מיקרוסקופ Reflectometric ספקטרלי ב ו דנדריטים בחיי עיר

Summary

כאן, אנו מציגים עבור הדמיה ו דנדריטים בפרוסה המוח קבוע באמצעות ננו ללא תווית הדמיה הטכניקה מבוססת על reflectometry ספקטרלי פרוטוקול צעד אחר צעד.

Abstract

במערכת העצבים יונקים, המיאלין מספק בידוד חשמלי על-ידי enwrapping הסיבים האקסון ספירלה מרובה שכבות. בהשראת הארכיטקטורה subcellular-מאורגן, לאחרונה פיתחנו מודאליות הדמיה חדשה, בשם ספקטרלי reflectometry (SpeRe), המאפשרת הדמיה ננו ללא תווית חסרת תקדים של חיה ו דנדריטים בתוך באתרו. העיקרון הבסיסי הוא לקבל מידע nanostructural על-ידי ניתוח הספקטרום השתקפות של המבנה subcellular מרובה שכבות. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לביצוע של הדמיה SpeRe בסיסיים של רקמות עצבים משתמש מסחרי במערכת מיקרוסקופיים קונאפוקלית, מצוידים לייזר אור לבן, מסנן tunable. אנחנו מכסים את תהליכי הכנת הדוגמא, רכישת נתונים ספקטרלי, עיבוד להשגת מידע nanostructural תמונה.

Introduction

במערכת העצבים יונקים, המיאלין מספק גיאן מהירה ותקינות עצב על-ידי enwrapping הסיבים האקסון עם מעילי פרווה עלי הלוואי קרומיים מרובה שכבות. מבנהו מרובה שכבות מורכב לסירוגין הננומטרי דק-סרטים של ממברנות פלזמה (~ 5 nm), ציטוזול (~ 3 ננומטר), ורווחים חוץ-תאית (~ 7 ננומטר)^1,2. מיקרוסקופ אופטי, כולל את מיקרוסקופ ברזולוציה-העל האחרונה, אינם מתאימים להתבוננות הדינמיקות המיאלין הננומטרי בשל הרזולוציה שלהן לא מספיק בשל עקיפה אופטי^3,4,5. למרות מיקרוסקופ אלקטרונים יכול לספק פרטים עדינים של ננו-מבנה המיאלין, זה לא תואם עם המערכות הביולוגיות חיים עקב ההכנות מדגם פולשני ביותר מעורבים קיבוע כימי ו ultrasectioning^6,7 . עד לאחרונה היו לא טכניקה ישים להתבונן הננומטרי דינמיקת ו דנדריטים באתרו בתוך.

. Schain et al. דיווח בעבר ו דנדריטים התערוכה השתקפות אור צבעוני⁸. על ידי אימוץ הניתוח spectroscopic על האור המוחזר, אנחנו תכנן מודאליות הדמיה חדשה עבור ננו הדמיה של ו דנדריטים, בשם ספקטרלי reflectometry (SpeRe)⁹. SpeRe מבוסס על ההפרעות סרט דק המתרחשים במבנה רב שכבתית של למעטפת מיאלין (איור 1). על ידי הדמיה אופטיים על אקסונים שונים, נחשפו כי הקשת השתקפות היא פונקציה מחזורית של מספר גל תקופתיות שלה () הוא ביחס הפוך ל קוטר האקסון (d). מערכת היחסים הזו פשוטה () מציע נתיישב כימות של קוטר האקסון של הנתונים SpeRe. ניצול זה, חשפנו את האקסון ונפוצים בולטות תחת פציעת מוח טראומטית קלה בדוח הקודם שלנו.

מערכת SpeRe מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית מורכב מקור לייזר מיוחדים, מסננים (איור 2). מקור קלט הוא לבן-אור לייזר, מתן הפס הרחב פלט ספקטרלי הגלויים לאזורים אינפרא-אדום. עבור הסריקה ספקטרלי, המערכת הינו מצויד עם שני התקנים אקוסטו אופטי: אקוסטו אופטי tunable מסנן (AOTF) להעברת אורך גל שנבחרו מן המקור פס קלט של הפיצול קרן אקוסטו אופטי (AOBS) עבור המנחה שנבחר משתקפת גל את הגלאי. התוכנה עבור היפרספקטרליות מיקרוסקופיה קונפוקלית (ראה טבלה של חומרים) מספק אפשרות להתאמה אישית סריקה ספקטרלי לרכוש ברצף התמונות השתקפות קלט באורכי גל שונים. בנוסף, אברציה כרומטית יכול להתערב באורח קשה במדידה ספקטרלי; לכן, השימוש העדשה המטרה עדשה אפוכרומטית מומלץ.

ראוי לציין, אור לבן לייזרים לייצר פלט ספקטרלי לא אחידה, רכיבים אופטיים גם להשפיע על הפרופיל ספקטרלי. לכן, ספקטרום רכשה לכייל לניתוח כמותי עוקבות. מראה כסוף מוגן משמש בדרך כלל כנקודת התייחסות, אשר מספק של השתקפות כמעט קבוע (> 97%) השתלטה על האזור מלא גלוי. ספקטרום שנרכשו לאחר מכן מחולקים לפי ספקטרום הפניה מן המראה.

גודל הצעד ספקטרלי עבור הסריקה ספקטרלי קובעת את מהירות הרכישה; לכן, זה צריך להיות מותאם. כמו האקסון גדולים יותר יש תקופה ספקטרלי גבוה יותר, זה דורש עדין ספקטרלי הדגימה. לדוגמה, האקסון בקוטר של 10 מיקרומטר, אחד האקסונים הפיזיולוגיות הגדול, יש תקופה ספקטרלי של ~ 8 nm. על-ידי החלת קריטריונים הדגימה של נייקוויסט, אנחנו מועסקים את מרווח הדגימה ספקטרלי של 4 nm כדי לכסות כל האקסונים הפיזיולוגיות ברקמות העכבר לחוץ. גישה זו נמשכת בדרך כלל במשך מספר שניות לקבלת סריקה מלאה ספקטרלי, ולכן הוא לא מתאים ליישומי ויוו , איפה הפיזיולוגיות תנועה (למשל נשימה ואת קצב לב) משבש את רכישת ספקטרלי יציב. בעבר פתרנו בעיה זו על-ידי instrumenting מיקרוסקופ זקופה המותאמת אישית, שנועדה להשיג את ספקטרום מלא עבור כל נקודה באמצעות ספקטרומטר של המערך (≈ מהירות של רכישת 30 ms לפיקסל).

בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט על ההדמיה SpeRe על פרוסה המוח קבוע, אשר ניתן לבצע במיקרוסקופ היפרספקטרליות המסחרי (ראה טבלה של חומרים). כך, הפרוטוקול יכול להתבצע על ידי ניסויים ללא התמחות במכשור אופטי. אנחנו גם לכסות את בעיות אפשריות לפתרון בעיות עבור רכישת וניתוח של נתונים SpeRe.

Protocol

כל הניתוחים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת Sungkyunkwan.

1. הכנת הדוגמא

הערה: תא לחץ כל מכשירי ניתוח לפני לטיפול בבעלי חיים. לנהל את כל הביצועים כירורגית בחדר המוקדש ניתוחים. השמלות כירורגי סטרילי וכפפות לענידה על ידי כל אנשי הצוות בחדר ניתוח בכל עת.

1. קיבוע הרקמה
   1. להכין שני מזרקים 10 מ ל שכל מלא באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ו- 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS.
   2. עזים ומתנגד עכבר 7-שבוע בן 12, (C57BL/6J או שורות עכבר עם או מגדר) על ידי מתן תערובת של zoletil ו חריגות השירותים הווטרינריים (1:1, 20 מ"ג/ק"ג כל אחד) או משטר של הרדמה חלופי מתאים (למשל, תערובת של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 10 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים) עם זריקה בקרום הבטן.
   3. ברגע העכבר הגיע מטוס כירורגי של הרדמה (שימוש בשיטת קמצוץ-תגובה הבוהן), חושפים את הלב שתורידו את העור ואת הצלעות עם מספריים.
   4. לגזור אטריום ימין עם מספריים קטנות כדי לנקז את הדם perfuse את הפתרון PBS, כדורגלן ברצף דרך החדר השמאלי עם מחט (קצב זלוף = 4 mL/min, נפח = 10 מ"ל עבור כל הפתרונות).
      הערה: העכבר הופך נוקשה אם התהליך הושלם בהצלחה. השימוש של העין משחה או עיקור אין צורך כפי שנהוג מסוף. אולי תדלג על ההליך קיבעון. עם זאת, השלב זה מומלץ כדי למזער את העיוותים מבניים כולל נזק לרקמות מכני ונפיחות עצב איסכמי. פרטים נוספים על קיבוע הרקמה, להפנות המאמר על ידי גייג ', ג'יי ג'י. et al. ¹⁰
2. הכנה של הפרוסה המוח
   1. לערוף את העכבר עם מספריים כירורגיים דרך הגחון החזה, הגב והבטן.
   2. הסר את עור הקרקפת ואת קרום העצם בעזרת מספריים קטנות כראוי עד מלא חושפת את הגולגולת.
   3. לשבור את העצם הקדמית, לחתוך את הגולגולת לאורך התפר המשונן של עצם העורף באמצעות מספריים קטנות עם טיפול שלא יגרמו נזק למוח.
   4. הסר בעדינות את הגולגולת ואת קרום הדורה ברצף בעזרת מלקחיים משובחים.
   5. לחלץ באמצעות כף פלסטיק רך, דואגת שלא יגרמו נזק לרקמת המוח.
   6. שוטפים ומשרים המוח שחולצו בפתרון PFA 4% למשך 30 דקות ב 4 º C.
   7. פורסים את המוח קבוע למקטעים מיקרומטר 100 – 150 באמצעות של vibratome.
      הערה: לקבלת פרטים נוספים על הכנת הרקמה, להפנות המאמר על-ידי. שגב ואח ¹¹. להליכי עוקבות, הרקמה צריך להיות חתוכים למקטעים דק יותר עובי מרווח.
3. הרכבה של הפרוסה המוח
   1. היכונו כל פרוסה רקמות שקופית 1 כוס ו- 2 כוסות שער מרובע (22 × 22 × 0.17 מ מ).
   2. חותכים חצי אחד של המשקפיים שער מרובע (שתי חתיכות מלבניות) על-ידי שימוש לחיתוך זכוכית.
   3. לצרף שתי כוסות כיסוי חצויים באמצעות דבק סופר על הזכוכית שקופיות.
      הערה: הרווח בין שתי הכוסות חצויים צריך להיות מעט גדול יותר מהגודל של הפרוסה רקמות.
   4. לקצור את הפרוסה המוח בעזרת מברשת או פיפטה ולהניח את הרקמה על הזכוכית שקופיות בין מרווח. . שמור על עצמך לא לקפל את הרקמה.
   5. לוותר על μL 100 ל- PBS על פני הרקמה.
   6. המקום השני מרובע כיסוי הזכוכית על הרקמה. הימנע ההכללה של בועות אוויר בשלב זה.
   7. חותם סביב הזכוכית המכסה באמצעות של לק (או לחלופין מתאימים דבקים) כדי למנוע אידוי של PBS, זיהום על ידי אבק במהלך הפגישה הדמיה עוקבות.
      הערה: הנסיין עלול להיעצר בשלב זה.

2. כיול

1. . הפעילי את המיקרוסקופ לפחות שעה לפני ההדמיה כדי לאפשר תרמי מייצב לייזר מקור (ראה טבלה של חומרים). לאחר מכן, הפעל את התוכנה עבור ספקטרלי סריקה (ראה טבלה של חומרים), ולחץ על הלחצן ידרשו בראש GUI (איור 3 א).
2. הפעל את התריס תוכנה כדי להפוך את הלבן-אור לייזר (יקלו) שפופרת האופטיקה (PMT) (איור 3 א).
3. בחר את מצב xyΛ ברשימה הנפתחת במצב רכישהולאחר מכן, מצב הקלט של לייזר משתנה אוטומטית מ אחוז קבוע כוח קבוע. בטל את תיבת הסימון של תנועה SP אוטומטי. ולאחר מכן, הגדר את חלון ספקטרלי של הלייזר קלט 470 – 670 nm והגודל ספקטרלי שלב 4 nm בΛ-עירור לסרוק למדא הגדרות (איור 3b).
4. הגדר את טווח ספקטרלי של PMT 450-690 על-ידי לחיצה כפולה או הזזת הסרגל התאמה עבור טווח הספקטרום (איור 3 c).
   הערה: טווח הספקטרום הזה צריך לכלול את רוחב הפס מלא של מקור קלט.
5. בחר עדשה המטרה טבילה במים, כראוי עם צוהר מספרית גבוהה (NA > 0.7) ולתת ערך כלשהו לשלטון PMT ולייזר להפעלת לחצן לחיות לסרוק וקביעת תצורה של AOBS . לעבור בנתיב האופטי על ידי בדיקת שיקוף במעבר התצורה AOBS (איור 3d).
6. הר ראי התייחסות (ראה טבלה של חומרים) על הבמה מיקרוסקופ. צריך לעמוד בפני השטח מראה מול העדשה אובייקטיבי. אם זה לא קל לשים את המראה על הבמה מיקרוסקופ, בונד מראה על צלחת שטוחה (למשל . שקופית זכוכית).
7. לשלוט על הבמה מיקרוסקופ כדי ליישר את מטוס מוקד השטח מראה.
8. להתאים את עוצמת הלייזר בהתחשב הטווח הדינמי של הגלאי ורווח PMT ולאחר מכן שנה את מצב הקלט של לייזר מ אחוז קבוע לשלטון מתמדת.
   הערה: כאשר הוא אופייני, PMT לקבל 500 (V) ומשמשים כוח לייזר היחסי של 0.1%-570 ננומטר.
9. לאשר במצב צבע מדומה כדי לבדוק שאין לא רוויה לאורך כל טווח אורך הגל. אם נצפית רוויה, הנמך את עוצמת הלייזר (איור 3 א).
10. הפעל את הרכישה למדא לסרוק .
11. להסיר את השיקוף מן הבמה וחזור הרכישה אותו ללא דגימה לצורך קבלת ההפניה כהה (קרי, היסט כהה).
12. לשמור את הנתונים בתבנית Multistacked TIF .

3. ייבוא תמונות SpeRe

1. במקום הרקמה רכוב על הבמה מיקרוסקופ. ליישור בערך הרקמה למישור המוקד של העדשה המטרה, השתמש במצב רחב-שדות קרינה פלואורסצנטית דרך עין-קטע.
2. גרה סרוק על, לשלוט השלב מיקרוסקופ כדי ליישר את מטוס מוקד לאזור של עניין בתוך הרקמה. כדי למנוע את רעשי הרקע תגית כיסוי, בחר את אזור המטרה לפחות 15 עומק μm מממשק זכוכית-רקמות.
3. רוכשים של אוסף התמונות ספקטרלי לאזור היעד באמצעות ההליך אותו כמתואר בצעדים 2.1 – 2.10.
4. לשמור את הנתונים הרקמה, ההיסט כהה בפורמט Multistacked TIF .
   הערה: הנסיין עלול להיעצר בשלב זה.

4. התמונה עיבוד וניתוח

1. לפתוח את הנתונים ספקטרלי (טיף multistacked) עבור המראה התייחסות ו על רקמת המוח ב- ImageJ.
2. בחר את ROIs (אזורים מעניינים) עבור אוספי תמונות נפתח — אזור מרכזי עבור המראה הפניה, על הקטע של סיב האקסון רקמת המוח.
3. לרכוש ספקטרום raw עבור ROIs שנבחרו על ידי פועל התמונה ← ערימות ← מגרש ציר z פרופיל בתפריט ImageJ.
4. פתח את נתוני היסט כהה, אחד נלקח במראה של ההפניה, אחרים שנלקחו עבור רקמת המוח.
5. לרכוש הספקטרום עבור ההיסטים כהה על ידי פועל התמונה ← ערימות ← מגרש ציר z פרופיל בתפריט ImageJ.
6. שמור כל ספקטרום שנרכשו על-ידי שימוש באפשרויות העתק והדבק .
   הערה: עבור הדמיה SpeRe, שימוש בתחום הדימות המרכזי כדי למזער שיבושים אופטי מהציר מומלץ. הסיבים האקסון עשוי להיות הטרוגניות מבחינה מבנית לכל אורכם. לפיכך, בחירת רועי בקטע האקסון קטן, בדרך כלל < 5 מיקרומטר, כדי למזער את החפץ בנפח חלקי מומלץ.

5. הבסיס תיקון וניתוח האות SpeRe

1. להחסיר ספקטרום ההיסט של הספקטרום של המראה התייחסות ל רקמות המוח.
2. לנרמל בכל קשת על-ידי חלוקת העוצמה המרבית של הספקטרום.
3. לחלק את קשת המנורמל האקסון על ידי הקשת המנורמל של השיקוף הפניה ולחסר DC היסט מהספקטרום מנורמל.
4. למדוד את תדירות מספר גל על ידי התאמת הקשת רכשה את sinusoidal עקומת (ראה טבלה של חומרים) ולאחר מכן להמיר את מספר גל רכשה תקופתיות על-ידי לוקח הדדיים.
5. להמיר את תקופתיות מספר גל קוטר האקסון בעזרת המשוואה איור 4ג'.

תוצאות

לפי הפרוטוקול, פרוסה המוח קבוע הוכן עם צביעת אקסוגני, fluorophore של פילוח מיאלין (ראה טבלה של חומרים). הדמיה SpeRe בוצעה על הפרוסה המוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי היפרספקטרליות מסחרי בשיתוף עם פלורסצנטיות קונאפוקלית הדמיה (איור 4a). עבור SpeRe, עוצמת קלט או?...

Discussion

SpeRe הוא חדש ללא תווית הדמיה מודאליות בהתבסס על אינטרפרומטריה ספקטרלי, המציעה בפעם הראשונה, את המידע הננומטרי בשידור חי ו דנדריטים. בפרוטוקול הנוכחי רכישה, הרזולוציה המרחבית עבור קוטר האקסון הוא מסדר 10 ננומטר. יתר על כן, SpeRe מנצל הזמנות-הגודל של ערכים מינון אור נמוך יותר בהשוואה microscopies סופר ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass cutter	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Nail polish	-	-	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
Apochromat objective 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Water-immersion type
Fluoromyelin Green	Thermo Fisher	F34651	Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.
Leica SP8 TCS microscope	Leica Microsystems	SP8	Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details.
Imaging software	Leica Microsystems	LAS-X	-
Matlab	MathWorks	-	-
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	Coated with protected silver.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Life technologies	14190-136	-
Paraformaldehyde	Biosolution	BP031a	4% v/v in PBS
Cover slip	Thermo Fisher	3306	Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)
Slide glass	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Thickness: ~1 mm
Super glue	Henkel	Loctite 406	Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.
Syringe pump	Brainetree Scientific	BS-8000 DUAL	-
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200S	-
White-light laser	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.