JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, bir dizi indüksiyon için protokol ve kültürlü hücrelerdeki hücresel yaşlanma doğrulanmasını tartışmak. Biz farklı yaşlanma-inducing uyaranlara üzerinde odaklanmak ve ortak yaşlanma ilişkili işaretçileri miktar açıklayın. Fibroblastlar içerebilen bir model olarak kullanarak teknik ayrıntıları sağlar, ancak iletişim kuralları için çeşitli hücresel modelleri adapte edilebilir.

Özet

Hücresel yaşlanma kalıcı hücre döngüsü tutuklama farklı zararlı uyaranlara yanıt olarak aktif bir durumdur. Harekete geçirmek-in hücresel yaşlanma tümör giderme, yenileme ve yaşlanma doku dahil olmak üzere çeşitli patofizyolojik koşullar bir özelliğidir. Hücresel yaşlanma vivo içinde indükleyicileri hala kötü karakterizedir. Ancak, bir dizi uyaranlara hücresel yaşlanma ex vivotanıtmak için kullanılabilir. Bunların arasında en yaygın yaşlanma-indükleyicileri ikileştirici bitkinlik, iyonize ve iyonizan radyasyon, genotoksik uyuşturucu, oksidatif stres ve demethylating ve ajanlar acetylating vardır. Burada, bu uyaranlara fibroblastlar yaşlanma ikna etmek için kullanma hakkında ayrıntılı yönergeler sağlayacaktır. Bu iletişim kuralı kolayca primer hücre ve hücre hatları, kanser hücrelerinin de dahil olmak üzere farklı türleri için adapte edilebilir. Biz aynı zamanda yaşlanma indüksiyon doğrulama için farklı yöntemler açıklanmaktadır. Özellikle, biz lizozomal enzim yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-gal), 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) birleşme tahlil, ifadesi hücre döngüsünün düzeyi kullanarak DNA sentezi oranı etkinliğini ölçme üzerinde odaklanmak inhibitörleri p16 ve p21 ve ifade ve salgı üye Senescence-Associated salgı fenotip (SASP). Son olarak, örnek sonuçlar sağlar ve uygulamalar bu iletişim kurallarının tartışmak.

Giriş

1961'de Hayflick ve Moorhead kültür birincil fibroblastlar sonra art arda pasajlar1proliferatif potansiyellerini kaybetmek bildirdi. Bu işlem sıralı telomerlerin kısalma her hücre bölünmesi sonra neden olur. Telomerlerin eleştirel kısa uzunluğu ulaştığında, nükleer silahların yayılmasına karşı geri dönüşü olmayan bir tutuklama etkinleştiren DNA hasarı yanıt (DDR) tarafından tanınır — de ikileştirici yaşlanma tanımlanır. İkileştirici yaşlanma Şu anda hücre mitogens hem apoptotik sinyal2,3duyarsız işler kalıcı hücre döngüsü tutuklama durumunu ikna etmek için bilinen birçok uyarinin biridir. Yaşlanma program normalde yüksek lizozomal etkinlik, mitokondrial disfonksiyon, nükleer değişiklikleri, kromatin düzenlemeler, endoplazmik retikulum stres, DNA hasarı ve yaşlanma ilişkili dahil olmak üzere ek özellikler ile karakterizedir salgı fenotip (SASP)3,4. Senescent hücreleri vücutta birden fazla işlevi var: geliştirme, yara iyileşmesi ve tümör bastırma2. Aynı şekilde, yaşlanma ve paradoksal olarak, tümör ilerleme5önemli bir rol oynamak için bilinir. Yaşlanma negatif ve kısmen çelişkili etkileri genellikle için SASP6atfedilen.

Son zamanlarda, bu fareler senescent hücrelerden ortadan kaldırılması ömrü uzatma ve yaşlanma özellikleri7,8,9,10,11, çoğunu ortadan kaldırılması yol gösterildi 12. aynı şekilde, birden çok uyuşturucu da senescent hücreleri (senolytics) ortadan kaldırmak için veya SASP13,14hedeflemek için geliştirilmiştir. Anti-aging tedavi potansiyel son zamanlarda alanına daha fazla dikkat çekti.

Çalışma mekanizmaları için hücresel yaşlanma ilişkili ve farmakolojik müdahaleler için gösterimleri özellikle de insan birincil fibroblastlar ex vivo modellerinde güveniyorsun. Ortak bazı özellikleri farklı yaşlanma indükleyicileri tarafından aktif olmakla birlikte, yaşlanma fenotip büyük bir değişkenlik gözlenen ve hücre türü, uyarıcı ve zaman noktası3,15gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. 16,17. Eğitim ve senescent hücreleri hedefleme için heterojenite düşünün zorunludur. Bu nedenle, bu iletişim kuralı bir dizi farklı tedavileri kullanarak birincil fibroblastlar yaşlanma ikna etmek için kullanılan yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Bunu izah gibi yöntemler kolayca diğer hücre tipleri için adapte edilebilir.

İkileştirici yaşlanma dışında biz beş diğer yaşlanma-inducing tedaviler tarif: iyonlaştırıcı radyasyon, ultraviyole (UV) ışınları, doksorubisin, oksidatif stres ve epigenetik değişiklikler (yani promosyon histon asetilasyon veya DNA demethylation) . Hem, iyonizan radyasyon ve UV radyasyon doğrudan DNA hasarına neden ve yaşlanma18,19uygun doz tetik. Doksorubisin aynı zamanda yaşlanma DNA hasarı üzerinden olmak üzere DNA'ya enterkalasyon tarafından neden olur ve topoizomeraz II işlevi bozmakta ve böylece DNA durdurma mekanizmaları20onarmak. Genlerin yaşlanma için temel ifade normalde histon asetilasyon ve DNA metilasyonu tarafından kontrol edilir. Sonuç olarak, histon deacetylase inhibitörleri (Örneğin, sodyum bütrat ve SAHA) ve DNA demethylating (Örneğin, 5-aza) ajanlar yaşlanma Aksi takdirde normal hücreleri21,22tetikler.

Son olarak, dört senescent hücrelere ilişkili en yaygın veri işaretleyicilerini açıklanacaktır: yaşlanma ilişkili-β-galaktozidaz (SA-β-gal), DNA sentezi tarafından EdU birleşme tahlil, hücre döngüsü düzenleyiciler overexpression oranı etkinlik ve siklin bağımlı kinaz inhibitörleri p16 ve p21 ve overexpression ve SASP üyeleri salgılanmasını.

Protokol

1. genel hazırlık

  1. D10 orta hazırlayın. Ek DMEM orta-Glutamax ile % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin (son konsantrasyonu: 100 U/mL).
  2. Steril PBS hazırlayın. Su üretici yönergelerine göre tablet geçiyoruz. Otoklav tarafından sterilize.
  3. 1 x tripsin hazırlayın. Tripsin Versene EDTA/10 5 mL seyreltik x 1:10 45 ml steril PBS.
    Not: boyunca protokolünün, kullandığımız yakın olan hücre kültür koşulları fizyolojik koşullar için birincil fibroblastlar. Bu normalde bitmiş ama kullanma %5 O2 "standart" %20 O yerine olduğu gibi hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçkaya anlamına gelir2.
  4. Tüm örnekleri steril koşullarda laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak işlemek. Hücreler %20 O2 ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.

2. indüksiyon yaşlanma

  1. İkileştirici yaşlanma
    1. Hücreleri veya onlarla temas halinde olacak herhangi bir malzeme işleme sırasında (pipets, şişeler, medya, vb) iş steril koşullarda, laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak. Hücreler %20 O2 ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
    2. Tohum 7 x 105 uygun birincil fibroblastlar (PD) D10 10 mL içeren bir T75 şişeye (~9.3 x 103 hücreleri/cm2) iki katına bir düşük nüfus.
    3. 70-%80 izdiham (3 – 4 gün için düşük bir PD Proliferasyona kültürlerde) ulaşana kadar % 5 CO2 ve %5 O2 37 ° C'de bir hücre kuluçka hücrelerin büyümesine.
    4. 3 mL 1 x tripsin ve ~ 5-7 için kuluçka kullanarak hücreleri ayırmak hücre kültür kuluçka 37 ° c % 5 CO2 ve %5 O2dk. Hücreleri düzenli olarak ayırmayı işlemi denetlemek için bir hücre kültür mikroskopla izlemek.
    5. Küresel hücrelerdir D10 9 mL ekleyerek tripsin reaksiyonu durdurur. 10 dakika daha uzun kuluçkaya değil.
    6. Enkaz ve daha küçük parçacıklar süpernatant içinde kalır iken 5 dk. hücreleri bir Pelet Tüp, altındaki oluşturacak için hücreleri 300 x g de spin.
    7. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet D10 1 ml dağıtılması ve elle sayım için bir otomatik hücre sayaç göre üretici yönergelerine veya Neubauer odası kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirmek. Sayım sırasında (Örneğin, Trypan mavi dışlama23) hücre canlılığı kontrol etmek için bir tahlil içerir.
    8. Bu formülü kullanarak toplu PD Hesapla:
      PDYeni 3.32* (LOG(cell number total)-(günlük (numaralı seribaşı cep numarası)) + PDold =
      Hücre sayısı toplam = tüm hücre sayılır: ölü ve canlı.
      Hücre numaralı seribaşı = numaralı seribaşı hücrelerin (8 x 105 hücreleri) sayısı.
      PDeski tohum anda iki katına nüfus =.
      PDYeni = popülasyon (kuluçka sonra) sayma Şu anda iki katına.
      Not: Eğer, 7 x 105 birincil fibroblastlar (PD 35,2) bir T-75 şişesi üzerinde tohumlari ve 4 gün sonra onlar % 80 izdiham ulaşmak ve tekrar ayrılır, şimdi 1.3 x 106 toplam hücre sayım (ölü + canlı).
      PDYeni 3.32* = (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35,2
      PDYeni 36.1 =
    9. Yeni bir T75, 8 x 105 hücreleri adımları 2.1.2–2.1.8 yinelenen reseed.
      Not: birden fazla arka arkaya pasajlar sonra kültür hücreleri tüm bölme durdurana kadar konfluent almak daha uzun sürer. Bir kez hücre bölünmesi durdurmak, yaşlanma işaretleri ve/veya hasat için aşağı akım uygulamaları sınayın.
    10. Senescent hücrelerin daha büyük boyutunu tam görünür ve henüz düşük hücre sayısı kültür neden olabileceğini göz önünde bulundurun. Böylece, yaşlanma PD kararlı ve kültüründe diğer yaşlanma işaretçileri görünür ne zaman kabul edilebilir (bkz: protokol 3.1-3.5).
      Not: Proliferasyona birincil fibroblastlar denetimi olarak kullanın.
  2. İyonizan radyasyon kaynaklı yaşlanma
    1. Hücreleri veya onlarla temas halinde (pipets, şişeler, medya, vb)-ecek var olmak herhangi bir malzeme taşıma sırasında steril koşullar altında bir laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak çalışın. Hücreler %20 O2 ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
    2. D10 10 mL içeren 7 x 105 uygun birincil fibroblastlar içinde bir T75 şişesi (~9.3 x 103 hücreleri/cm2) düşük bir PD içinde tohum.
    3. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO2 ve %5 O237 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya.
    4. Gama ışınlama kullanılan makine talimatları doğrultusunda 10 gri hücreleri göstermek.
    5. Hücreleri ortamından Aspire edin ve D10 10 mL ile değiştirin.
    6. D10 10 mL % 5 CO2 ve %5 O2 37 ° C'de bir hücre kültür kuluçka hücrelerde başka bir 10 gün düzenli olarak orta yerine, yaklaşık 3 günde kuluçkaya.
    7. 10 gün sonra yaşlanma işaretler için test ve/veya hücreleri aşağı akım uygulamaları için kullanın.
      Not: aynı PD (önce ışınlama) Proliferasyona birincil fibroblastlar denetimi olarak kullanın.
  3. Ultraviyole radyasyon indüklenen-yaşlanma
    1. Hücreleri veya onlarla temas halinde (pipets, şişeler, medya, vb)-ecek var olmak herhangi bir malzeme taşıma sırasında steril koşullar altında bir laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak çalışın. Hücreler %20 O2 ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
    2. Tohum 1,5 – 2 x 105 uygun birincil fibroblastlar içinde bir iyi bir 6-şey plaka (1.5-2.0 x 104 hücreleri/cm2), düşük bir PD D10 Orta 2 mL ekleyin.
    3. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO2 ve %5 O2 37 ° C'de hücreler yerleştirin ve onları en az 5 h için plastik uymak sağlar.
    4. Orta hücrelerden al. 6-şey plaka UV radyasyon odası ortasında yer ve plastik kapağı çıkarın. UVB, 20-30 mJ/cm2ışınlatayım.
    5. Orta iyi başına 2 mL ekleyin.
    6. D10 2 mL % 5 CO2 ve %5 O2 37 ° C'de bir hücre kültür kuluçka hücrelerde başka bir 7 gün düzenli olarak orta yerine, yaklaşık 3 günde kuluçkaya.
      Not: 7 gün sonra hücreler olabilir yaşlanma işaretler için test ve aşağı akım uygulamaları için kullanılan. Aynı PD (önce ışınlama) Proliferasyona birincil fibroblastlar denetimi olarak kullanın.
  4. Doksorubisin kaynaklı yaşlanma
    1. Doksorubisin hisse senedi çözüm x 1000 hazırlamak: 1 x PBS doksorubisin bir 250 µM hazır olun, çözüm ve steril tüp başına 500 µL aliquot filtre sterilize. Doksorubisin hisse senedi-80 ° C'de depolayın
    2. Hücreleri veya onlarla temas halinde (pipets, şişeler, medya, vb)-ecek var olmak herhangi bir malzeme taşıma sırasında steril koşullar altında bir laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak çalışın. Hücreler %20 O2 ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
    3. D10 10 mL içeren 7 x 105 uygun birincil fibroblastlar içinde bir T75 şişesi (~9.3 x 103 hücreleri/cm2) düşük bir PD içinde tohum.
    4. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO2 ve %5 O237 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya.
    5. 1.000 doksorubisin hisse senedi çözüm D10 11 ml nihai bir konsantrasyon için x 11 µL seyreltik 250 nM.
    6. Hücreleri ortamından Aspire edin ve D10 + doksorubisin 10 mL ile değiştirin.
    7. Tam olarak 24 h % 5 CO2 ve %5 O237 ° C'de bir hücre kültür kuluçka için hücreleri kuluçkaya.
    8. Hücreleri ortamından Aspire edin ve dikkatli bir şekilde bir kez D10 10 mL ile yıkayın.
    9. D10 10 mL hücrelerde 6 gün düzenli olarak orta yerine, yaklaşık her 3 günde bir başka kuluçkaya.
    10. Gün 7, yaşlanma işaretler için test ve/veya aşağı akım uygulamaları için kullanın.
      Not: D10 araç (PBS) 1:1,000 ile 24 h için tedavi aynı PD birincil fibroblastlar Proliferasyona kullanımını denetlemek gibi.
  5. Oksidatif stres kaynaklı yaşlanma
    1. Hücreleri veya onlarla temas halinde olacak herhangi bir malzeme işleme sırasında (pipets, şişeler, medya, vb) iş steril koşullarda laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak. Hücreler %20 O2 ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
    2. D10 10 mL içeren 7 x 105 uygun birincil fibroblastlar içinde bir T75 şişesi (~9.3 x 103 hücreleri/cm2) düşük bir PD içinde tohum.
    3. Bir hücre kuluçka %5 CO2 ve %5 O237 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya.
    4. Bir çözüm ~ 200 mikron hidrojen peroksit D10 orta D10 11 mL % 30 hidrojen peroksit 22,6 μL ekleyerek hazırlayın.
      Not: toksisitesi değerlendirmek için eğri doz-yanıt yaparak tedavi faiz hücre türü için en iyi duruma getirme.
    5. Hücreleri ortamından Aspire edin ve taze hazırlanmış D10 orta + hidrojen peroksit 10 mL ekleyin. %5 CO2 ve %5 O237 ° C'de 2 h için kuluçkaya.
    6. Hücreleri ortamından Aspire edin ve bir kez taze D10 olmadan hidrojen peroksit ile yıkayın.
    7. D10 olmadan hidrojen peroksit 10 mL ekleyin.
    8. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO2 ve %5 O237 ° C'de 48 h için kuluçkaya.
    9. Adımları 2.5.4–2.5.8 iki kat daha fazla toplam üç tedaviler için yineleyin.
    10. Yaşlanma işaretçileri veya hasat aşağı akım uygulamaları için kontrol edin.
      Not: Gibi kullanım 22,6 µL D10 steril su için 2 h ile tedavi aynı PD Proliferasyona hücrelerin kontrol.
  6. Yaşlanma epigenetically indüklenen
    1. Hisse senedi ve çalışma çözümleri Tablo 1göre kullanmak küçük molecule(s) için hazır olun. Filtre-çözümler sterilize. Aliquot steril tüpler. -20 ° C'de mağaza
    2. Hücreleri veya onlarla temas halinde olacak herhangi bir malzeme işleme sırasında (pipets, şişeler, medya, vb) iş steril koşullarda, örneğin, laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak. Hücreler %20 O2 ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
    3. D10 10 mL içeren 7 x 105 uygun birincil fibroblastlar içinde bir T75 şişesi (~9.3 x 103 hücreleri/cm2) düşük bir PD içinde tohum.
    4. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO2 ve %5 O237 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya.
    5. D10 orta + çalışma çözüm 11 mL istenilen tedavi için hazırlayın. Tedavi başına tam seyreltme Tablo 1' de görülebilir.
      1. 1 mM SAHA çalışma çözüm D10 11 ml 11 µL hazırlayın.
      2. 1 M sodyum bütrat çalışma çözüm D10 11 ml 44 µL hazırlayın.
      3. 10 mM 5-aza çalışma çözüm D10 11 ml 11 µL hazırlayın.
        Not: ilgi tarafından hücre türü için tedaviler mesela toksisitesi değerlendirmek için eğri doz-yanıt verme optimize edin.
    6. D10 orta + çalışma çözüm istenilen tedavi için kültür için ekleyin.
    7. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO2 ve %5 O237 ° C'de 24 h için kuluçkaya.
    8. Adımları 2.6.4–2.6.6 iki kat daha fazla toplam üç tedaviler için yineleyin.
    9. Uyuşturucu olmadan basit D10 için orta değiştirin.
    10. 3 gün sonra daha fazla hücre senescent ve yaşlanma işaretleri ve aşağı akım uygulamaları test için hazır olur.
      Not: D10 orta + araç ile üç gündür tedavi aynı PD birincil fibroblastlar Proliferasyona kullanımını denetlemek gibi. D10 orta + araç her 24 h o üç gün boyunca yenilenmesi gerekiyor. Araç kullanılan tedavi bağlıdır: 1:1,000 DMSO sodyum bütrat için SAHA ve 5-aza ve 1:250 steril su için.

3. yaşlanma işaretleri

  1. Hazırlık
    1. 20 mg/mL X-gal hazırlamak: X-gal 20 mg 1 ml dimethylformamide veya DMSO geçiyoruz. Işıktan korunan-20 ° C'de depolayın.
    2. 0.1 M sitrik asit çözüm hazırlamak: 2.1 g Sitrik Asit Monohidrat su 100 ml geçiyoruz. Oda sıcaklığında saklayın.
    3. 0.2 M sodyum fosfat çözüm hazırlamak: 2,84 dağıtılması g sodyum dibasic fosfat veya sodyum dibasic fosfat 3.56 g kurutmak 100 mL su. Oda sıcaklığında saklayın.
    4. 0.2 M sitrik asit sodyum fosfat pH 6.0 hazırlamak: 36.85 mL 0.1 M sitrik asit çözüm ve 0.2 M sodyum fosfat 63.15 mL geçiyoruz. Küçültme/büyütme tam olarak pH 6.0. Oda sıcaklığında saklayın.
    5. 100 mM potasyum ferrocyanide hazırlamak: 2.1 g potasyum ferrocyanide 50 mL su içinde çözülür. Işıktan korunan 4 ° C'de depolayın.
    6. 100 mM potasyum ferricyanide hazırlamak: 1,7 g potasyum ferricyanide 50 mL su içinde çözülür. Işıktan korunan 4 ° C'de depolayın.
    7. 5 M sodyum klorür hazırlamak: 14.6 g sodyum klorür 50 mL su içinde çözülür. Oda sıcaklığında saklayın.
    8. 1 M magnezyum klorür hazırlamak: 4.8 g magnezyum klorür 50 mL su içinde çözülür. Oda sıcaklığında saklayın.
    9. Hazırlamak % 2 formaldehit + PBS %0,2 oxazolidin: 800 dağıtılması µL % 25 oxazolidin ve 12.5 µL % 16 formaldehit PBS 100 μL içinde. Işıktan korunan oda sıcaklığında saklayın.
    10. Boyama çözüm hazırlamak taze göre Tablo 2.
  2. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktozidaz boyama
    1. Hücreleri seyrek olması her örnek için 1 x 104 hücreleri bir 24-şey plaka (5.2 x 103 hücreleri/cm2) içeren 500 µL D10, en az bir iyi tohum. Tedaviler (varsa) doğrudan bu plaka üzerinde gerçekleştirilebilir veya alternatif olarak, zaten tedavi hücreler yeniden bir 24-şey plaka numaralı seribaşı olabilir.
    2. Gecede 37 ° C'de % 5 CO2 ve %5 O2hücreleri kuluçkaya.
    3. Hücreleri iki kez PBS 500 μL ile yıkayın.
    4. 3-5 dk PBS %2 formaldehit + %0,2 oxazolidin 500 μL/iyi kullanarak oda sıcaklığında düzeltmek.
    5. Hücreleri iki kez PBS 500 μL ile yıkayın.
    6. Çözüm, leke için örnek sayısına göre boyama taze hazırlayın.
    7. Boyama çözüm (500 µL/de) ekleyin ve buharlaşma önlemek için parafilm ile plaka mühür.
      Not: Buharlaşma kristalleri forma neden olabilir ve mikroskop altında gözlem engel.
    8. 12-16 h için kuru bir kuluçka (CO2) olmadan 37 ° C'de hücreler karanlıkta (alüminyum folyo kaplıÖrneğin ) kuluçkaya.
      Not: CO2 pH etkiler ve bu nedenle sonuçları değiştirin. Bazı hücre tipleri daha kısa kuluçka süreleri gerektirebilir.
    9. İki kez PBS 500 μL ile yıkayın.
    10. Sonuçları değerlendirmek. Pozitif hücrelerinin mevcut bir mavi (çoğunlukla) normal ışık mikroskobunda (Şekil 1A) boyama Perinükleer.
    11. Miktar için örnek başına en az 100 hücreleri gözlemlemek ve pozitif hücrelerinin sayısını saymak. Senescent hücreleri şekli Dönüştür beri genellikle hücre kenarlıklarını tanımlamak ve hücreleri saymak için zordur. Görselleştirme ve tek tek hücreler (Şekil 1B) miktar kolaylaştırmak için DAPI ile counterstain. Örnekleri (pozitif hücrelerinin toplam tutarı hücre karşı yüzdesi) ölçmek floresan mikroskop (Şekil 1 c) kullanarak. Böylece sonunda en az 100 tek-hücreleri saymak ve SA-β-gal pozitif hücrelerinin onlara yüzdesi değerlendirmek aynı örnek birden fazla fotoğraf çekmek.
    12. Senescent hücreleri için kullanılan tedavi uygun onların denetimi karşı karşılaştırın.
      Not: Bir EdU ile aynı örnek üzerinde ortak boyama mümkündür. Hücreleri sonra coverslips seribaşı göz önünde bulundurun.
  3. EdU birleşme tahlil
    1. Coverslip/iyi değerlendirmek için örnek sayısına göre 24-şey plaka koymak.
    2. 1 x 104 hücre hücreleri seyrek D10 500 µL içeren koşul başına 24-şey plaka (5.2 x 103 hücreleri/cm2) en az bir iyi tohum. Tedaviler (varsa) doğrudan bu plaka üzerinde gerçekleştirilebilir veya alternatif olarak, zaten tedavi hücreler yeniden bir 24-şey plaka numaralı seribaşı olabilir.
    3. Gecede 37 ° C'de % 5 CO2 ve %5 O2hücreleri kuluçkaya.
    4. EdU 20 µM çözeltisi içinde D10 yapmak (1:250) (örnek başına 250 μL) tedavisi için örnek sayısına göre.
    5. Orta (250 μL) yarısı tedavi ve D10 + EdU ile değiştirmek için her şey kaldırmak sadece hazırlanan çözüm. Son EdU 10 µM bölgedir.
    6. 18-24 h hücre kültür kuluçka %5 CO2 ve %5 O2 ile 37 ° C'de kuluçkaya. Denetim ve senescent hücreleri aynı kuluçka zaman kullanın.
    7. 2 x 500 μL PBS ile yıkayın.
    8. 10 dk için hücreleri 500 μL PBS %4 formaldehit ile düzeltmek.
    9. 100 mm Tris (pH 7,6) 5 dakika içinde 500 μL kuluçkaya.
    10. 500 μL 10 min % 0.1 için hücreleri permeabilize PBS Triton X-100.
    11. 3 x PBS ile yıkayın.
    12. Etiket Mix 50 μL bileşenleri aşağıdaki sıraya göre ekleme her coverslip hazırlamak: PBS, 0.5 µL Cu (II) 44.45 µL SO4, sulfo-Cy3-azid 0,05 µL, sodyum askorbat 5 µL.
    13. Etiket Mix 50 μL parafilm bir parça üzerine koy. Coverslip bir çift cımbız ve bir iğne yardımı ile Asansör ve üstünde tepe-in etiket karıştırmak, aşağıya doğru bakacak şekilde hücreleri içeren yüzey ile rahat bırak. Orada hava kabarcığı yok ve coverslip tüm yüzey etiket mix dokunuyor emin olun. Karanlıkta 30 dk için kuluçkaya.
    14. Hücreleri 24-şey plaka wells geri koymak ve PBS ile üç kez yıkayın.
    15. Cam slaytlar (DAPI çekirdeği görselleştirmek için de dahil olmak üzere) ortam takma ile dağ ve koyup gecede kuruyuncaya kadar bırakın.
    16. Floresan mikroskop kullanarak EdU birleşme görselleştirin. Cy3 için uygun filtre kullanmak (uyarma/emisyon: 552/570 nm).
    17. Daha sonra miktar koşul (Cy3 ve DAPI) başına en az 100 hücre için hücre birden fazla fotoğraf çekmek.
    18. Aşağıdaki formülü kullanarak EdU dahil hücre yüzdesi ölçmek:
      EdU pozitif hücrelerinin (%) = (EdU pozitif hücre sayısı (Cy3) / toplam hücre sayısı (DAPI)) * 100
    19. Senescent hücreleri için kullanılan tedavi uygun onların denetimi karşı karşılaştırın.
      Not: Bir SA-β-gal ile aynı örnek üzerinde ortak boyama mümkündür. Hücreler hala coverslips üzerinde seribaşı göz önünde bulundurun.
  4. Gen ifadesinin p16, p21 ve SASP
    1. Astar-faiz genler (50 µM astar) kümesi hazırlayın.
      Not: P16, p21 ve ilgili bazı SASP faktörler qPCR yaşlanma durumunu bilgilendirici. Protokol burada yapar anlatılan evrensel Probe Kütüphane (UPL) sistemi gerçek zamanlı PCR kullanarak göreli miktar için kullanın. Tablo 3 algılama CDK inhibitörleri p16 ve p21 ve en alakalı SASP üyelerinin yanı sıra tübülin ve aktin, tahlil için referans gen olarak hizmet için kullanılan astar özetini gösterir. Tablo 3 son sütunu her tahlil için kullanılmak üzere belirli UPL sonda çağırır.
    2. Ayrı qPCR reaksiyon mix istenen deneyleri için hazırlayın. Her zaman referans gen Tablo 4göre de içerir.
    3. Tüm örneklerini yinelenen veya nüsha çalıştırın.
    4. Yük 7.5 µL/iyi 384-şey tabakta qPCR reaksiyon karışımı.
    5. ~ 5 ekleyin cDNA ng çözünmüş RNase free su 2.5 µL içinde.
      Not: CDNA karşılaştırılmak üzere tüm örnekleri için benzer miktarda olması tercih edilir. Bu ters transkripsiyon için RNA'ın eşit tutarlar kullanılarak elde edilebilir.
    6. Bir mühür ile plaka kapak ve o doğru bütün kuyuları plaka üzerinde eşit olarak kapsayan sopa emin olun.
    7. 2.000 x g 1 dk. için plaka Döndür.
    8. Kalenin içinde Lightcycler aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak 40 devredir çalıştırın:
      7 dk. için 95 ° C
      95 ° C 40 döngüleri 5 s ve 60 ° C 30 s
      1 dk. için 37 ° C
    9. Sonuçları analiz için Livak ve meslektaşları için önerilen yöntem qPCR veri24çözümlemek için kullanın. Başvuru genlerin ΔCt hesaplamak için değer ve hesaplamak için uygun denetimi kullanım kullanın tübülin ya da aktin belirli yaşlanma-inducing tedavisi için ΔΔCt değeri için.
  5. Protein ifade ve IL6 salgılanması
    1. Tohum 5 – 10 x 104 hücreleri en az bir iyi D10 2 mL içeren koşul başına 6-şey plaka (5.2-10,5 x 103 hücreleri/cm2). Tedaviler (varsa) doğrudan bu plaka üzerinde gerçekleştirilebilir veya alternatif olarak, zaten tedavi hücreler yeniden bir 24-şey plaka numaralı seribaşı olabilir. O gecede tohum sonra stand izin.
    2. Orta kaldırın ve DMEM orta FBS2 mL için değiştirin. Normal koşullarda 24 h için kuluçkaya.
    3. 15 mL tüp ortamda toplamak.
    4. Santrifüj örneği 300 x g ' 5 dk. orta-80 ° işlenen kadar C saklanır.
    5. ELISA gerçekleştirmek için üreticinin yönergelerini izleyin.
    6. Belirli yaşlanma-inducing tedavi için uygun denetimi karşı senescent hücrelerin karşılaştırılması

Sonuçlar

SA-β-gal senescent fibroblastlar boyama zenginleştirme

Β-galaktozidaz (β-gal) bu tüm hücrelerde ifade edilir ve bir optimum pH 4.025,26olan lizozomal bir enzimdir. Ancak, yaşlanma sırasında organellerin Boyutu'nda artırın ve sonuç olarak, β-gal senescent hücreleri birikir. Bu enzim artan miktarda bir suboptimal pH 6,025,

Tartışmalar

Burada iletişim kuralları insan birincil fibroblastlar için optimize özellikle BJ ve WI-38 hücreleri. İkileştirici yaşlanma, iyonizan radyasyon ve doksorubisin, protokollerde başarıyla uygulanan diğer türlerini fibroblastlar (HCA2 ve IMR90) ve diğer hücre tipleri (Yani yenidoğan melanosit ve Lenfositi veya IPSC elde edilen cardiomyocytes) Bizim laboratuvarda. Ancak, ek hücre tipleri için uyarlamalar numaralı seribaşı hücreleri, yöntemleri ve hücreler ekleme/ayırma için plastik destekler için yar...

Açıklamalar

N/A

Teşekkürler

Biz üyeleri verimli tartışmalar için yönetici laboratuar ve Thijmen van Vliet veri ve iletişim kuralı UV kaynaklı yaşlanma üzerinde paylaştığınız için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM Media - GlutaMAXGibco31966-047
Fetal Bovine SerumHycloneSV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml)LonzaDE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichSC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)AmbionAM9937
T75 flaskSarstedt833911002
Trypsin/EDTA SolutionLonzaCC-5012
PBS tabletsGibco18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubesSigma-AldrichT9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubesSigma-AldrichCLS430791
6-well plateSarstedt83.3920
24-well plateSarstedt83.3922
13mm round coverslipsSarstedt83.1840.002
SteriflipMerck ChemicalsSCGP00525
Cesium137-sourceIBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamberOpsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride BioAustralis Fine ChemicalsBIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solutionSigma-Aldrich7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidineSigma-AldrichA3656
SAHASigma-AldrichSML0061
Sodium Butyrate Sigma-AldrichB5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)Fisher Scientific7240-90-6
Citric acid monohydrateSigma-Aldrich5949-29-1
Sodium dibasic phosphateAcros organics7782-85-6
Potassium ferrocyanide Fisher Scientific14459-95-1
Potassium ferricyanideFisher Scientific13746-66-2
Sodium ChlorideMerck Millipore7647-14-5
Magnesium ChlorideFisher Chemicals7791-18-6
25% glutaraldehydeFisher Scientific111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v)Thermo-Fisher Scientific28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)Lumiprobe10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide)LumiprobeD1330
Sodium ascorbateSigma-AldrichA4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O)Sigma-Aldrich209198
Triton X-100Acros organics215682500
TRIS baseRoche11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white Roche4729749001
Lightcycler 480 sealing foil Roche4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit BiolineBIO-84020
UPL Probe LibrarySigma-AldrichVarious
Human IL-6 DuoSet ELISAR&DD6050
Bio-Rad TC20Bio-Rad
Counting slidesBio-Rad145-0017
Dry incubatorThermo-Fisher ScientificHeratherm
DimethylformamideMerck Millipore1.10983
Parafilm 'M' laboratory filmBemis #PM992
Tweezers
Needles

Referanslar

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 136h cresel ya lanmaya lanmakansert m r bast rmadoku tamirsalggen ekspresyonugenotoksik streskemoterapiradyoterapiepigenetik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır