JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו נדון סדרה של פרוטוקולים עבור אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית התאית בתאים בתרבית. אנחנו מתמקדים גירויים שונים בתדר הזדקנות ביולוגית. ומתארות כימות של סמנים משותפים הקשורים הזדקנות ביולוגית. אנו מספקים פרטים טכניים באמצעות fibroblasts כמודל, אך ניתן להתאים את הפרוטוקולים השונים דגמי הסלולר.

Abstract

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא מצב של מחזור התא קבוע מעצר מופעלת בתגובה לגירויים מזיקים שונים. הפעלה של הזדקנות ביולוגית הסלולר מהווה סימן היכר של תנאים pathophysiological שונים, כולל הגידול דיכוי, רקמות שיפוץ והתיישנות. Inducers של הזדקנות ביולוגית הסלולר ויוו מאופיינים עדיין לקוי. עם זאת, מספר של גירויים יכול לשמש כדי לקדם את הזדקנות ביולוגית הסלולר ex-vivo. ביניהם, הזדקנות ביולוגית-inducers הנפוצים ביותר הם תשישות replicative, מייננת ולא מייננת, genotoxic סמים, סטרס חמצוני, demethylating, acetylating סוכנים. כאן, אנו נספק הוראות מפורטות על איך להשתמש גירוי לזירוז fibroblasts לתוך הזדקנות ביולוגית. פרוטוקול זה בקלות ניתן להתאים עבור סוגים שונים של תאים ראשי שורות תאים, כולל תאים סרטניים. אנו מתארים גם שיטות שונות עבור האימות של הזדקנות ביולוגית אינדוקציה. בפרט, אנו מתמקדים מדידת הפעילות של האנזים lysosomal הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל), הקצב לסינתזת DNA באמצעות 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (אדו) התאגדות assay, רמות הביטוי של מחזור התא p16 מעכבי p21, ואת הביטוי ואת הפרשת חברים פנוטיפ הפרשה Senescence-Associated (SASP). לבסוף, אנו מספקים תוצאות דוגמה, לדון בהמשך יישומים של פרוטוקולים אלה.

Introduction

ב-1961, Hayflick ולמורהד דיווחו כי ראשי fibroblasts בתרבות לאבד את הפוטנציאל המקדימות שלהם לאחר מעברים רצופים1. תהליך זה נגרמת על ידי לקיצור רציפים של טלומרים לאחר כל חלוקת התא. כאשר טלומרים מגיעים באורך ביקורתי קצר, הם מזוהים התגובה נזק לדנ א (DDR) שמפעיל מעצר בלתי הפיך של התפשטות — כהגדרתו גם הזדקנות ביולוגית replicative. הזדקנות ביולוגית replicative נחשב כיום לאחד גירויים רבים ידועים כדי לגרום למצב של קבע מחזור מעצר התא שמעבדת תאים חסרי רגישות mitogens וגם אפופטוטיים להיפגע אותות2,3. התוכנית הזדקנות ביולוגית מאופיין בדרך כלל על-ידי תכונות נוספות כולל פעילות lysosomal גבוהה, תפקוד מיטוכונדריאלי, שינויים גרעינית, rearrangements כרומטין, רשתית תוך-פלזמית מתח, נזק לדנ א, הזדקנות ביולוגית-הקשורים הפרשה פנוטיפ (SASP)3,4. תאים senescent יש תפקידים רבים בגוף: פיתוח, פצע ריפוי ו הגידול דיכוי2. באותה מידה, הם ידועים לשחק תפקיד חשוב הזדקנות ו, באופן פרדוקסלי, ב התקדמות הגידול5. לעיתים קרובות מיוחסות השפעות שליליות, סותרים באופן חלקי, הזדקנות ביולוגית SASP6.

. לאחרונה, זה הוצג כי חיסול של תאים senescent מן העכברים מוביל להארכת תוחלת החיים וכדי חיסול של רבים של הזדקנות תכונות7,8,9,10,11, 12. באותה דרך, בסמים מרובים פותחו לחסל גם את תאי senescent (senolytics) או למקד SASP13,14. הפוטנציאל הטיפולי של אנטי אייג'ינג משכה לאחרונה יותר תשומת לב השדה.

חקר מנגנוני משויך הזדקנות ביולוגית הסלולר, ההקרנות עבור התערבויות תרופתי בכבדות להסתמך על דגמי ex-vivo , במיוחד על אנושי fibroblasts העיקרי. אמנם יש כמה תכונות נפוצות מופעל על ידי inducers הזדקנות ביולוגית מגוונים, השתנות גדולה בפנוטיפ הזדקנות ביולוגית היא נצפתה ותלויים בגורמים שונים, כולל תא סוג, גירוי וזמן נקודה3,15, 16,17. זה הכרחי כדי לשקול את הטרוגניות עבור הלומדים והיעדים תאים senescent. לכן, פרוטוקול זה שואפת לספק סדרה של שיטות השתמשו כדי לגרום הזדקנות ביולוגית ב fibroblasts הראשי באמצעות טיפולים שונים. כמו זה תהיה מנומקת, השיטות בקלות ניתן להתאים סוגי תאים אחרים.

מלבד הזדקנות ביולוגית replicative, נתאר חמישה טיפולים בתדר הזדקנות ביולוגית אחרים: מייננת קרינה, קרינה אולטרה סגולה (UV), דוקסורוביצין, סטרס חמצוני, שינויים epigenetic (כלומר קידום של היסטון acetylation או דנ א demethylation) . גם, קרינה מייננת וגם קרינת UV לגרום נזק לדנ א ישיר ויפעיל, במינון המתאים, הזדקנות ביולוגית18,19. דוקסורוביצין גם גורם הזדקנות ביולוגית בעיקר באמצעות נזק לדנ א מאת intercalating לתוך ה-DNA, שיבוש טופואיזומראז II פונקציה, ובכך עצירת DNA תיקון מנגנונים20. הביטוי של גנים חיוניים עבור הזדקנות ביולוגית נשלטת בדרך כלל על-ידי acetylation היסטון מתילציה DNA. כתוצאה מכך, מעכבי deacetylase היסטון (למשל, butyrate נתרן, סאהה) וסוכני דנ א demethylating (למשל, 5-עזה) לעורר הזדקנות ביולוגית תאים נורמליים אחרת21,22.

בסופו של דבר, ארבעה סמנים הנפוצים ביותר קשורים לתאים senescent תהיה מנומקת: הפעילות של הזדקנות ביולוגית הקשורים-β-galactosidase (SA-β-גל), שיעור לסינתזת DNA על ידי עידו התאגדות assay, ביטוי של הרגולטורים מחזור התא, p16 מעכבי קינאז תלוי-cyclin p21, ואת ביטוי, הפרשת חברי SASP.

Protocol

1. כללי הכנה

  1. להכין D10 בינוני. תוספת DMEM בינוני-Glutamax עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (הריכוז הסופי: 100 U/mL).
  2. להכין PBS סטרילי. להמיס את הטבליות במים על פי הוראות היצרן. לחטא על ידי תא לחץ.
  3. להכין טריפסין x 1. לדלל 5 מ של טריפסין-Versene EDTA/10 x 10:1 ב- 45 מ של PBS סטרילי.
    הערה: לאורך כל הפרוטוקול, אנו משתמשים תא תרבות תנאים כי הם קרובים יותר פיזיולוגיים תנאים fibroblasts העיקרי. משמעות הדבר היא כי אנחנו דגירה תאים ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 הוא בדרך כלל סגור אבל באמצעות 5% O2 במקום 20% O "רגילה"2-
  4. להתמודד עם כל דוגמאות בתנאים סטריליים באמצעות תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.

2. אינדוקציה של הזדקנות ביולוגית

  1. הזדקנות ביולוגית replicative
    1. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו ') לעבוד בתנאים סטריליים, באמצעות שימוש תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    2. זרע 7 x 105 קיימא ראשית fibroblasts באוכלוסיה נמוכה הכפלה (PD) בבקבוקון T75 (~9.3 x 103 תאים/cm2) המכיל 10 מ"ל של D10.
    3. לצמוח התאים חממה תא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2 עד שיגיעו למפגש 70 – 80% (3-4 ימים עבור מתרבים תרבויות משטרת נמוך).
    4. לנתק את התאים באמצעות 3 מ"ל של 1 x טריפסין המקננת ~ 5 – 7 דקות חממה התרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2. נטר את התאים באופן קבוע עם מיקרוסקופ התרבות התא כדי לבדוק את תהליך התולש.
    5. כאשר תאים כדורית, לעצור את תגובת טריפסין על-ידי הוספת 9 מיליליטר D10. לא תדגור יותר מ 10 דקות
    6. לסובב את התאים ב x 300 גרם עבור תאים 5 דק יהוו גלולה בתחתית הצינורית, ואילו פסולת וחלקיקים קטנים יישארו ב- תגובת שיקוע.
    7. הסר את תגובת שיקוע, להמיס בגדר תא ב 1 מ"ל של D10 ולבצע ספירת תאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטית על פי הוראות היצרן או תא נויבאואר עבור ספירה ידנית. כשאנו סופרים, כוללים assay כדי לבדוק את הכדאיות של התאים (למשל, הדרה Trypan Blue23).
    8. לחשב המשטרה מצטבר באמצעות הנוסחה:
      משטרתחדש = 3.32* (LOG(cell number total)-(יומן (מספר תאים נזרע)) + PDold
      הנייד שלי סה כ = כל התאים ספרתי: מת וחי.
      . הנייד שלי נזרע = מספר התאים קיימא נזרע (8 x 105 תאים).
      משטרתבת = האוכלוסייה הכפלת ברגע של זריעה.
      משטרתחדש = האוכלוסייה הכפלת ברגע של סופר (לאחר דגירה).
      הערה: אם 7 x 105 ראשי fibroblasts (PD 35.2) היו נזרע על בקבוקון T-75, לאחר 4 ימים הם להגיע למפגש 80%, מתפצלים שוב, סופר עכשיו 1.3 x 106 תאים הכולל (מת + בחיים).
      משטרתחדש = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35.2
      משטרתחדש = 36.1
    9. Reseed 8 x 105 תאים T75 החדש, חוזר 2.1.2–2.1.8 צעדים.
      הערה: לאחר מספר קטעים רצופים, התרבות תארך זמן רב יותר כדי להגיע confluent עד תאים מפסיקים להתחלק בכלל. פעם תאים מפסיקים להתחלק, בדיקת סמנים הזדקנות ביולוגית ו/או הקציר עבור יישומים במורד הזרם.
    10. קח בחשבון כי לגודל גדול יותר של תאים senescent עלולה לגרום התרבות מופיעים מלא, ובכל זאת יש ספירת התאים נמוך. לפיכך, ניתן להניח הזדקנות ביולוגית כאשר המשטרה יציב, סמנים אחרים הזדקנות ביולוגית מופיעים בתרבות (ראו תקנות 3.1 – 3.5).
      הערה: השתמש מתרבים fibroblasts העיקרי הפקד.
  2. הזדקנות ביולוגית הנוצרות על-ידי קרינה מייננת
    1. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו '), לעבוד בתנאים סטריליים באמצעות תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    2. זרע 7 x 105 קיימא ראשית fibroblasts ב- PD נמוך בבקבוקון T75 (~9.3 x 103 תאים/cm2) המכיל 10 מ"ל של D10.
    3. דגירה התאים לילה בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    4. לחשוף את התאים עד 10 אפור של הקרנה גמא לפי ההוראות של המכונה בשימוש.
    5. האחות המדיום מתאי והחלף 10 מ"ל של D10.
    6. דגירה התאים 10 מ"ל של D10 ב חממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו 5% O2 רק בעוד 10 ימים מחליף המדיום באופן קבוע, כ כל 3 ימים.
    7. לאחר עשרה ימים, בודקים סמנים הזדקנות ביולוגית ו/או להשתמש התאים עבור יישומים במורד הזרם.
      הערה: השתמש מתרבים fibroblasts הראשי של המשטרה באותו (לפני הקרנה) כפקד.
  3. אולטרה סגול (UV) קרינה-Induced הזדקנות ביולוגית
    1. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו '), לעבוד בתנאים סטריליים באמצעות תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    2. זרע 1.5 – 2 x 105 קיימא ראשית fibroblasts ב משטרת נמוך באחד טוב של צלחת. ובכן 6 (1.5-2.0 x4 10 תאים/cm2), להוסיף 2 מיליליטר D10 בינוני.
    3. הכנס את התאים חממה התרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2 , לאפשר להם לדבוק הפלסטיק לפחות 5 שעות.
    4. . תוריד את המדיום מתאי מקם את הצלחת 6-ובכן באמצע החדר קרינת UV, להוריד את המכסה מפלסטיק. להאיר עם UVB, 20 – 30 mJ/cm2...
    5. להוסיף 2 מיליליטר בינוני לכל טוב.
    6. תקופת דגירה התאים 2 מיליליטר D10 ב חממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2 של עוד 7 ימים מחליף המדיום באופן קבוע, כ כל 3 ימים.
      הערה: לאחר 7 ימים, התאים יכולים להיות נבדק עבור סמני הזדקנות ביולוגית, עבור יישומים במורד הזרם. השתמש מתרבים fibroblasts הראשי של המשטרה באותו (לפני הקרנה) כפקד.
  4. דוקסורוביצין-induced הזדקנות ביולוגית
    1. להכין 1,000 x דוקסורוביצין פתרון מניות: להפוך מלאי מיקרומטר 250 של דוקסורוביצין ב- 1 x PBS, מסנן-לעקר את הפתרון ואת aliquot ב µL 500 למחזור סטרילי. חנות המניה דוקסורוביצין ב-80 מעלות צלזיוס.
    2. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו '), לעבוד בתנאים סטריליים באמצעות תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    3. זרע 7 x 105 קיימא ראשית fibroblasts ב- PD נמוך בבקבוקון T75 (~9.3 x 103 תאים/cm2) המכיל 10 מ"ל של D10.
    4. דגירה התאים לילה בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    5. לדלל 11 µL של 1,000 x דוקסורוביצין פתרון מניות ב 11 מיליליטר D10 כדי ריכוז הסופי של 250 ננומטר.
    6. האחות המדיום מתאי והחלף 10 מ"ל D10 + דוקסורוביצין.
    7. דגירה את התאים עבור בדיוק 24 שעות בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    8. האחות המדיום מתאי ולשטוף היטב פעם עם 10 מ"ל של D10.
    9. דגירה התאים 10 מ"ל של D10 עוד 6 ימים מחליף המדיום באופן קבוע, כ כל 3 ימים.
    10. יום 7, הבדיקה של הזדקנות ביולוגית סמני ו/או להשתמש עבור יישומים במורד הזרם.
      הערה: כפי שליטה, שימוש מתרבים fibroblasts הראשי של המשטרה באותו טיפול 24 שעות עם הרכב (PBS) 1:1,000 ב- D10.
  5. הזדקנות ביולוגית מפגינות חמצוני
    1. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו ') לעבוד בתנאים סטריליים באמצעות תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    2. זרע 7 x 105 קיימא ראשית fibroblasts ב- PD נמוך בבקבוקון T75 (~9.3 x 103 תאים/cm2) המכיל 10 מ"ל של D10.
    3. דגירה התאים לילה בחממה התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    4. להכין פתרון של ~ 200 μM מימן על-חמצני D10 בינוני על-ידי הוספת 22.6 μL של 30% חמצן ב 11 מיליליטר D10.
      הערה: לייעל את הטיפול עבור סוג התא של עניין על-ידי הפיכת עקומת מנה-תגובה להערכת רעילות.
    5. האחות המדיום מתאי ולהוסיף 10 מ ל שזה עתה הוכנו D10 בינוני + חמצן. תקופת דגירה של 2 h ב 37 ° C עם 5% CO2 ו 5% O2.
    6. האחות המדיום מתאי ולשטוף פעם עם טרי D10 ללא חמצן.
    7. להוסיף 10 מ של D10 ללא חמצן.
    8. תקופת דגירה של 48 ש ח בחודש חממה התרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    9. חזור על צעדים 2.5.4–2.5.8 פעמיים יותר עבור סכום כולל של שלושה טיפולים.
    10. בדוק אם סמנים הזדקנות ביולוגית או הקציר עבור יישומים במורד הזרם.
      הערה: כמו לשלוט, שימוש מתרבים תאים של המשטרה באותו שטופלו µL 22.6 סטרילי מים D10 כבר שעתיים.
  6. הזדקנות ביולוגית הנגרמת epigenetically
    1. להכין מלאי פתרונות עבודה molecule(s) קטנות לשימוש על פי טבלה 1. מסנן-לעקר הפתרונות. Aliquot צינורות סטרילי. חנות ב-20 ° C.
    2. תוך כדי טיפול תאים או כל חומר יהיה בקשר עם אותם (pipets, מבחנות, מדיה, וכו ') לעבוד בתנאים סטריליים, למשל, באמצעות שימוש תא למינארי, חלוק וכפפות. לשמור תאים ב- 20% O2 (תנאי החדר) רק תוך מטופל.
    3. זרע 7 x 105 קיימא ראשית fibroblasts ב- PD נמוך בבקבוקון T75 (~9.3 x 103 תאים/cm2) המכיל 10 מ"ל של D10.
    4. דגירה התאים לילה בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    5. היכונו mL 11 D10 בינוני + הפתרון עובד הטיפול הרצוי. דילול מדויק לכל טיפול ניתן לראות בטבלה1.
      1. להכין µL 11 של 1 מ מ סאהה הפתרון עובד ב 11 מיליליטר D10.
      2. להכין µL 44 של 1 מ' נתרן butyrate הפתרון עובד ב 11 מיליליטר D10.
      3. להכין µL 11 של 10 מ מ 5-עזה הפתרון עובד ב 11 מיליליטר D10.
        הערה: מטב הטיפולים עבור סוג התא עניין, למשל, ביצוע עיקול מנה-תגובה להערכת רעילות.
    6. להוסיף התרבות D10 בינוני + הפתרון עובד עבור הטיפול הרצוי.
    7. תקופת דגירה של 24 שעות ביממה בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    8. חזור על צעדים 2.6.4–2.6.6 פעמיים יותר, עבור סכום כולל של שלושה טיפולים.
    9. תחליף בינוני D10 פשוטה ללא סמים.
    10. לאחר 3 ימים נוספים, תאים להפוך senescent מוכן לבדיקה של הזדקנות ביולוגית סמני ויישומים במורד הזרם.
      הערה: כפי שליטה, שימוש מתרבים fibroblasts הראשי של המשטרה באותו מטופל במשך שלושה ימים עם D10 בינוני + רכב. D10 בינוני + הרכב צורך לרענן כל 24 שעות במהלך שלושת הימים האלה. הרכב תלוי הטיפול בשימוש: 1:1,000 דימתיל סולפוקסיד למים סטרילי סאהה ו 5-עזה 1:250 של נתרן Butyrate.

3. סמנים של הזדקנות ביולוגית

  1. הכנה
    1. להכין 20 מ"ג/מ"ל X-גל: לפזר 20 מ"ג X-גל ב 1 מ"ל של dimethylformamide או דימתיל סולפוקסיד. לאחסן ב-20 ° C מוגן מפני אור.
    2. הכנת 0.1 M חומצה ציטרית פתרון: להמיס g 2.1 monohydrate חומצה ציטרית ב- 100 מ ל מים. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    3. להכין הפתרון סודיום פוספט 0.2 מ': 2.84 להמיס g של סודיום פוספט dibasic או 3.56 גרם של סודיום פוספט dibasic מייבשים ב- 100 מ ל מים. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    4. להכין 0.2 מ' חומצת לימון/סודיום פוספט pH 6.0: להמיס 36.85 מ"ל של פתרון חומצה ציטרית 0.1 M ו- mL 63.15 של 0.2 מ' סודיום פוספט. התאם בדיוק ל pH 6.0. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    5. להכין ferrocyanide אשלגן 100 מ מ: להמיס 2.1 גרם אשלגן ferrocyanide ב 50 מ ל מים. לאחסן ב 4 ° C מוגן מפני אור.
    6. להכין ferricyanide אשלגן 100 מ מ: להמיס 1.7 g של אשלגן ferricyanide ב 50 מ ל מים. לאחסן ב 4 ° C מוגן מפני אור.
    7. להכין 5 מ' נתרן כלורי: להמיס 14.6 גר' נתרן כלוריד ב 50 מ ל מים. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    8. להכין 1 מ' מגנזיום כלוריד: להמיס 4.8 גרם מגנזיום כלוריד ב 50 מ ל מים. לאחסן בטמפרטורת החדר.
    9. להכין 2% פורמלדהיד + 0.2% גלוטראלדהיד ב- PBS: להמיס 800 µL של 25% גלוטראלדהיד, µL 12.5 פורמלין 16% בμl 100 ל- PBS. לאחסן בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
    10. להכין פתרון מוכתמים טריים על פי בטבלה 2.
  2. הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase מכתים
    1. עבור כל דגימה, זרע תאים4 עונה 1 פרק 10 אחד לפחות טוב של ובכן 24 צלחת (5.2 x3 10 תאים/cm2) המכיל µL 500 של D10 כך התאים הם דלילים. טיפולים (אם ישים) יכולה להתבצע ישירות על הצלחת הזו, או, לחלופין, תאים שטופלו כבר יכול להיות מחדש הזריעה לתוך צלחת 24-. טוב.
    2. דגירה התאים בן לילה ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    3. רחץ תאים פעמיים עם μL 500 ל- PBS.
    4. תיקון 3-5 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות μL 500/טוב של 2% פורמלדהיד + 0.2% גלוטראלדהיד ב- PBS.
    5. רחץ תאים פעמיים עם μL 500 ל- PBS.
    6. להכין טרי מכתימה את הפתרון, על פי מספר דוגמאות כתם.
    7. להוסיף פתרון מכתימים (500 µL טוב), לאטום את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע התאיידות.
      הערה: אידוי עשויה לגרום קריסטלים לטופס, לעכב את התצפית מתחת למיקרוסקופ.
    8. דגירה תאים בחושך (למשל יתעופף) ב- 37 מעלות צלזיוס חממה יבש (ללא CO2) עבור h 12-16.
      הערה: CO2 עלול להשפיע על רמת ה-pH ושנה ולכן התוצאות. סוגי תאים מסוימים עשויים לדרוש זמן דגירה קצרים יותר.
    9. לשטוף פעמיים עם μL 500 ל- PBS.
    10. להעריך את התוצאות. תאים חיוביים להציג כחולה (בעיקר) perinuclear מכתים במיקרוסקופ אור רגיל (איור 1 א').
    11. על כימות, לצפות לפחות מאה תאים עבור דגימה, לספור את מספר התאים חיובי. מאז תאים senescent לשנות צורה, לעתים קרובות קשה להגדיר את גבולות התא, לספור את התאים. Counterstain עם דאפי כדי להקל על ויזואליזציה, כימות של תאים בודדים (איור 1B). לכמת את הדגימות (אחוז של תאים חיוביים לעומת הסכום הכולל של תאים) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1C). צלם תמונות מרובות המדגם אותו כך בסופו של דבר אתה יכול לספור לפחות 100 חד-תאים להעריך את אחוז תאים חיוביים SA-β-גל אותם.
    12. להשוות בין התוצאות של תאים senescent לעומת שלהם הפקד המתאים לטיפול בשימוש.
      הערה: שיתוף מכתים עם עידו על הדגימה זהה אפשרי. קח בחשבון כי תאים צריך ואז להיות נזרע על coverslips.
  3. עידו התאגדות Assay
    1. הכניסו coverslip/באר צלחת 24-ובכן לפי מספר דוגמאות כדי להעריך.
    2. זרע עונה 1 פרק 104 תאים טוב אחד לפחות של צלחת 24-טוב (5.2 x3 10 תאים/cm2) לכל תנאי שמכילה µL 500 של D10 כך התאים הם דלילים. טיפולים (אם ישים) יכולה להתבצע ישירות על הצלחת הזו, או, לחלופין, תאים שטופלו כבר יכול להיות מחדש הזריעה לתוך צלחת 24-. טוב.
    3. דגירה התאים בן לילה ב 37 ° C עם 5% CO2 ו- 5% או2.
    4. להפוך את פתרון 20 מיקרומטר של עידו ב- D10 (1:250) על פי מספר דוגמאות לטיפול (250 μL עבור דגימה).
    5. להסיר חצי של המדיום (250 μL) מכל קידוח לטפל ולהחליף אותו עם D10 + עידו פתרון זה רק היה מוכן. ריכוז אדו הסופי הוא 10 מיקרומטר.
    6. דגירה 18 – 24 h בחממה תרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2 ו 5% O2. השתמש באותו זמן דגירה שליטה, תאים senescent.
    7. לשטוף 2 x עם μL 500 ל- PBS.
    8. לתקן את התאים עבור 10 דקות עם μL 500 פורמלין 4% ב- PBS.
    9. דגירה 5 דקות ב- 500 μL מ"מ טריס (pH 7.6).
    10. Permeabilize התאים 10 דקות ב- 500 μL של 0.1% X-100 Triton ב- PBS.
    11. רחץ 3 x עם PBS.
    12. היכונו μL 50 של תווית לערבב כל coverslip, הוספת הרכיבים לפי הסדר הבא: µL 44.45 ל- PBS, 0.5 µL של Cu (II) אז4, 0.05 µL של sulfo-Cy3-אזיד, 5 µL של נתרן-ascorbate.
    13. . שים μL 50 של המיקס תווית חתיכה של מצלמות-מיקרוסקופים הרם את coverslip בעזרת זוג מלקחיים, מחט, תן לזה לנוח. מעל התערובת תווית עם משטח המכילות את התאים פונה כלפי מטה. ודא כי ישנם אין בועות ו פני coverslip נוגעת המיקס תווית. תקופת דגירה של 30 דקות בחושך.
    14. להחזיר את התאים הבארות של צלחת 24-ובכן, לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS.
    15. לטעון עם טעינת מדיה (כולל דאפי להמחיש גרעינים) על גבי מדרון זכוכית ולתת להן להתייבש למשך הלילה.
    16. דמיינו את התאגדות EdU באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש במסנן המתאים Cy3 (עירור/פליטה: 552/570 ננומטר).
    17. צלם תמונות מרובות של התאים על כימות מאוחר יותר של תאים לפחות 100 לכל תנאי (Cy3 ודאפי).
    18. לכמת את אחוז תאים משולבים EdU באמצעות הנוסחה הבאה:
      תאים חיוביים אדו (%) = (ספירת התאים חיובי אדו (Cy3) / סה כ ספירת התאים (דאפי)) * 100
    19. להשוות בין התוצאות של תאים senescent לעומת שלהם הפקד המתאים לטיפול בשימוש.
      הערה: שיתוף מכתים עם SA-β-גל על הדגימה זהה אפשרי. קח בחשבון כי תאים צריך עדיין להיות נזרע על coverslips.
  4. ביטוי גנים של p16, p21 SASP
    1. להכין פריימר-סטים של גנים של הריבית (פריימר 50 מיקרומטר).
      הערה: qPCR של p16 p21, כמה גורמים SASP הרלוונטי הוא אינפורמטיבי של מצב הזדקנות ביולוגית. הפרוטוקול המתואר כאן גורם לשימוש של מערכת הספרייה בדיקה יוניברסל (UPL) כימות יחסית באמצעות PCR בזמן אמת. טבלה 3 מציג סקירה של תחל המשמש לצורך זיהוי של CDK מעכבי p16 ו- p21, מחברי SASP הרלוונטי ביותר, כמו גם עבור טובולין ואני אקטין, אשר לשמש גנים התייחסות עבור וזמינותו. העמודה האחרונה בטבלה 3 מגייס את החללית UPL מסוים שישמש עבור כל וזמינותו.
    2. להכין תערובת התגובה qPCR נפרד מבחני הרצוי. תמיד כוללים את הגן התייחסות גם על פי בטבלה 4.
    3. הפעל כל דוגמאות כפול או משולש.
    4. העומס 7.5 µL/טוב של המיקס תגובה qPCR על צלחת 384-. טוב.
    5. להוסיף ~ 5 ng של cDNA מומס µL 2.5 RNase ללא מים.
      הערה: עדיף לאכול כמויות דומות של cDNA עבור כל הדגימות לצורך השוואה. זו יכולה להיות מושגת באמצעות כמויות שוות של RNA עבור שעתוק לאחור.
    6. מכסה את הצלחת עם כלב ים, אוודא שזה יתבצע כהלכה כיסוי אחיד כל הבארות בצלחת.
    7. לסובב את הצלחת ב x 2,000 g עבור 1 דקות.
    8. הפעל את הצלחת ב Lightcycler 40 מחזורים באמצעות פרוטוקול הבאים:
      95 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות
      40 מחזורי 95 ° C עבור 5 s ו- 60 ° C ל 30 s
      37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה
    9. לניתוח של התוצאות, השתמש בשיטה תעצומ Livak ועמיתיו לנתח נתונים qPCR24. השתמש טובולין או אקטין כמו גנים התייחסות כדי לחשב את ΔCt ערך להשתמש את הפקד המתאים כדי לחשב הערך ΔΔCt לטיפול ספציפי בתדר הזדקנות ביולוגית.
  5. הפרשת IL6 וביטוי חלבונים
    1. זרע 5 – 10 x 10 תאים4 בבאר אחת לפחות של צלחת 6-טוב (5.2 – 10.5 x 103 תאים/cm2) לכל תנאי המכיל 2 מיליליטר D10. טיפולים (אם ישים) יכולה להתבצע ישירות על הצלחת הזו, או, לחלופין, תאים שטופלו כבר יכול להיות מחדש הזריעה לתוך צלחת 24-. טוב. . תן לה לעמוד בין לילה לאחר זריעה.
    2. להסיר את המדיום ולהחליף עבור 2 מ של DMEM בינונית ללא FBS. דגירה בתנאים נורמליים עבור 24 שעות.
    3. לאסוף את המדיום בשפופרת 15 מ"ל.
    4. צנטריפוגה המדגם-300 גרם x עבור 5 דק בינוני ניתן לאחסן ב- 80 ° C עד תטופל.
    5. בצע את הוראות היצרן כדי לבצע את אליסה.
    6. להשוות בין התוצאות של תאים senescent לעומת הפקד המתאים לטיפול ספציפי בתדר הזדקנות ביולוגית

תוצאות

העשרה של SA-β-גל מכתים ב senescent fibroblasts

Β-galactosidase (β-גל) הוא אנזים lysosomal זה מתבטא כל התאים וזה של ה-pH האופטימלי של25,4.026. עם זאת, במהלך הזדקנות ביולוגית, lysosomes להגביר את גודל ולצבור, כתוצאה מכך, תאי senescent β-גל. הכמויות מו?...

Discussion

הפרוטוקולים המוסברת אופטימציה להצגה fibroblasts העיקרי אנושית, במיוחד BJ ותאי WI-38. הפרוטוקולים עבור הזדקנות ביולוגית replicative, קרינה מייננת, דוקסורוביצין, הוחלו בהצלחה על סוגים אחרים של fibroblasts (HCA2 ו- IMR90), סוגי תאים אחרים (כלומר neonatal מלנוציטים ו keratinocytes או cardiomyocytes נגזר iPSC) במעבדה שלנו. עם זאת, ניתן למט?...

Disclosures

N/A

Acknowledgements

אנו מודים חברי המעבדה Demaria דיונים פוריים, ואת Thijmen van Vliet לשיתוף נתונים, פרוטוקול על הזדקנות ביולוגית UV-induced.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM Media - GlutaMAXGibco31966-047
Fetal Bovine SerumHycloneSV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml)LonzaDE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichSC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)AmbionAM9937
T75 flaskSarstedt833911002
Trypsin/EDTA SolutionLonzaCC-5012
PBS tabletsGibco18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubesSigma-AldrichT9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubesSigma-AldrichCLS430791
6-well plateSarstedt83.3920
24-well plateSarstedt83.3922
13mm round coverslipsSarstedt83.1840.002
SteriflipMerck ChemicalsSCGP00525
Cesium137-sourceIBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamberOpsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride BioAustralis Fine ChemicalsBIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solutionSigma-Aldrich7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidineSigma-AldrichA3656
SAHASigma-AldrichSML0061
Sodium Butyrate Sigma-AldrichB5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)Fisher Scientific7240-90-6
Citric acid monohydrateSigma-Aldrich5949-29-1
Sodium dibasic phosphateAcros organics7782-85-6
Potassium ferrocyanide Fisher Scientific14459-95-1
Potassium ferricyanideFisher Scientific13746-66-2
Sodium ChlorideMerck Millipore7647-14-5
Magnesium ChlorideFisher Chemicals7791-18-6
25% glutaraldehydeFisher Scientific111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v)Thermo-Fisher Scientific28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)Lumiprobe10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide)LumiprobeD1330
Sodium ascorbateSigma-AldrichA4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O)Sigma-Aldrich209198
Triton X-100Acros organics215682500
TRIS baseRoche11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white Roche4729749001
Lightcycler 480 sealing foil Roche4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit BiolineBIO-84020
UPL Probe LibrarySigma-AldrichVarious
Human IL-6 DuoSet ELISAR&DD6050
Bio-Rad TC20Bio-Rad
Counting slidesBio-Rad145-0017
Dry incubatorThermo-Fisher ScientificHeratherm
DimethylformamideMerck Millipore1.10983
Parafilm 'M' laboratory filmBemis #PM992
Tweezers
Needles

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136genotoxic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved