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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier diskutieren wir eine Reihe von Protokollen für die Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in kultivierten Zellen. Wir konzentrieren uns auf unterschiedlichen Seneszenz-induzierende Stimuli und beschreiben die Quantifizierung der gemeinsamen Seneszenz-assoziierten Marker. Wir bieten technische Details mit Fibroblasten als Modell, aber die Protokolle können verschiedene zelluläre Modelle angepasst werden.

Zusammenfassung

Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des permanenten Zellzyklus Festnahme in Reaktion auf verschiedene schädliche Reize aktiviert. Aktivierung der zellulären Seneszenz ist ein Markenzeichen von diversen pathophysiologischen Bedingungen auch den Tumor Unterdrückung, Gewebe, Umbau und Alterung. Die Induktoren der zellulären Seneszenz in Vivo zeichnen sich nach wie vor schlecht. Eine Reihe von Reizen kann jedoch verwendet werden, Förderung der zellulären Seneszenz ex Vivo. Darunter sind die häufigsten Seneszenz-Induktoren replikativen Erschöpfung, ionisierender und nichtionisierender Strahlung, genotoxisch Drogen, oxidativen Stress und demethylating und acetylieren Agenten. Hier bieten wir detaillierte Anweisungen zur Verwendung dieser Reize, um Fibroblasten in Seneszenz zu induzieren. Dieses Protokoll kann problemlos für verschiedene Arten von Primärzellen und Zelllinien, einschließlich Krebszellen angepasst werden. Wir beschreiben auch verschiedene Methoden für die Validierung der Seneszenz Induktion. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Messung der Aktivität des lysosomalen Enzyms Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-gal), die Rate der DNA-Synthese mit 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine (EdU) Einbeziehung Assay, die Höhe der Expression des Zellzyklus Inhibitoren p16 p21, und der Ausdruck und Sekretion von Mitgliedern der Senescence-Associated sekretorischen Phänotyp (SASP). Endlich, wir bieten Beispielergebnisse und besprechen weitere Anwendungen dieser Protokolle.

Einleitung

Im Jahr 1961 berichtet Hayflick und Moorhead, dass primäre Fibroblasten in Kultur ihr proliferative Potential nach aufeinanderfolgenden Passagen1zu verlieren. Dieser Prozess wird durch die fortlaufende Verkürzung der Telomere nach jeder Zellteilung verursacht. Wenn die Telomere eine kritisch kurze Länge erreichen, sie sind anerkannt durch die DNA-Schäden-Antwort (DDR), die eine irreversible Verhaftung der Proliferation aktiviert – auch als replikative Seneszenz definiert. Replikative Seneszenz ist derzeit eines der vielen Reize, die bekannt sind, um einen Zustand der permanenten Zellzyklus Festnahme zu induzieren, die Zellen unempfindlich auf Mitogene und Apoptotic Signale2,3 macht. Die Seneszenz-Programm zeichnet sich normalerweise durch zusätzliche Eigenschaften einschließlich lysosomale hochaktiver, mitochondriale Dysfunktion, nukleare Änderungen, Chromatin Umgestaltungen, endoplasmatische Retikulum Stress, DNA-Schäden und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP)3,4. Alternde Zellen haben mehrere Funktionen im Körper: Entwicklung, Wunde heilen und Tumor Unterdrückung2. Ebenso sind sie bekannt, eine wichtige Rolle im Altern und paradoxerweise im Tumor Progression5. Die negativen und teilweise widersprüchlichen Auswirkungen der Seneszenz werden oft die SASP6zugeschrieben.

Vor kurzem zeigte sich, dass die Beseitigung der alternde Zellen von Mäusen zur Lebensdauerverlängerung und zur Beseitigung vieler der Alterung Funktionen7,8,9,10,11, führt 12. auf die gleiche Weise wurden mehrere Medikamente entwickelt, alternde Zellen (Senolytics) entweder zu beseitigen oder die SASP13,14Zielen. Das therapeutische Potenzial von Anti-Aging hat vor kurzem mehr Aufmerksamkeit auf das Feld angezogen.

Die Untersuchung der Mechanismen, die zelluläre Seneszenz zugeordnet und die Vorführungen für pharmakologische Interventionen angewiesen auf ex-Vivo -Modelle, vor allem auf menschliche primäre Fibroblasten. Zwar gibt es einige gemeinsame Merkmale, die durch vielfältige Seneszenz Induktoren aktiviert, ist eine große Variabilität in der Seneszenz Phänotyp beobachteten und abhängig von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Zelle Art, Impuls und Zeit Punkt3,15, 16,17. Es ist zwingend notwendig, um die Heterogenität für Studium und targeting seneszenten Zellen betrachten. Dieses Protokoll soll daher eine Reihe von Methoden zur Seneszenz in primäre Fibroblasten zu induzieren, indem mit verschiedenen Behandlungen zu bieten. Wie es erklärt wird, können die Methoden leicht zu anderen Zelltypen angepasst werden.

Abgesehen von replikative Seneszenz, beschreiben wir fünf Seneszenz-induzierende Behandlungen: ionisierende Strahlung, ultraviolettes (UV) Strahlung, Doxorubicin, oxidativer Stress und epigenetische Veränderungen (nämlich die Förderung von Histon Acetylierung oder DNA Demethylierung) . Ionisierende Strahlung sowohl UV-Bestrahlung direkte DNA-Schäden verursachen, und bei der entsprechenden Dosis auslösen Seneszenz18,19. Doxorubicin verursacht auch Seneszenz hauptsächlich durch DNA-Schäden durch verschuppen in die DNA und Topoisomerase-II-Funktion zu stören und damit stoppen DNA Reparatur Mechanismen20. Die Expression von Genen für Seneszenz wird normalerweise von Histon Acetylierung und DNA-Methylierung gesteuert. Folglich auslösen Histon-Deacetylase-Hemmer (z.B.Natrium-Butyrat und SAHA) und DNA-demethylating (z. B. 5-Aza) Agenten Seneszenz sonst normalen Zellen21,22.

Zu guter letzt vier der am häufigsten verwendeten Marker, die alternde Zellen erläutert werden: Aktivität der Seneszenz verbunden-β-Galaktosidase (SA-β-gal), Rate der DNA-Synthese durch EdU Einbeziehung Assay, Überexpression von den Regulatoren des Zellzyklus und Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitoren p16 p21, Überexpression und und Sekretion von Mitgliedern der SASP.

Protokoll

1. allgemeine Vorbereitung

  1. D10 Medium vorzubereiten. Ergänzung vom Medium-Glutamax DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin (Endkonzentration: 100 U/mL).
  2. Bereiten Sie sterile PBS. Lösen sich die Tabletten in Wasser nach Angaben des Herstellers. Von Autoklaven sterilisieren.
  3. 1 X Trypsin vorzubereiten. Verdünnen Sie 5 mL Trypsin-Versene EDTA/10 x 01:10 in 45 mL sterile PBS.
    Hinweis: Im gesamten Protokoll, wir verwenden Zelle Kulturbedingungen, die näher an den physiologischen Bedingungen für primäre Fibroblasten. Dies bedeutet, dass wir Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 brüten, wie normalerweise getan sondern mit 5 % O2 statt der "standard" 20 % O ist2.
  4. Behandeln Sie alle Proben unter sterilen Bedingungen unter Verwendung eines Laminar-Flow-Haube, Kittel und Handschuhe. Halten Sie Zellen um 20 % O2 (Raumbedingungen) nur beim behandelt.

(2) Induktion von Seneszenz

  1. Replikative Seneszenz
    1. Beim Umgang mit Zellen oder jegliches Material, das mit ihnen in Kontakt sein wird (mehrkanalpipette, Fläschchen, Medien, etc.) arbeiten unter sterilen Bedingungen mit einer Laminar-Flow-Haube, Kittel und Handschuhe. Halten Sie Zellen um 20 % O2 (Raumbedingungen) nur beim behandelt.
    2. Samen 7 x 105 tragfähige primäre Fibroblasten in eine geringe Bevölkerungsdichte (PD) in einem T75 Kolben (~9.3 X 103 Zellen/cm2) mit 10 mL der D10 zu verdoppeln.
    3. Wachsen Sie die Zellen in einer Zelle Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2 , bis sie 70 – 80 % Zusammenfluss (3 – 4 Tage für wuchernden Kulturen in einem niedrigen PD) erreichen.
    4. Lösen Sie die Zellen mit 3 mL 1 x Trypsin und Inkubation für ~ 5 – 7 min. in einem Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2. Kontrollieren Sie regelmäßig die Zellen mit einer Zelle Kultur Mikroskop trennen Prozess überprüfen.
    5. Wenn Zellen kugelförmig sind, stoppen Sie die Trypsin-Reaktion durch Zugabe von 9 mL D10. Nicht länger als 10 min inkubieren.
    6. Drehen Sie die Zellen bei 300 X g , für mind. 5 Zellen einen Pellet am Boden des Röhrchens, bilden Schutt und kleinere Partikel bleiben im überstand.
    7. Entfernen des Überstands und Auflösen der Zelle Pellet in 1 mL der D10 und eine Zellzahl mit einem automatisierten Zelle Zähler nach Angaben des Herstellers oder einer Neubauer-Kammer für die manuelle Zählung durchführen. Gehören Sie beim zählen einen Test um zu überprüfen, die Lebensfähigkeit der Zellen (z.B. Trypan blau Ausgrenzung23).
    8. Berechnen Sie die kumulative PD mit dieser Formel:
      PDneue = 3.32* (LOG(cell number total)-(LOG (Handynummer ausgesät)) + PDold
      Zellenzahl total = alle Zellen gezählt: tot oder lebendig.
      Zellenzahl ausgesät = Anzahl der lebensfähigen Zellen ausgesät (8 x 105 ).
      PD-alt = Bevölkerung, die zum Zeitpunkt der Aussaat zu verdoppeln.
      PDneue = Bevölkerung, die zum Zeitpunkt der Zählung (nach der Inkubation) verdoppelt.
      Hinweis: Wenn 7 x 105 primäre Fibroblasten (PD 35,2) auf einem T-75 Kolben ausgesät wurden und nach 4 Tagen sie erreichen 80 % Zusammenfluss und wieder aufgeteilt sind, zählen jetzt 1,3 x 106 total Zellen (tot + lebendig).
      PDneue 3.32* = (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35,2
      PDneue = 36,1
    9. Reseed 8 x 105 Zellen in einer neuen T75, wiederholen Schritte 2.1.2–2.1.8.
      Hinweis: Nach mehreren aufeinander folgenden Passagen, die Kultur dauert länger, konfluierende bekommen bis Zellen stoppen an allen Teilen. Wenn Zellen nicht teilen mehr, testen für Seneszenz Marker und/oder Ernte für downstream-Anwendungen.
    10. Beachten Sie, dass die größere Größe der alternde Zellen verursachen die Kultur erscheinen voller und haben noch eine niedrige Zellzahl. So, Seneszenz auszugehen, wenn die PD stabil ist und andere Seneszenz Marker in der Kultur erscheinen (siehe Protokolle 3.1 bis 3.5).
      Hinweis: Verwenden Sie wuchernde primäre Fibroblasten als Kontrolle.
  2. Ionisierende Strahlung ausgelöste Seneszenz
    1. Arbeiten Sie beim Umgang mit Zellen oder jegliches Material, das in Kontakt mit ihnen (mehrkanalpipette, Fläschchen, Medien, etc.) werden unter sterilen Bedingungen mit einer Laminar-Flow-Haube, Kittel und Handschuhe. Halten Sie Zellen um 20 % O2 (Raumbedingungen) nur beim behandelt.
    2. Samen 7 x 105 tragfähige primäre Fibroblasten in eine niedrige PD in ein Auffanggefäß T75 (~9.3 X 103 Zellen/cm2) mit 10 mL der D10.
    3. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2.
    4. Setzen Sie die Zellen 10 grau von Gamma-Bestrahlung gemäß den Anweisungen der Maschine im Einsatz.
    5. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen und ersetzen Sie mit 10 mL der D10.
    6. Inkubieren Sie die Zellen in 10 mL D10 in eine Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2 für weitere 10 Tage ersetzt das Medium regelmäßig, etwa alle 3 Tage.
    7. Nach 10 Tagen testen für Seneszenz Marker bzw. die Zellen für downstream-Anwendungen verwenden.
      Hinweis: Verwenden Sie wuchernde primäre Fibroblasten der gleichen PD (vor Bestrahlung) als Kontrolle.
  3. Ultraviolett (UV) ausgelöste Strahlung Seneszenz
    1. Arbeiten Sie beim Umgang mit Zellen oder jegliches Material, das in Kontakt mit ihnen (mehrkanalpipette, Fläschchen, Medien, etc.) werden unter sterilen Bedingungen mit einer Laminar-Flow-Haube, Kittel und Handschuhe. Halten Sie Zellen um 20 % O2 (Raumbedingungen) nur beim behandelt.
    2. Samen 1,5 – 2 x 105 tragfähige primäre Fibroblasten in eine niedrige PD in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte (1,5 – 2,0 x 104 Zellen/cm2), hinzugeben 2 mL D10 Medium.
    3. Legen Sie die Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2 und lassen Sie sich zur Einhaltung der Kunststoffs für mindestens 5 h.
    4. Nehmen Sie das Medium aus den Zellen. Platz 6-Well-Platte in der Mitte der UV-Bestrahlung-Kammer und der Kunststoff-Deckel abnehmen. Bestrahlen Sie mit UVB, 20-30 mJ/cm2.
    5. 2 mL Medium pro Bohrloch hinzugeben.
    6. Inkubieren Sie die Zellen in 2 mL D10 in eine Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2 für weitere 7 Tage ersetzt das Medium regelmäßig, etwa alle 3 Tage.
      Hinweis: Nach 7 Tagen Zellen können für Seneszenz Marker getestet und für downstream-Anwendungen verwendet. Verwenden Sie wuchernde primäre Fibroblasten der gleichen PD (vor Bestrahlung) als Kontrolle.
  4. Doxorubicin-induzierte Seneszenz
    1. 1.000 x Doxorubicin-Stammlösung vorbereiten: machen Sie einen 250 µM bestand von Doxorubicin in 1 X PBS, Filter-Sterilisieren Sie die Lösung und Aliquot in 500 µL pro steriles Röhrchen. Speichern Sie den Doxorubicin bestand bei-80 ° C.
    2. Arbeiten Sie beim Umgang mit Zellen oder jegliches Material, das in Kontakt mit ihnen (mehrkanalpipette, Fläschchen, Medien, etc.) werden unter sterilen Bedingungen mit einer Laminar-Flow-Haube, Kittel und Handschuhe. Halten Sie Zellen um 20 % O2 (Raumbedingungen) nur beim behandelt.
    3. Samen 7 x 105 tragfähige primäre Fibroblasten in eine niedrige PD in ein Auffanggefäß T75 (~9.3 X 103 Zellen/cm2) mit 10 mL der D10.
    4. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2.
    5. Verdünnen Sie 11 µL der 1.000 x Doxorubicin-Stammlösung in 11 mL D10, eine Endkonzentration von 250 nM.
    6. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen und ersetzen Sie mit 10 mL der D10 + Doxorubicin.
    7. Inkubieren Sie die Zellen genau 24 Stunden in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2.
    8. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen und waschen Sie sorgfältig einmal mit 10 mL der D10.
    9. Inkubieren Sie die Zellen in 10 mL D10 für weitere 6 Tage ersetzt das Medium regelmäßig, etwa alle 3 Tage.
    10. Am 7. Tag test für Seneszenz Markierungen und/oder für downstream-Anwendungen verwenden.
      Hinweis: als Kontrolle, Verwendung wuchernden primäre Fibroblasten der gleichen PD für 24 h mit 1:1,000 Fahrzeug (PBS) in D10 behandelt.
  5. Oxidativer Stress-induzierte Seneszenz
    1. Beim Umgang mit Zellen oder jegliches Material, das mit ihnen in Kontakt sein wird (mehrkanalpipette, Fläschchen, Medien, etc.) arbeiten unter sterilen Bedingungen mit einer Laminar-Flow-Haube, Kittel und Handschuhe. Halten Sie Zellen um 20 % O2 (Raumbedingungen) nur beim behandelt.
    2. Samen 7 x 105 tragfähige primäre Fibroblasten in eine niedrige PD in ein Auffanggefäß T75 (~9.3 X 103 Zellen/cm2) mit 10 mL der D10.
    3. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einer Zelle Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2.
    4. Bereiten Sie eine Lösung von ~ 200 μM Wasserstoffperoxid in D10 Medium, durch das Hinzufügen von 22,6 μL 30 % Wasserstoffperoxid in 11 mL D10.
      Hinweis: Optimieren Sie die Behandlung für den Typ von Interesse indem man eine Dosis-Wirkungs-Kurve, Toxizität zu bewerten.
    5. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen und 10 mL das frisch zubereitete D10 mittlere + Wasserstoffperoxid. 2 h bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2inkubieren.
    6. Das Medium aus den Zellen abgesaugt und einmal mit frischen D10 ohne Wasserstoffperoxid waschen.
    7. 10 mL D10 ohne Wasserstoffperoxid hinzufügen.
    8. 48 Stunden in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2inkubieren.
    9. Wiederholen diesen Sie Schritte 2.5.4–2.5.8 zwei Mal für insgesamt drei Behandlungen.
    10. Suchen Sie nach Seneszenz Marker oder Ernte für downstream-Anwendungen.
      Hinweis: Wie Steuern, Nutzung proliferierender Zellen der gleichen PD mit 22,6 µL steriles Wasser in D10 für 2 h behandelt.
  6. Epigenetisch-induzierte Seneszenz
    1. Bereiten Sie Lager und funktionierende Lösungen für die kleinen Schutzmechanismus gemäß Tabelle 1. Sterilisieren Sie Filter-die Lösungen. Aliquot in sterilen Röhrchen. Shop bei-20 ° C.
    2. Beim Umgang mit Zellen oder jegliches Material, das mit ihnen in Kontakt sein wird (mehrkanalpipette, Fläschchen, Medien, etc.) arbeiten unter sterilen Bedingungen, beispielsweise durch die Verwendung einer Laminar-Flow-Haube, Kittel und Handschuhe. Halten Sie Zellen um 20 % O2 (Raumbedingungen) nur beim behandelt.
    3. Samen 7 x 105 tragfähige primäre Fibroblasten in eine niedrige PD in ein Auffanggefäß T75 (~9.3 X 103 Zellen/cm2) mit 10 mL der D10.
    4. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2.
    5. 11 mL D10 Medium + funktionierende Lösung für die gewünschte Behandlung vorzubereiten. Die exakte Verdünnung pro Behandlung ist in Tabelle 1ersichtlich.
      1. Bereiten Sie 11 µL 1 mM SAHA Arbeitslösung in 11 mL D10.
      2. Bereiten Sie 44 µL 1 M Natrium Butyrat Arbeitslösung in 11 mL D10.
      3. Bereiten Sie 11 µL 10 mM 5-Aza-Arbeitslösung in 11 mL D10.
        Hinweis: Optimieren Sie die Behandlungen für die Zelle Art von Interesse, zum Beispiel, machen eine Dosis-Wirkungs-Kurve, Toxizität zu bewerten.
    6. Die Kultur D10 Medium + funktionierende Lösung für die gewünschte Behandlung hinzufügen.
    7. 24 h in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2inkubieren.
    8. Wiederholen diesen Sie Schritte 2.6.4–2.6.6 zweimal, für insgesamt drei Behandlungen.
    9. Verändern Sie Medium für einfache D10 ohne Droge.
    10. Nach 3 Tagen mehr werden die Zellen alternde und zum Testen von Seneszenz Markern und downstream-Anwendungen bereit.
      Hinweis: als Kontrolle, Verwendung wuchernden primäre Fibroblasten der gleichen PD für drei Tage mit D10 mittlere + Fahrzeug behandelt. Die D10 mittlere + Fahrzeug muss aktualisiert alle 24 h während dieser drei Tage werden. Das Fahrzeug richtet sich nach der Behandlung verwendet: 1:1,000 DMSO für SAHA und 5-Aza und 1: 250 Sterilwasser für Natrium Butyrat.

3. Markierungen der Seneszenz

  1. Vorbereitung
    1. 20 mg/mL X-gal vorbereiten: 20 mg X-gal in 1 mL Dimethylformamid oder DMSO auflösen. Bei-20 ° C, vor Licht geschützt aufbewahren.
    2. Bereiten Sie 0.1 M Zitronensäurelösung: 2,1 g Zitronensäure-Monohydrat in 100 mL Wasser auflösen. Bei Raumtemperatur lagern.
    3. 0,2 M Natriumphosphat Lösung vorbereiten: in 100 mL Wasser auflösen 2,84 g Diabas-Natriumphosphat oder 3,56 g Diabas-Natriumphosphat zu entwässern. Bei Raumtemperatur lagern.
    4. Bereiten Sie 0,2 M Zitronensäure/Natrium Phosphat pH 6.0: 36,85 mL 0.1 M Zitronensäure-Lösung und 63,15 mL 0,2 M Natriumphosphat auflösen. Passen Sie genau auf pH 6.0. Bei Raumtemperatur lagern.
    5. 100 mM Kaliumferrocyanid vorbereiten: 2,1 g Kaliumferrocyanid in 50 mL Wasser auflösen. Bei 4 ° C, vor Licht geschützt aufbewahren.
    6. 100 mM Kalium ferricyanid vorbereiten: 1,7 g Kalium ferricyanid in 50 mL Wasser auflösen. Bei 4 ° C, vor Licht geschützt aufbewahren.
    7. 5 M Natriumchlorid vorbereiten: 14,6 g Natriumchlorid in 50 mL Wasser auflösen. Bei Raumtemperatur lagern.
    8. Bereiten Sie 1 M Magnesiumchlorid: 4,8 g Magnesiumchlorid in 50 mL Wasser auflösen. Bei Raumtemperatur lagern.
    9. Bereiten Sie 2 % Formaldehyd + 0,2 % Glutaraldehyd in PBS: Auflösung 800 µL 25 % Glutaraldehyd und 12,5 µL von 16 % Formaldehyd in 100 μl PBS. Bei Raumtemperatur vor Licht geschützt aufbewahren.
    10. Vorbereiten der Färbelösung frischer nach Tabelle 2.
  2. Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase Färbung
    1. Samen Sie für jede Probe 1 x 104 Zellen in mindestens einem gut von einer 24-Well-Platte (5.2 x 103 Zellen/cm2) mit 500 µL der D10, dass die Zellen spärlich sind. Behandlungen (falls zutreffend) direkt auf diese Platte ausgeführt werden können, oder Alternativ können Zellen bereits behandelt in einer 24-Well-Platte wieder ausgesät werden.
    2. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2.
    3. Waschen Sie Zellen mit 500 μl PBS.
    4. 3 – 5 min bei Raumtemperatur mit 500 μL/gut 2 % Formaldehyd + 0,2 % Glutaraldehyd in PBS zu beheben.
    5. Waschen Sie Zellen mit 500 μl PBS.
    6. Bereiten Sie frische Färbelösung, entsprechend der Anzahl der Proben zu beflecken.
    7. Färbelösung (500 µL/Well) hinzufügen und die Dichtplatte mit Parafilm um Verdunstung zu vermeiden.
      Hinweis: Verdunstung kann dazu führen, dass Kristalle zu bilden und behindern die Beobachtung unter dem Mikroskop.
    8. Inkubieren Sie Zellen im Dunkeln (z.B. mit Alufolie bedeckt) bei 37 ° C in einem trockenen Inkubator (ohne CO2) für 12 – 16 Uhr.
      Hinweis: CO2 kann den pH-Wert beeinflussen und daher die Ergebnisse ändern. Einige Zelltypen erfordern kürzere Inkubationszeiten.
    9. Waschen Sie zwei Mal mit 500 μl PBS.
    10. Bewertung der Ergebnisse. Positive Zellen präsentieren eine blaue (meistens) perinukleäre Färbung unter einem normalen Lichtmikroskop (Abbildung 1A).
    11. Für die Quantifizierung mindestens 100 Zellen pro Probe zu beobachten und die Anzahl der positiven Zellen. Da alternde Zellen Form ändern, ist es oft schwierig, die Zellengrenzen zu definieren und um die Zellen zu zählen. Gegenfärbung mit DAPI, Visualisierung und Quantifizierung einzelner Zellen (Abbildung 1 b) zu erleichtern. Quantifizieren der Proben (Prozentsatz der positiven Zellen im Vergleich zu Gesamtbetrag der Zellen) mit einem Fluoreszenz-Mikroskop (Abbildung 1). Nehmen Sie mehrere Bilder mit derselben Probe, so dass am Ende können Sie mindestens 100 Einzel-Zellen zu zählen und den Anteil der SA-β-gal positive Zellen in ihnen zu bewerten.
    12. Vergleichen Sie die Ergebnisse der alternde Zellen im Vergleich zu ihrer entsprechenden Kontrolle für die Behandlung verwendet.
      Hinweis: Eine Co-Färbung mit EdU an derselben Probe ist möglich. Der Auffassung, dass die Zellen dann auf Deckgläsern gesät werden sollte.
  3. EdU-Aufnahme-Test
    1. Legen Sie eine Deckglas/gut in einer 24-Well-Platte nach der Anzahl der Proben zu beurteilen.
    2. 1 x 104 Samenzellen in mindestens einem gut von einer 24-Well-Platte (5.2 x 103 Zellen/cm2) pro Zustand mit 500 µL D10, sodass die Zellen spärlich sind. Behandlungen (falls zutreffend) direkt auf diese Platte ausgeführt werden können, oder Alternativ können bereits behandelte Zellen in einer 24-Well-Platte wieder ausgesät werden.
    3. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO2 und 5 % O2.
    4. Machen Sie eine 20 µM-Lösung der EdU in D10 (1: 250) nach der Anzahl der Proben (250 μl pro Probe) zu behandeln.
    5. Entfernen Sie die Hälfte des Mediums (250 μl) aus jeder gut zu behandeln und ersetzen Sie es mit dem D10 + EdU-Lösung, die nur bereit war. EdU-Endkonzentration ist 10 µM.
    6. Inkubieren Sie 18 – 24 h in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 % und 5 % O2. Verwenden Sie die gleichen Inkubationszeit bei Kontrolle und alternde Zellen.
    7. Waschen Sie 2 X mit 500 μl PBS.
    8. Befestigen Sie die Zellen für 10 min mit 500 μL von 4 % Formaldehyd in PBS.
    9. Inkubieren Sie 5 min in 500 μl 100 mm Tris (pH 7.6).
    10. Permeabilize der Zellen für 10 min in 500 μl von 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer.
    11. Waschen Sie 3 X mit PBS.
    12. Bereiten Sie 50 μL des Label-Mix für jedes Deckglas, indem die Komponenten in folgender Reihenfolge: 44.45 µL PBS, 0,5 µL des Cu (II) SO4, 0,05 µL Sulfo-Cy3-azid, 5 µL des Natrium-Ascorbat.
    13. Ein Stück Parafilm 50 μL des Label-Mix aufsetzen. Das Deckglas mit Hilfe von ein paar Pinzette und eine Nadel heben und mit der Oberfläche der Zellen nach unten auf dem Label Mix, ruhen lassen. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen und, dass die gesamte Oberfläche des das Deckglas den Label-Mix berührt. 30 Minuten im Dunkeln inkubieren.
    14. Habe die Zellen wieder in den Vertiefungen der 24-Well-Platte und dreimal mit PBS waschen.
    15. Montieren Sie mit Montage Medien (einschließlich DAPI um Kerne zu visualisieren) auf Objektträger und über Nacht trocknen lassen.
    16. Die EdU-Aufnahme mit einem Fluoreszenz-Mikroskop zu visualisieren. Verwenden Sie einen Filter für Cy3 geeignet (Anregung/Emission: 552/570 nm).
    17. Nehmen Sie mehrere Bilder der Zellen für die späteren Quantifizierung von mindestens 100 Zellen pro Zustand (Cy3 und DAPI).
    18. Quantifizieren Sie den Anteil der Zellen, die EdU aufgenommen mithilfe der folgenden Formel:
      EdU-positiven Zellen (%) = (Anzahl der EdU-positiven Zellen (Cy3) / total Zellzahl (DAPI)) * 100
    19. Vergleichen Sie die Ergebnisse der alternde Zellen im Vergleich zu ihrer entsprechenden Kontrolle für die Behandlung verwendet.
      Hinweis: Eine Co-Färbung mit SA-β-gal an derselben Probe ist möglich. Der Auffassung, dass die Zellen noch auf Deckgläsern gesät werden sollte.
  4. Genexpression von p16, p21 und SASP
    1. Primer-Sets von Gene of Interest (50 µM Primer) vorzubereiten.
      Hinweis: Ein qPCR p16, p21 und einige Einflussfaktoren SASP ist informativ über den Status der Seneszenz. Das Protokoll beschrieben hier macht des Universal Sonde Bibliothek (UPL) Systems für relative Quantifizierung mit Hilfe einer Echtzeit-PCR verwenden. Tabelle 3 zeigt eine Übersicht über die Primer verwendet für die Erkennung der CDK-Inhibitoren p16 und p21 und Mitglied der relevantesten SASP, sowie für Tubulin und Aktin, dienen als Referenz-Gene für den Assay. Die letzte Spalte der Tabelle 3 wirbt die besondere UPL-Sonde für jedes Assay verwendet werden.
    2. Die gewünschte Assays separate qPCR Reaktion Mischung vorbereiten. Schließen Sie immer die Referenz-gen sowie gemäß Tabelle 4.
    3. Alle Beispiele in doppelt oder dreifach ausführen.
    4. 7.5 µL/Well des qPCR-Reaktion-Mix auf ein 384-Well-Platte zu laden.
    5. Fügen Sie ~ 5 ng cDNA in 2,5 µL RNase-freies Wasser aufgelöst.
      Hinweis: Es ist vorzuziehen, haben ähnliche Mengen von cDNA für alle Proben verglichen werden. Dies kann erreicht werden, indem Sie gleiche Mengen von RNA für der reversen Transkription verwenden.
    6. Die Abdeckplatte mit einem Siegel und stellen Sie sicher, dass es klebt richtig Abdeckung gleichmäßig alle Brunnen auf dem Teller.
    7. Drehen Sie die Platte bei 2.000 X g für 1 min.
    8. Führen Sie die Platte in der Lightcycler für 40 Zyklen mit Folgendes Protokoll:
      95 ° C für 7 min
      40 Zyklen von 95 ° C für 5 s und 60 ° C für 30 s
      37 ° C für 1 min
    9. Verwenden Sie für die Analyse der Ergebnisse die Methode für Livak und Kollegen vorgeschlagen, um qPCR Daten24zu analysieren. Verwenden Sie entweder Tubulin oder Aktin als Referenz Gene zur Berechnung der ΔCt schätzen und verwenden Sie das entsprechende Steuerelement um zu berechnen, die für den ΔΔCt-Wert für die spezifische Seneszenz-induzierenden Behandlung.
  5. Protein-Expression und Sekretion von IL6
    1. Samen 5 – 10 x 104 Zellen in mindestens einem gut eine 6-Well-Platte (5.2 – 10,5 x 103 Zellen/cm2) pro Zustand mit 2 mL D10. Behandlungen (falls zutreffend) direkt auf diese Platte ausgeführt werden können, oder Alternativ können Zellen bereits behandelt in einer 24-Well-Platte wieder ausgesät werden. Nach der Aussaat über Nacht stehen lassen.
    2. Entfernen Sie das Medium und für 2 mL DMEM mittlere ohne FBSzu ersetzen. Unter normalen Bedingungen für 24 h inkubieren.
    3. Sammeln Sie das Medium in einer 15 mL Tube.
    4. Zentrifuge der Probe bei 300 X g für 5 min. Medium kann bei-80 ° C bis zu Verarbeitung gespeichert werden.
    5. Nach den Anweisungen des Herstellers das ELISA durchzuführen.
    6. Vergleichen Sie die Ergebnisse der alternde Zellen gegen das entsprechende Steuerelement für die spezifische Seneszenz-induzierenden Behandlung

Ergebnisse

Bereicherung der SA-β-gal-Färbung in seneszenten Fibroblasten

Β-Galaktosidase (β-gal) ist eine lysosomale Enzym, das drückt sich in allen Zellen und hat einen optimalen pH-Wert von 4,025,26. Jedoch während der Seneszenz, Lysosomen an Größe zunehmen und infolgedessen seneszenten Zellen ansammeln β-gal. Die erhöhten Mengen dieses Enzyms machen es möglich, seine Tä...

Diskussion

Die hier erläuterten Protokolle wurden optimiert für menschliche primäre Fibroblasten, besonders BJ und WI-38 Zellen. Die Protokolle für replikative Seneszenz, ionisierende Strahlung und Doxorubicin, worden erfolgreich angewandt, um andere Arten von Fibroblasten (HCA2 und IMR90) und in andere Zelltypen (nämlich neonatale Melanozyten und Keratinozyten oder iPSC-abgeleitete Herzmuskelzellen) in unserem Labor. Anpassungen für weitere Zelltypen können jedoch durch Anpassung einige Details wie die Anzahl der gesetzten ...

Offenlegungen

N/A

Danksagungen

Wir danken Mitglieder des Demaria Labors für fruchtbare Diskussionen und Thijmen van Vliet für den Austausch von Daten und das Protokoll auf der UV-induzierten Seneszenz.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM Media - GlutaMAXGibco31966-047
Fetal Bovine SerumHycloneSV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml)LonzaDE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichSC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)AmbionAM9937
T75 flaskSarstedt833911002
Trypsin/EDTA SolutionLonzaCC-5012
PBS tabletsGibco18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubesSigma-AldrichT9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubesSigma-AldrichCLS430791
6-well plateSarstedt83.3920
24-well plateSarstedt83.3922
13mm round coverslipsSarstedt83.1840.002
SteriflipMerck ChemicalsSCGP00525
Cesium137-sourceIBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamberOpsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride BioAustralis Fine ChemicalsBIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solutionSigma-Aldrich7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidineSigma-AldrichA3656
SAHASigma-AldrichSML0061
Sodium Butyrate Sigma-AldrichB5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)Fisher Scientific7240-90-6
Citric acid monohydrateSigma-Aldrich5949-29-1
Sodium dibasic phosphateAcros organics7782-85-6
Potassium ferrocyanide Fisher Scientific14459-95-1
Potassium ferricyanideFisher Scientific13746-66-2
Sodium ChlorideMerck Millipore7647-14-5
Magnesium ChlorideFisher Chemicals7791-18-6
25% glutaraldehydeFisher Scientific111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v)Thermo-Fisher Scientific28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)Lumiprobe10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide)LumiprobeD1330
Sodium ascorbateSigma-AldrichA4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O)Sigma-Aldrich209198
Triton X-100Acros organics215682500
TRIS baseRoche11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white Roche4729749001
Lightcycler 480 sealing foil Roche4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit BiolineBIO-84020
UPL Probe LibrarySigma-AldrichVarious
Human IL-6 DuoSet ELISAR&DD6050
Bio-Rad TC20Bio-Rad
Counting slidesBio-Rad145-0017
Dry incubatorThermo-Fisher ScientificHeratherm
DimethylformamideMerck Millipore1.10983
Parafilm 'M' laboratory filmBemis #PM992
Tweezers
Needles

Referenzen

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