הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

Summary

עבור שליטה יעילה של יתוש נישאים וירוס שידור, הידע של פוטנציאל וקטורי של יתושים בהתאמה הוא עניין מיוחד. אנו מתארים ריור בכפייה כשיטה לנתח מיומנות וקטור של אדס , שלושה taxa כולכית שונים להעברת Zika וירוס.

Abstract

וקטור כשירות מוגדר את הפוטנציאל של זן יתושים לשדר בעקיצות יתוש וירוס (mobovirus) למחשב מארח חוליות. חלקיקי וירוס קיימא מועברים במהלך ארוחה דם דרך הרוק של יתוש נגוע מספיקה. ריור בכפייה מבחני לאפשר קביעת פוטנציאל וקטורי על בסיס יחיד היתושים, הימנעות השימוש של ניסויים בבעלי חיים. השיטה מתאימה לנתח מספר גדול של יתושים בניסוי אחד בתוך תקופה קצרה של זמן. ריור בכפייה מבחני שימשו כדי לנתח 856 יתושים בודדים לכוד בתוך גרמניה, כולל שני שונים כולכית מצויה מצויה biotypes, כולכית torrentium , כמו גם אדס, אשר נדבקו ניסיוניים בווירוס Zika (ZIKV), מודגרות 18 ° C או 27 ° C שניים או שלושה שבועות. התוצאות הצביעו על חוסר כשירות וקטור של taxa שונים כולכית עבור ZIKV. לעומת זאת, אדס היה רגישים ZIKV, אבל רק ב 27 ° C, עם קצב שידור דומה המושבה מעבדה Aedes aegypti נבדקו במקביל.

Introduction

בשנת 2015, Zika וירוס (ZIKV), הקשורים בעקיצות יתוש וירוס (mobovirus) השייך למשפחת Flaviviridae, יצא ב קולומביה וברזיל והתפשטה במהירות ברחבי אמריקה והאיים הקריביים, לגרום מגיפה עם מספרים הבולטים מקרים קליניים של microcephaly, תסמונת גיליאן-ברה¹. היתושים של המין Aedes aegypti ו אדס נחשבים הווקטורים הראשיים והמשניים של ZIKV², אבל גם הוכיחו מינים אחרים של הסוג אאדס יש וקטור ניסיוני מיומנות³ . בניגוד מינים אאדס , לרוב המינים כולכית נבדקו עד כה אינם מסוגלים להעביר את הוירוס⁴. בסך הכל, הנתונים עבור כולכית quinquefasciatus סיפק תוצאות חד משמעיות³. בזמן הנוכחי, מידע חסר על כשירות וקטור יתוש ZIKV בתנאים הטמפרטורה מתונה (< 20 ° C). עם זאת, מידע זה הוא משמעותי עבור הערכות סיכונים אפשריים כפולות באזורים בעלי אקלים ממוזג כגון מרכז אירופה.

וקטור המוסמכים עבור ZIKV הוא מסוגל לרכוש, לתחזק, להגביר, לבסוף לשדר את הוירוס. לכן, בדיקה של יתוש גופות או חלקי הגופות, כולל הרגליים, פיתול, ראש או בלוטות הרוק, ZIKV אינה מספיקה לקבוע וקטור מיומנות. זה הכרחי לבדיקת חלקיקי וירוס זיהומיות בתוך הרוק שפורסמו כדי להעריך את היכולות וקטור, שיעור הזיהום (אינפרא-אדום, מספר הגופות יתוש ZIKV-חיובית לכל מספר של יתושים הנפוחים) וגם קצב השידור (TR, מספר יתושים עם הרוק ZIKV-חיובית לכל מספר הגופות יתוש ZIKV-חיוביים), חייב להיות נחושה. מס הכנסה של יתושים ניתן לנתח בקלות על ידי יתושים פשוט homogenizing ואחריו תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת-טרנסקריפטאז (RT-qPCR) מיקוד ZIKV. יתר על כן, הזיהום ניתן לאפיין עוד יותר על-ידי קביעת המספרים ויראלי עותק לכל יתושים. לעומת זאת, הניתוח של קצב שידור מסתמך על הגילוי של חלקיקי וירוס קיימא על ידי יתושים בודדים. זו יכולה להיות מושגת על ידי האכלה של יתושים נגועים על חיות מארח רגישים, ואחריו הניתוח של viremia מארח⁵. עם זאת, שיטה זו מתבססת על מודל מתאים אורגניזמים, מוגבלים על ידי תקנות רווחת בעלי החיים ולא יקר. כדי למנוע השימוש של חיות מעבדה לניתוח קצב שידור כדי להפחית עלויות, מלאכותי מחדש האכלה מערכות דם טיפות היו תיאר⁶. אולם, בדיקה בסולם בודדים בשילוב עם מספר גבוה של אנשים היא וממושכת. התיאור הראשון של וזמינותו ריור בסולם בודדים פורסם בשנת 1966⁷ , במהלך השנים האחרונות, ריור בכפייה ניסויים הפכו שיטת הבחירה כדי להעריך בדונו וקטור של יתושים^3,8 .

בהתבסס על המחקר את היכולות שלנו וקטור של מרכז אירופיות יתושים שפורסם לאחרונה⁹, נתאר ריור בכפייה כפי שדווח על ידי אנדרסון ואח. ⁸ עם מספר שינויים. שיטה זו מאפשרת תפוקה גבוהה סטנדרטית ניסויים בתנאים רמת אבטחה גבוהה (BSL-3), כולל זיהוי וירוס פעיל על ידי מבחני תרבות המבוססת התא. הניסויים המתוארים כאן כוללים יתושים 856. הם היו נגועים ZIKV על ידי ארוחת דם מלאכותי, לאחר מכן נותחו לנוכחות של חלקיקי וירוס מדבק ברוק. היתושים מוחדרים ניסויים כללה שתי האוכלוסיות מעבדה ותיקה של Ae. aegypti , כולכית מצויה מצויה biotype molestus (Cx. פ molestus), כמו גם שדה נתפס כולכית מצויה מצויה biotype מצויה (עמ' מצויה Cx.), כולכית torrentium (Cx-torrentium), שתי האוכלוסיות Ae. albopictus . למעט אחד של Ae. albopictus שתי האוכלוסיות, אשר נאסף באיטליה, כל היתושים היו שנאספו בגרמניה.

Protocol

1. מכינים יתושים הנשי

1. לאסוף יתושים כלוב גדול על-ידי שימוש של העצמות (כ- 400 יתושים לכל כלוב גדול).
2. עזים ומתנגד היתושים עם פחמן דו-חמצני (CO₂) עבור 7 s.
3. למיין נקבות 20 לכל בקבוקון פלסטיק (Ø 50 מ"מ × 100 מ"מ).
   הערה: אם היתושים מתעורר, השתמש עוד 3 s של CO_2-
4. להרעיב את היתושים בן לילה.

2. ארוחת דם מלאכותי

הערה: כל הפעולות מבוצעות בתנאים BSL-3.

1. להכין את הארוחה דם זיהומיות.
   1. לדלל את המניה וירוס לריכוז פלאק עונה 1 פרק 10⁸ יחידות (PFU) ויוצרים / mL.
      הערה: ריכוז מניות היה נקבע על-ידי ביצוע פעולת שירות במינון 50 זיהום תרביות רקמה (TCID50), המחושב על-ידי ספירמן & Kärber אלגוריתם^10,11.
   2. מיקס שפג תוקפו (שימור דם) דם אנושי מבנק הדם (אינו מתאים אנושיים יותר, אבל שימושי עבור יתושים) עם פרוקטוז (8% פתרון), בפילטר סרום שור (FBS) ואת הפתרון עובד של המניה וירוס (פג האנושי דם: פרוקטוז: FBS: הפתרון עובד = 5:3:1:1).
      הערה: בחרנו דם אדם, כי זה המארח יונק טבעי הידוע של ZIKV.
2. להקפיא µL 140 של שילוב ארוחת דם לצורך ניתוח נוסף באמצעות TCID50.
3. לבצע הזנה מלאכותית באמצעות שיטות האכלה שונים, בהתאם למין:
   1. Aedes aegypti: להשתמש קרום האכלה המערכת במשך 30 דקות (1 מ"ל לכל מזין).
   2. כולכית spp.: לספק את הדם זיהומיות באמצעות מקל צמר גפן בין לילה, לא לחמם את הדם (300 µL לכל מבחנה).
   3. אדס מפוספס: שתי טיפות (50 µL כל) של המיקס ארוחת דם לתוך הבקבוקון פלסטיק וניתן היתושים להאכיל במשך שעתיים. לא לחמם את הדם.
      הערה: יתושים אאכיל הראשון באינטרקום. זמן הדגירה ממושך נחוץ מסיבות בטיחות. טיפות דם מנוקזות לאחר 2 h, שובכך את הסיכון לזיהום מצטמצם במהלך המיון של האכלת יתושים.
4. עזים ומתנגד היתושים עם CO₂ עבור 7 s.
   הערה: אם היתושים מתעורר, השתמש עוד 3 s של CO₂.
5. מיון וספירה צבה מלא יתושים לתוך בקבוקון חדש.
6. להוסיף כרית כותנה, רווי פרוקטוז (8% פתרון) בין המבחנה פקק.
7. לשמור היתושים בטמפרטורה המיועד של 18 ° C או 27 ° C בלחות של 80% 14-21 ימים.
8. להאכיל את הזבובים עם ריפוד כותנה רווי פרוקטוז. לחדש כל 72 h עם 1.5 מ של פרוקטוז (8% פתרון) לכל מבחנה (עד 20 היתושים, בהתאם ההזנה לדרג, ראה שלב 2.5).

3. הכריחו ריור Assay ביום 14 או 21

הערה: כל הפעולות מבוצעות בתנאים BSL-3.

1. 2 x 10⁴ Vero תאי זרע / לכל טוב ב- 96 ובכן צלחת עם 200 µL של מדיום הגידול (Dulbecco´s שונה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 3% FBS, פניצילין U/mL 100, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, 5 µg/mL המפוטריצין, 2 מ מגלוטמין חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1% (NEAA), 1% נתרן פירובט).
2. הכן את התקן ריור:
   1. מניחים צלחת זכוכית בריבוע (20 × 20 ס מ) על הספסל ב זווית של 30 מעלות.
      הערה: זה נחוץ בשל תראי במעבדה בטיחות. אם הצלחת אופקי או אנכי, נוזל ידלוף.
   2. במקום פעמיים דבק צדדית על גבי לוח הזכוכית.
   3. תפקיד החימר דוגמנות עד שהוא מגיע בקוטר של 0.5 ס מ ולחבר אותו אופקית 1 ס מ מן הקלטת דבק דו צדדי.
   4. חתוך את 0.3 ס מ הראשון של הקצה של קצה מסנן 10 µL.
      הערה: מומלץ להכין את זה לפני תחילת הניסוי מחוץ למעבדה אבטחה.
   5. למלא את הטיפים מסנן 10 µL של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS, pH 7.4).
   6. מניחים את הטיפים מסנן על החימר דוגמנות עם הקצה לקראת הקלטת דביק.
   7. אבטח את הטיפים מסנן עם לחץ עדין.
3. הכן את היתושים:
   1. עזים ומתנגד היתושים עם CO₂.
   2. הסר את הרגליים ואת כנפיים כדי לשתק את היתושים.
   3. לתקן את היתוש חי גופות בקלטת דביק מעל טיפ מסנן.
   4. הנח את חוטם בעדינות לתוך קצה מסנן.
   5. הפעל וזמינותו ריור למשך 30 דקות.
   6. הסר את הטיפים מסנן ולמחוק את קליי ואת הסרט.

4. עיבוד של רוק

הערה: השלבים 4.1 – 4.6.2 מבוצעות בתנאים BSL-3.

1. לגרש את התוכן לתוך הצינורות התגובה המכיל 10 µL ל- PBS.
2. לערבב בעדינות, להעביר את התוכן לתוך הבארות של הלוח מוכן היטב 96 באמצעות באר אחת עבור דגימה.
3. תקופת דגירה לצלחת של 7 ימים ב 37 ° C עם 5% CO₂.
4. השתמש התאום כדי לבדוק את התאים לנוכחות של אפקט ציטופתי (CPE).
5. אם גם הוא חיובי עבור CPE, לקצור את תגובת שיקוע על-ידי pipetting 140 µL לתוך צינור התגובה לחילוץ RNA.
6. לטהר את הרנ א באמצעות ערכת חילוץ RNA.
   1. µL 140 מיקס של תגובת שיקוע עם µL 560 של AVL מאגר (פירוק ויראלי מאגר), תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. הוסף µL 560 של אתנול (96%) ו מערבולת המדגם.
      הערה: הדוגמאות הן לא פעיל לאחר שלב זה, יכול להיות משוחרר מחוץ למעבדה BSL-3.
   3. Pipet 630 µL של המדגם על עמודה בעלת צנטריפוגה עם 6,000 x g עבור 1 דקות.
   4. למחוק את פילטרט של, pipet µL 630 הנותרים על העמודה וחזור על צנטריפוגה.
   5. לשטוף את הרנ א, חייב הקרום של העמודה, על-ידי הוספת µL 500 לרחוץ את מאגר 1 עמודה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות.
   6. למחוק את הצינור אוסף ולמקם את העמודה לתוך צינור אוסף חדש. להוסיף 500 µL כביסה מאגר 2 ו צנטריפוגה ב x 12,500 g למשך 3 דקות.
   7. למחוק את הצינור אוסף ולמקם את העמודה לתוך צינור התגובה 1.5 mL.
   8. הוסף µL 50 • תנאי מאגר ' תקופת דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר.
   9. צנטריפוגה ב x 6,000 g עבור 1 דקות ולאחר מכן למחוק את העמודה.
7. לנתח את הדגימות עבור ZIKV RNA באמצעות RT-qPCR.

5. עיבוד של גופים יתוש

הערה: השלבים 5.1 – 5.5 מבוצעות בתנאים BSL-3.

1. הסר את הגופות של היתוש ומניחים כל גוף לתוך צינור התגובה.
   הערה: זה אפשרי להשהות את הניסוי בשלב זה ולאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.
2. להוסיף 500 µL של התקשורת המגון (DMEM ללא כל supplementals) לתוך הצינור התגובה.
3. Homogenize על הגוף באמצעות מנוע במיקסר ולהשתמש פיסטיל חדש עבור כל דגימה.
4. להוסיף 200 µL של homogenate 96-ובכן-צלחת לטיהור.
   הערה: זה אפשרי להשהות את הניסוי בשלב זה ולאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.
5. בטל את הצלחת על ידי הדגירה למשך 60 דקות ב 60 מעלות צלזיוס.
6. לטהר את הרנ א על ידי טיהור חומצת גרעין אוטומטית.
   הערה: זה אפשרי להשהות את הניסוי בשלב זה ולאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.

6. ניתוח

1. לכמת את העותקים RNA נגיפי באמצעות RT-qPCR.
   הערה: העותקים RNA היו בממוצע על כל הגופים יתוש ZIKV-חיוביים וללא כולל את היתושים ZIKV-שלילי.
2. חישוב IR, כהגדרתו מספר הגופות יתוש ZIKV-חיובית לכל מספר נקבות נמאס.
3. לחשב את TR, הגדיר את המספר של יתושים עם הרוק ZIKV-חיובית לכל מספר חיובי ZIKV יתושים הגופות. לא ניתן לחשב קצב השידור עבור שילובי מינים-הטמפרטורה ללא גוף ZIKV-חיוביות.

תוצאות

Aedes aegypti ידועה כמו וקטור המוסמכת ZIKV לפחות תחת תנאי אקלים טרופי¹². לכן, אנחנו משתמשים Ae. aegypti כפקד חיובי להקים וזמינותו לנתח מס הכנסה, כמו גם TRs-בטמפרטורת דגירה של 27 ° C ולחות של 80%. IR ו TR הוגדרו תיאר כאמור מאת פורטונה ואח. ¹³. תיגר Ae. aegypti הראה IR של 50% ו 72% ו TR של 42% ו- 31%-14 ל-21 יום פוסט זיהום (dpi), בהתאמה (איור 1A ו 1B). לאחר מכן, יתושים האירופית נבדקו עבור זיהום ZIKV ושידור באמצעות תנאי אקלים טרופי, כמו גם ממוזג.

בטמפרטורת דגירה 27 ° C, מינים יתושים כל הראו זיהום ZIKV 14 dpi, כמו גם dpi 21, למעט יחידים Cx. עמ' מצויה ו- Cx-torrentium , אשר היו חיוביות ב- 14 dpi בלבד. כל המינים אאדס הראה מס הכנסה גבוה יותר (בין 50% ל- 72%) כמו גם ריכוז גבוה יותר של RNA נגיפי (10⁶ עד 10 דגימות עותקים/יתוש⁹ RNA) בהשוואה taxa שונים כולכית , שחשף מס הכנסה הנעים בין 0 % ו-32% והמון ויראלי של 10³ -10⁴ RNA עותקים/יתוש דגימות. כל המינים אאדס מוצג ZIKV-חיוביות רוק (TR 13 – 42%), בעוד אף אחד דגימות רוק מן taxa כולכית הכילה ZIKV (איור 1A ו 1B). מעניין, קצב שידור ב- 21 dpi היו דומים ב Ae. aegypti ו Ae. albopictus מגרמניה (30%), אך היו נמוכות משמעותית ב- Ae. albopictus מאיטליה (13%).

דגירה של יתושים מאותגר בטמפרטורה מתונה של 18 ° C נחשף בדרך כלל וירוס התחתון טוען המין Aedes (10⁴–10⁶ RNA עותקים/יתושים) וכן את taxa כולכית שונים (10^{2 –}10⁴ RNA עותקים/יתושים). עם זאת, בטמפרטורת דגירה 18 ° C, שידור של ZIKV נצפתה לא עבור כל המינים יתושים חקר.

איור 1: קצב שידור של יתושים נגועים השפעול ZIKV. תוצאות של מחקרים כשירות וקטור עם ZIKV במינים שונים נגד יתושים. 6 taxa יתושים שונים היו נגועים ZIKV, מודגרות עד 27 ° C או 18 ° C 14 (א) או 21 ימים (B). TR מוגדר כמספר של יתושים עם הרוק ZIKV-חיובית לכל מספר חיובי ZIKV יתושים הגופות. המספר הכולל של יתושים חקר היה 856, עם מינימום של 30 אנשים בגין taxa נקודה/טמפרטורה/יתושים כל הזמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

בעבר הוכח כי התוצאות המתקבלות עם ריור בכפייה עולים בקנה אחד עם קלאסית ניסויים מחדש האכלה⁶. עם זאת, מחדש האכלה ניסויים והן בשיטה שלנו הציג ריור בכפייה, זה בלתי אפשרי ישירות הוכחה פעילות ריור או לפקח על שחרורו של הרוק. כדי להוכיח פעילות ריור, דגימות נבדק עבור רכיבים אחרים להציג הרוק (למשל., חלבונים, פחמימות, וכו '.). יתר על כן, qPCRs נוספים תאפשר איתור נגיפי RNA עותקים. זאת, לעומת זאת, דורשת פיצול של דגימות רוק עבור ניתוחים שונים, אשר עשוי להגביל רגישות בשן וזמינותו תרבות תא במקרה של מספרי החלקיקים נמוך מאוד. בתורו, זה עלול להוביל underestimation של קצב שידור נחוש.

לתוצאות לשחזור, זה הכרחי להבטיח כי כל היתושים להישאר בחיים עד סוף הניסוי. זה נשלטת על ידי חזותית ניטור פעילות תנועת הגוף של היתושים. בנוסף, השימוש בעיקרון וזמינותו ריור עבור זן יתושים נתון יש להיבדק על ידי האכלה לשלוט וירוסים, אשר ידועים להיות מועבר על ידי מינים יתושים הספציפי הזה. ולהיפך, כל וירוס מוחדרים ניסוי צריך להיבחן. יתוש רגישים.

מבחני ריור בכפייה יש יתרונות רבים. מספר גבוה של יתושים יכול להיבדק בו זמנית על להצטננות הבסיס בתנאים מתוקננים מבוקרים מבלי לגרום להתנגשויות עם תקנות רווחת בעלי חיים⁹.

השיטה משמשת מספר מעבדות. עם זאת, כיוונוני המדויק עשויים להיות שונים, אשר יכול להוביל הבדלים בתוצאות בין מעבדות. מרכיב קריטי אחד הוא נימי כדי לאסוף את הרוק, אשר יכול להיות עשוי זכוכית¹⁴ או פלסטיק¹⁵. עמידה בהוראות הבטיחות גבוהה של insectary רמה 3 אבטחה, השתמשנו טיפים מסנן מפלסטיק במקום נימי זכוכית, ובכך להקטין את הסיכון לפציעות. יתר על כן, מסנן טיפים יש יתרון כי הנוזל נאסף ניתן בקלות להעביר באמצעות פיפטה.

ההתקנה של וזמינותו ריור בכפייה המובאת כאן מבוסס על שני החוקרים עובדים ביחד ושיתוף חובות. Demobilizing של היתוש מבוצעת על ידי אדם אחד, בעוד השני בו זמנית מכין את הכיוונון ריור בכפייה. זו מפחיתה את זמן הטיפול, ממזער את הסיכון באופן משמעותי מדגם מיתוג כמו שינוי בין שהשתחררתי-העבודה ריור-הצלחת אינה נחוצה. יתר על כן, היא מאפשרת הצבת היתושים על המכשיר ריור בכפייה מיד אחרי שהשתחררתי. יתוש הקצרים זה טיפול זמן חיוני מוצלחת ריור בכפייה. לבסוף, היתושים ניתן לנטר באופן ישיר על תנועתיות לאורך כל הניסוי כולו.

וזמינותו ריור המובאת כאן משמש כדי לקבל תובנות לגבי הפוטנציאל וקטור של מינים יתושים. עם זאת, כדי לענות על שאלות ספציפיות אחרות (למשל., המספרים של עקיצות יתושים הדרושות כדי להדביק בעלי חוליות), חיה ניסויים עדיין ייתכן שיהיה צורך.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inject+matic Sleeper	Inject+matic
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage	BugDorm Store
Drosophila cultivation tubes	carl roth	PK11.2	plastic vial for mosquitoes
Plug for drosophila cultivation tubes	carl roth	PK15.1
Constant climate chamber	Binder	KBF-240
Blood			banked human blood, expired, not usable for medical application
Dumont-Pincette Electronic SS	Dumont	B40c
Vero cells	BNITM
Flash light aspirator	Bioquip	2809
double-sided adhesive tape			no specific provider
Gammex Powder-free gloves with AMT	Ansell		for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit	altona diagnostics	591013
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit	Thermo fisher scientific	4462359	RNA isolation of mosquito bodies
Qiamp viral RNA Mini Kit	Qiagen	52906	RNA-Isolation of supernatant
filter tips (20 µL)	Sarstedt	701,116,210	Cut the first 3 mm of the tip
hand motor mixer	carl roth	sold out
micro pestles for hand motor mixer	carl roth	CXH8.1
DMEM		P0403550
L Glutamine Penicilin/Streptomycin	PAN	P0819100
Amphotericin B	PAN	P06-0110
Fructose	carl roth	4981.5
Phosphate buffered saline	PAN	P04-36500
FBS	PAN
Sodium Pyruvat	PAN	P0443100
MEM NAA	PAN	P0832100
Hemotek Feeder	Hemotek	PS6
Light Cycler	Roche	480 II
Light Cycler Software	Roche	480 SW 1.5.1
Modeling clay			no specific provider
King Fisher Flex Purification System	ThermoFisher scientific
Aedes albopictus			eggs were collected in Freiburg, Germany
Binocular	MOTIC	SMZ-168
Binocular light	MOTIC	MLC-150C
CO2-Incubator	Thermo scientific	MIDI 40