences génomiques où les cytosines sont converties en thymines, de la même façon au bisulfite après traitement.
2. D’amplification optimale et non biaisée, éviter dinucléotides dans les amorces et la taille de l’amplicon entre 100-300 bp de conception.
3. S’assurer que les amorces sont spécifiques de l’ADN mitochondrial, à l’aide de la fonction de BiSearch Recherche de Primer. Insérer les amorces déjà conçu bisulfite converti, cocher la case de bisulfite et incluent un génome de référence et les paramètres de la PCR.
   NOTE : Une liste de produits PCR possibles s’affichera.
4. Copiez le haut 1-5 séquences d’amorces et les coller dans un formulaire de commande pour la synthèse d’oligonucléotide.
   NOTE : Une liste de l’homme et des séquences d’amorces d’ADNmt souris qui a été validé en laboratoire est affiché dans le tableau 1.
5. Des amorces de test à l’aide de bisulfite converti PCR Après électrophorèse sur gel d’agarose, tel que décrit à l’étape 4. Tester et optimiser toutes les paires d’amorces séparément et que la taille de l’amplicon correct apparaît sur le gel d’agarose.
   Remarque : Si le multiplexage amorces sont nécessaires, ajoutez plusieurs amorces à une simple réaction de PCR et visualiser les produits PCR sur gel d’agarose ou, une méthode plus résolutoire comme l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide, pour distinguer des produits similaires taille.

4. bisulfite converti PCR et Gel Extraction

1. Pour amplifier les régions d’intérêt, effectuer la PCR à l’aide d’une polymérase de Taq de démarrage à chaud. En bref, mix 100 ng converti ADN, 500 amorces sens et anti-sens µM, 1 µL dNTP mix (10 µM de chaque dNTP) et polymérase à 7,5 U/réaction dans un volume total de 50 µL. PCR exécuter dans les conditions suivantes : 5 min à 95 ° C (60 s 94 ° C ; 60 s 55 ° C * ; 60 s 72 ° C) 35 cycles ; 10 min 72 ° C. Utiliser les amorces soit séparément ou multiplexées.
2. Facultatif : Lorsque le multiplexage des amorces, utilisation 200 ng converti ADN ainsi que les conditions suivantes de cyclisme : 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C ; 90 s 55 ° C * ; 90 s 72 ° C) 35 cycles ; 10 min 72 ° C.
   Remarque : La température peut varier selon la température de fusion d’amorces.
3. Produits PCR soumis au gel d’électrophorèse sur agarose à 2 % à 100 volts.
4. Sous la douce lumière UV, extraire des produits PCR avec un scalpel et ajouter aux microtubes. Ne pas exposer les produits PCR à la lumière UV excessive afin d’éviter des dommages à l’ADN. Éviter les temps d’exposition plus de 30 s.
5. Purifier les produits PCR à l’aide de gel de purification comme décrit plus haut³.
6. Quantifier l’ADN purifié de l’étape 4,5 à l’aide de fluorométrie. Passez à l’étape 5 ou Banque d’échantillons à-20 ° C.

5. bisulfite séquençage bibliothèque préparation

1. Effectuer la préparation de la bibliothèque des produits PCR du bisulfite-converti.
   En option : multiplex produits PCR à ce stade.
2. Effectuer fin-réparation à l’aide de jusqu'à 100 ng de produit PCR. Ajouter 3 préparation enzymatique µL fin et tampon de réaction réparation fin µL 6.5 (x 10) à 55,5 produit de PCR µL dans un tube de 0,2 mL. Placer et incuber les tubes dans un thermocycleur pendant 30 min à 20 ° C, suivie de 30 min à 65 ° C.
3. Ligaturer les adaptateurs de séquençage en mélangeant l’ADN de fin-réparé alliant 15 µL Blunt/TA ligase, 2,5 µL adaptateur et exhausteur de ligature 1 µL. Si vous utilisez < 100 produit de PCR ng comme entrée, diluer adaptateur 10 fois.
4. Placez le mélange (étape 5.3) dans un thermocycleur et incuber pendant 15 min à 20 ° C. Mettre en pause le thermocycleur et ajouter 3 µl utilisateur Enzyme au tube. Mélanger et placer le tube dans le thermocycleur et incuber 15 min à 37 ° C.
5. Taille sélectionnez l’ADN adaptateur-ligaturé à l’aide de perles Solid Phase réversible immobilisation (SPRI) avec des proportions variables de perles à l’ADN, selon la taille de produit PCR.
6. Ajouter 13,5 µL H₂O à ADN ligaturé à l’adaptateur d’étape 5.4 et 55 µL resuspendues SPRI Perles. Incuber à température ambiante pendant 5 min et place le tube sur un support magnétique. La solution est claire, transférer le surnageant dans un nouveau tube et jeter le tube contenant les perles.
   Remarque : Le surnageant contient l’ADN adaptateur-ligaturé et grands fragments non désirés sont liés aux talons mis au rebut.
7. Ajouter 25 µL resuspendues SPRI perles au surnageant de point 5.6, mélanger, laisser incuber 5 min à température ambiante. Placer le tube sur le support magnétique et éliminer le surnageant lorsque la solution est claire.
   Remarque : Le surnageant mis au rebut contient des séquences d’ADN non désirées, alors que l’ADN adaptateur-ligaturé est lié aux perles.
8. Bien que le tube sur le support magnétique, ajouter 200 µL 80 % d’éthanol (fraîchement préparé) pour laver les perles. Incuber 30 s et retirer et jeter le surnageant. Répétez cette étape pour un total de 2 lavages.
9. Alors que le tube soit sur support magnétique avec un couvercle ouvert d’air secs perles pendant 5 min.
10. Retirer le tube de l’aimant, éluer l’ADN dans 23 µL de tampon d’élution et mélanger. Incuber à température ambiante pendant 2 min.
11. Placer le tube sur un support magnétique et lorsque la solution est claire, transférer 2 µL dans une plaque à 96 puits PCR pour l’amplification PCR-pré (étape 5.14).
12. Transférer le µL environ 21 reste dans un nouveau tube de 0,2 mL pour l’amplification PCR (étape 5.17).
    Remarque : Veillez à ne pas transférer les perles Perles peuvent inhiber les réactions enzymatiques des prochaines étapes.
13. Passez à l’étape 5.14 ou Banque d’échantillons à-20 ° C.
14. Effectuer l’amplification pre-PCR par RT-qPCR pour estimer le nombre de cycles nécessaire pour amplifier l’ADN ligaturé à l’adaptateur. Par réaction, ajouter ce qui suit dans la PCR 96 puits contenant l’ADN 2 µL (étape 5.11) sur plaque : 0,4 amorce d’Index µL, 0,4 amorce PCR universelle µL, 7,2 µL H₂O, 10 µL RT-qPCR master mix.
15. Placer la plaque dans une machine PCR en temps réel et la plaque sous réserve des conditions suivantes : 30 s à 98 ° C (10 s 98 ° C ; 75 s 65 ° C) 20 cycles ; 5 min 65 ° C.
16. Estimer le nombre de cycles d’amplification nécessaire pour chaque échantillon en soustrayant un Ct-valeur à la valeur Ct de la RT-qPCR de pré-amplification correspondant à la fin de la phase linéaire de la réaction PCR.
17. Amplifier l’ADN ligaturé à l’adaptateur de l’étape 5.12 en mélangeant : 21 µL ADN, 25 µL PCR master mix, amorce de Index 1 µL, amorces de PCR universelle 1 µL et µL 2 H₂O. Dans un thermocycleur, soumettre chaque échantillon aux conditions suivantes : 30 s à 98 ° C (10 s 98 ° C ; 75 s 65 ° C) [Ct calculée à l’étape 5.16] cycles ; 5 min 65 ° C.
    Remarque : N’oubliez pas d’utiliser uniquement une amorce d’Index par échantillon permettant de multiplexage. L’index est inséré au cours de la PCR.
18. Purifier les perles SPRI de l’ADN amplifiés et éluer dans 22 µL de tampon d’élution.
19. Contrôle qualité de la bibliothèque par la méthode de gel électrophorèse ou alternative. Recherchez les tailles de pointe bibliothèque correcte (taille de produit PCR et adaptateur).
20. Estimer la taille moyenne de paires de bases du ou des produits bibliothèque par l’analyse du frottis : dans les paramètres globaux avancés, double-cliquez sur «tableau» selon l’analyse du frottis. Définir la zone de 100-1000 bp, puis cliquez sur OK. Sous la Table de la région, la région définie apparaît et bibliothèque de taille moyenne (bp) est calculée.
21. Quantifier les bibliothèques par fluorimétrie. Passez à l’étape 6 ou bibliothèques de magasin à-20 ° C.

6. prochaine génération séquençage

1. Calculer la concentration de nM de bibliothèques en utilisant la formule :
   
2. Diluer les bibliothèques à la même nM de concentration par exemple 2 nM (choisissez 4 nM, 2 nM, 1 nM, soit 0,5 nM selon les concentrations de bibliothèque). Mettre en commun toutes les bibliothèques pour réaliser un bassin de 2 bibliothèques nM.
3. Dénaturer et diluer les bibliothèques suivant le guide d’instrument de séquençage. En bref : dénaturer la piscine nM 2 en ajoutant 0,2 N NaOH et incuber à température ambiante pendant 5 min. diluer le pool dénaturé à une dilution finale de 22:00. Dénaturer et diluer une bibliothèque de contrôles disponible dans le commerce à une dilution finale de 12:05. Dans un nouveau tube, côtoient la piscine de 22:00 20 % bibliothèque de contrôles 12:05.
   Remarque : Conversion de Bisulfite introduit une complexité très faible. 20 % contrôle bibliothèque spike-dans se traduira de meilleure qualité de séquençage.
4. Exécuter une séquence de bout jumelé bp 150 à l’aide d’un instrument de séquençage en profondeur.

7. calcul analyse - estimation méthylation niveaux

1. Générer des fichiers .fastq (ici appelés sample1_R1.fastq.gz et sample1_R2.fastq.gz), création d’un index de bismark du génome entier d’intérêt (ici dans un dossier appelé bismarkIndex) et s’assurer que la séquence génomique de chrM est disponible en fasta format (ici dans un dossier appelé Arca).
2. Pré-traiter lectures pour éliminer les adaptateurs et biais introduit par les amorces : utilisez l’outil Trim_galore³³. Retirez deux nucléotides de l’extrémité 5' de la se de lit avant et arrière.
   trim_galore--clip_R1 2--clip_R2 2 -o. /--jumelé trim1--sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz
3. Aligner les lectures prétraitées à l’ensemble du génome à l’aide de Bismark³⁴
   Bismark--queue d’aronde--bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz
   Remarque : Si un autre dispositif d’alignement est utilisé, s’assurer que les lectures qui ne peuvent pas être particulièrement bien alignés sont ignorées.
4. Extrait lit cartographie du chromosome M, ici en utilisant Samtools³⁵
   samtools Trier -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam
   sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM
   samtools index sample1_sorted.bam
   samtools Découvre -u sample1_sorted.bam chrM | samtools tri - n - O BAM -o sample1_chrM.bam
5. Extraire les informations de méthylation
   bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--complet--genome_folder. /./sample1_chrM.bam chrM
6. Utiliser le .bedGraph, le .cov ou les fichiers CX_report.txt pour une analyse plus approfondie. Utilisez le fichier sample1_chrM.CX_report.txt pour la visualisation et l’analyse.
7. Effectuer d’écrêtage plus loin dans l’étape de prétraitement, si plusieurs régions sont interrogées et un biais d’apprêt peut être visible dans les parcelles de M-partialité générées au cours du mappage. Reportez-vous à la documentation de Bismark pour plus d’informations.

8. computational Analysis - Test des différences

1. Vérifiez que le fichier CX_report.txt contient 7 colonnes, chromosome (ici RMca), position, strand, nombre de lectures méthylés, le nombre de lectures non méthylés, C contexte et séquence environnant, pour tous les C sur le chromosome M.
2. Comme le CX_report couvre chrM dans son intégralité, vérifier le sous-ensemble à l’ou les régions qui est amplifié.
3. Utilisez les tests non paramétriques des différences entre les échantillons, tels que le test exact d’un pêcheurs pour individuel C ou un signe-test pour l’ensemble de la région.
   NOTE : Quantification sera souvent proche de 0 % de méthylation, qui est la raison pourquoi l’hypothèse de normalité n’est pas adaptée.
4. De même, pour la visualisation, soit visualiser les quantiles ou calculer des intervalles de confiance de proportion binomiale.

Résultats

Deux étapes dans le présent protocole sont cruciales lors d’enquêtes sur la méthylation de l’ADN mitochondrial. 1) l’ouverture de la structure secondaire et 2) le design des amorces de spécifique de l’ADN mitochondriales.

Par digestion de l’ADN du génome humain avec l’enzyme de restriction BamHI (Figure 1), la structure de l’ADN mitochondriale sera réduite à la position de nucl...

Discussion

Ici, nous fournissons un protocole de bisulfite de séquençage qui est spécifiquement conçu pour interroger la méthylation de l’ADN mitochondrial. Les différences avec le bisulfite de séquençage protocoles utilisés pour l’ADN génomique réside dans l’utilisation d’une étape de digestion préalable des enzymes de restriction et une analyse bioinformatique arrêt des faux positifs découlant de séquences NUMT.

Nous fournissons un protocole pour éviter les artefacts de bisulfi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI	New England BioLabs	# R0136
EZ DNA methylation-lightning kit	Zymo Research	# D5030
Qubit ssDNA assay	Thermo Fisher Scientific	# Q10212
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	# Q32856
HotStarTaq plus DNA polymerase kit	Qiagen	# 203603
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	# 28704
NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina	New England BioLabs	# E7370S
NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina	New England BioLabs	# E7335S
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	# A63881
High Sensitivity DNA chip	Agilent	# 5067-4626
Qubit high sensitivity dsDNA assay	Thermo Fisher Scientific	# Q33230
MiSeq reagent kit v2 300 cycles	Illumina	# MS-102-2003
PhiX control v3	Illumina	# FC-110-3001
Sodium hydroxide	Sigma	# S5881
Thermal cycler C1000	Biorad	# 1851148
CFX96 Real-Time PCR detection system	Biorad	#1855195
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	# Q33226
Bioanalyzer 2100	Agilent	# G2939BA
MiSeq instrument	Illumina	# SY-410-1003