모기의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 타 액 분 비를 강제

요약

모기 품 어진 바이러스 전송의 효율적인 제어를 위해 각각 모기의 벡터 잠재력의 지식은 특정 관심의 이다. 우리는 Aedes albopictus Zika 바이러스의 전송에 대 한 3 개의 다른 Culex taxa의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 강제 타 액 분 비를 설명 합니다.

초록

벡터 적성 척추 호스트 모기 품 어진 바이러스 (mobovirus)를 전송 하는 모기의 잠재력으로 정의 됩니다. 가능한 바이러스 입자는 감염 된 모기의 타 액을 통해 혈액 식사 동안 전송 됩니다. 강제 타 액 분 비 분석 실험 동물 실험의 사용을 피하고 단일 모기 기초 벡터 잠재력을 결정 하실 수 있습니다. 메서드는 시간의 짧은 기간 내에 한 실험에서 모기의 많은 수를 분석 하는 적당 한. 강제 타 액 분 비 분석 실험 두 가지를 포함 하 여 독일에 갇혀 856 개별 모기를 분석 하는 데 사용 했다 Culex pipiens pipiens biotypes, 뿐만 아니라 실험적으로 감염 했다 Aedes albopictus Culex torrentium Zika 바이러스 (ZIKV)와 18 ° C에서 27 ° C 2, 3 주 동안 incubated 하 고. 결과 ZIKV에 대 한 다른 Culex taxa의 벡터 역량의 부족을 표시. 반면, Aedes albopictus 하지만 동시에 테스트 하는 Aedes aegypti 실험실 식민지와 유사한 전송 속도와 27 ° C에서 ZIKV에 취약 했다.

서문

2015 년, Zika 바이러스 (ZIKV), 가족 Flaviviridae, 콜롬비아와 브라질에서 등장 하 고 주목할 만한 수의 전염병을 일으키는 아메리카 및 카리브 해, 급속 하 게 확산에 속하는 모기 품 어진 바이러스 (mobovirus) 관련 임상 케이스 microcephaly의 Guillain-바레 증후군¹. 종의 Aedes aegypti , Aedes albopictus 모기 ZIKV², 기본 및 보조 벡터 간주 됩니다 하지만 다른 종의 속 Aedes 또한 실험 벡터 능력^{3 입증} . Aedes 종 달리 Culex 종 지금까지 테스트의 대부분은 바이러스⁴전송 수 없습니다. 단지, Culex quinquefasciatus 에 대 한 데이터 제공 불확실 결과³. 현재, 정보 부족 한 모기 벡터 적성에 ZIKV에 대 한 온건한 온도 조건 하에서 (< 20 ° C). 그러나,이 정보는 중앙 유럽 등 온대 기후 지역에 가능한 퍼짐의 위험 평가 대 한 상당한.

ZIKV에 대 한 유능한 벡터는 취득 하 고, 유지 하 고, 증폭 하 고 마지막으로 바이러스를 전송 수 있습니다. 따라서, 테스트 모기 시체 또는 시체의 부분, 다리, midgut, 머리 또는 침 샘를 포함 하 여 ZIKV에 대 한 충분 하지 않습니다 벡터 역량을 확인 하. 그것은 출시 된 타 액 내 감염 성 바이러스 입자에 대 한 테스트 필수입니다. 벡터 역량 평가, 감염 율 (IR, 부풀어 오른된 모기의 수 ZIKV 양성 모기 시체의 수)와 전송 속도 (TR, ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수), 될 필요가 확인 했습니다. 모기의 국세청은 단순히 균질 화 모기는 역전사 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량)에 의해 다음에 의해 쉽게 분석 될 수 있다 ZIKV를 대상으로. 또한, 감염 모기 당 바이러스 복사본 번호를 확인 하 여 추가 특징 될 수 있습니다. 대조적으로, 전송 속도의 분석 개별 모기의 타 액에 있는 가능한 바이러스 입자의 검출에 의존합니다. 이 호스트⁵에 니의 분석 이어서 취약 호스트 동물에 감염 된 모기의 먹이로 달성 될 수 있다. 그러나,이 방법은 적당 한 모델 생물에 의존 하며 비용과 동물 복지 규정에 의해 제한 된. 전송 속도 분석 하기 위한 실험 동물의 사용을 방지 하 고 비용을 줄이기 위해 다시 먹이 시스템 인공 혈액 작은 물방울 되어를 사용 하 여 설명⁶. 그러나, 개인의 높은 숫자와 함께 개별 규모 테스트는 어렵고입니다. 개별 규모에 타 액 분 비 분석 결과의 첫 번째 설명 1966⁷ 에 출판 되었음 및 최근 몇 년 동안 강제 타 액 분 비 실험 방법의 선택 모기^{3,8의 벡터 역량을 평가 하 되} .

따라 중앙 유럽의 우리의 벡터 능력 연구에 모기 최근에 출판 된⁹, 앤더슨 외에서 보고 우리 강제 타 액 분 비를 설명. 몇 가지 수정 ⁸ . 이 메서드는 표준화 하는 높은 처리량 높은 biosafety 수준 조건 (BSL-3)에서 실험 및 세포 기반 문화 분석 실험에 의해 활성 바이러스의 식별을 포함 수 있습니다. 여기에 설명 된 실험 856 모기를 포함 한다. 그들은 인공 혈액 식사에 의해 ZIKV에 감염 되었고 그 후 타 액에서 감염 성 바이러스 입자의 존재에 대 한 분석. 필드와 Ae aegypti 와 Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus)의 실험 구성 두 개의 오래 된 실험실 인구에 모기 잡은 Culex pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx torrentium)와 두 개의 Ae albopictus 인구. 이탈리아에서 수집 된, 두 개의 Ae albopictus 인구 중 하나를 제외한 모든 모기 독일에서 수집 했다.

프로토콜

1. 준비 여성 모기

1. 흡 인기 (큰 감 금 소 당 약 400 모기)를 사용 하 여 큰 케이지에서 모기를 수집 합니다.
2. 7에 대 한 이산화탄소 (CO₂)와 모기 anesthetize s.
3. 플라스틱 병 당 20 여성을 정렬 (Ø 50 m m × 100 mm).
   참고: 모기 일어나, 다른 3 사용의 s_2.
4. 밤새 모기 굶 어.

2. 인공 혈액 식사

참고: 모든 단계는 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.

1. 전염 성 혈액 식사를 준비 합니다.
   1. 1 x 10⁸ 플 라크 형성 단위 (PFU)의 농도에 바이러스 주식 희석 / mL.
      참고: 재고 농도 조직 문화 감염 복용량 50 방법 (TCID50)를 수행 하 여 결정 되었고 Spearman & Kärber 알고리즘^10,11계산.
   2. 혼합 혈액 은행에서 인간의 혈액 (혈액 보존) 만료 (에 적합 하지 않은 모기에 대 한 유용 하지만, 더 이상 인간)과 당 (8% 솔루션), 만들어지고 소 혈 청 (FBS)와 바이러스의 작업 솔루션 (인간의 혈액:과 당: FBS 만료: 작업 솔루션 = 5:3:1:1).
      참고: 우리 때문에 이것이 알려진된 자연 포유동물 호스트 ZIKV의 인간의 혈액 선택.
2. 혈액 식사 혼합 TCID50 통해 추가 분석을 위해의 140 µ L를 고정 합니다.
3. 인공 먹이 종에 따라 다른 먹이 방법을 사용 하 여 수행.
   1. Aedes aegypti: 막 먹이 30 분 (1 mL 당 급지대) 시스템을 사용 하 여.
   2. Culex 종: 밤새 면 스틱을 통해 감염 혈액을 제공 하 고 피 (병 당 300 µ L) 따뜻한 하지 않습니다.
   3. Aedes albopictus: 플라스틱 유리병으로 혈액 식사 혼합의 두 방울 (50 µ L 각)을 넣어 고 모기 2 h에 대 한 피드. 혈액 따뜻한 하지 않습니다.
      참고: 모기는 첫번째 15 분에 공급 합니다. 연장된 보육 시간은 안전 상의 이유로 인해 필요 합니다. 혈액 방울 2 h, 따라서 오염 위험의 정렬 하는 동안 감소 된다 모기 먹이 후 배수는 한다.
4. 7 공동₂ 모기 anesthetize s.
   참고: 경우 모기 일어나 사용 하 여 다른 3 CO₂의 s.
5. 정렬 및 카운트 완전히 부풀어 오른 모기 새로운 유리병에.
6. 면 패드, 유리병 및 플러그 사이 (8% 솔루션)과 포화 상태를 추가 합니다.
7. 14 또는 21 일 동안 18 ° C 또는 80%의 습도에서 27 ° C의 지정 된 온도에서 모기를 유지.
8. 과 포화 목화 패드와 함께 모기를 피드. 모든 72 h 1.5 mL 유리병 당과 당 (8% 솔루션)의 보충 (20 모기까지 먹이 따라 속도, 단계 2.5 참조).

3. 강제 14 또는 21 일에 타 액 분 비 분석 실험

참고: 모든 단계는 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.

1. 2 × 10⁴ Vero 세포 씨앗/는 96에 잘 당 잘 성장 매체 (Dulbecco´s 수정이 글 중간 (DMEM) 3 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스, 5 µ g/mL 암포 B, 2 mM L-글루타민 보충의 200 µ L 플레이트 1% 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 1% 나트륨 pyruvate).
2. 타 액 분 비 장치를 준비:
   1. 30 °의 각에서 벤치에 제곱된 유리 접시 (20 × 20 cm)를 배치 합니다.
      참고:이 안전 실험실에서 underpressure 때문. 접시는 수평 또는 수직, 액체 누출 됩니다.
   2. 이중 양면된 접착 테이프는 유리 접시 위에 놓습니다.
   3. 역할까지 모델링 점토 0.5 cm의 직경을 도달 하 고 가로 1cm 양면 접착 테이프에서 연결.
   4. 10 µ L 필터 팁의 팁의 첫 번째 0.3 cm을 잘라.
      참고: biosafety 실험실 외부 실험을 시작 하기 전에 이것을 준비 합시다.
   5. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS, pH 7.4)의 10 µ L로 필터 팁을 채우십시오.
   6. 스티커 테이프 쪽으로 팁 모델링 점토에 필터 팁을 놓습니다.
   7. 부드러운 압력으로 필터 팁 보안.
3. 모기를 준비:
   1. CO₂모기 anesthetize
   2. 다리와 날개 무력화 모기를 제거 합니다.
   3. 필터 팁 위에 스티커 테이프에 생활 모기 시체를 수정 합니다.
   4. 장소 필터 팁으로 부드럽게 코입니다.
   5. 30 분에 대 한 타 액 분 비 분석 실험을 실행 합니다.
   6. 필터 팁을 제거 하 고 점토와 테이프 폐기.

4입니다. 타 액의 처리

참고: 단계 4.1-4.6.2 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.

1. PBS의 10 µ L을 포함 하는 반응 튜브에 내용을 추방.
2. 부드럽게 혼합 하 고 사용 하 여 샘플 당 하나 잘 준비 96 잘 접시의 우물으로 콘텐츠를 전송.
3. 5% CO₂와 37 ° C에서 7 일 동안 접시를 품 어.
4. Cytopathic 효과 (CPE)의 존재에 대 한 셀을 확인 하는 쌍안경을 사용 합니다.
5. 잘 CPE에 대 한 긍정적인 경우에, RNA 추출에 대 한 반응 관에는 상쾌한 pipetting 140 µ L에 의해 수확.
6. RNA 추출 키트를 사용 하 여 RNA를 정화.
   1. AVL의 560 µ L로는 상쾌한의 믹스 140 µ L (바이러스 성 세포의 용 해 버퍼)를 버퍼링 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
   2. 에탄올 (96%)와 소용돌이 샘플의 560 µ L를 추가 합니다.
      참고: 샘플이이 단계 후 비활성화 하 고 BSL-3 실험실에서 출력 될 수 있습니다.
   3. 피펫으로 630 µ L 열에 1 분 동안 6000 x g으로 원심 분리기 샘플의.
   4. 여과 액을 피펫으로 열에 나머지 630 µ L 삭제 하 고는 원심 분리를 반복 합니다.
   5. RNA를 세척, 6000 x g 1 분에서 버퍼 1 열 및 분리기 세척의 500 µ L을 추가 하 여 열의 막에 바인딩된.
   6. 컬렉션 튜브를 버리고 고 열 새로운 컬렉션 튜브를 합니다. 12500 x g 3 분 동안에 500 µ L 세척 버퍼 2와 원심 분리기를 추가 합니다.
   7. 컬렉션 튜브를 버리고 고 열 1.5 mL 반응 관 합니다.
   8. 차입 버퍼의 50 µ L을 추가 하 고 실 온에서 1 분 동안 품 어.
   9. 1 분 동안 6000 x g 에서 centrifuge 고 열을 삭제.
7. 실시간 정량 Pcr을 통해 ZIKV RNA에 대 한 샘플을 분석 합니다.

5. 모기 시체의 처리

참고: 단계 5.1-5.5 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.

1. 모기의 시체를 제거 하 고 각 신체 반응 관에 배치.
   참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는
2. 반응 관에 균질 미디어 (어떤 supplementals 없이 DMEM)의 500 µ L를 추가 합니다.
3. 손 모터 믹서를 사용 하 여 본문을 균질 하 고 모든 샘플에 대 한 새로운 암 꽃 술을 사용 합니다.
4. 96 잘 접시 정화에 대 한에 homogenate의 200 µ L를 추가 합니다.
   참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는
5. 60 분 60 ° c.에 외피에 의해 접시를 비활성화
6. 자동화 된 핵 산 정화 하 여 RNA를 정화.
   참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는

6입니다. 분석

1. 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 바이러스 성 RNA 복사본 계량.
   참고: RNA 복사본에는 모든 ZIKV 양성 모기 시체와 ZIKV 부정적인 모기를 포함 하지 않고 평균 했다.
2. IR, ZIKV 양성 모기 시체 수가 먹이 여성 당 수로 정의 계산 합니다.
3. TR, ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수를 계산 합니다. 전송 속도 없음 ZIKV 양성 기관과 종 온도 조합에 대 한 계산 되지 않을 수 있습니다.

결과

Aedes aegypti 알려져 있다 유능한 벡터로 ZIKV 이상 열 대 기후 조건¹²에서. 따라서, 우리 사용 Ae aegypti 긍정적인 컨트롤로 분석 결과 설정 하 고 국세청 27 ° C의 외피 온도 80%의 습도에서 TRs 분석. IR 및 TR 앞에서 설명한 포 외에 의해 정의 되었다. ¹³. 도전 Ae aegypti 각각 감염 (dpi), 게시 하는 IR 50%와 72%와 42%, 14, 21 일에 31%의 TR을 보여주었다 (그림 1A 및 1B). 그 후, 유럽 모기 ZIKV 감염 및 전송 뿐만 아니라 온화한 열 대 기후 조건을 사용 하 여 테스트 되었습니다.

27 ° C 부 화 온도에서 모든 모기 종 14 dpi 14 dpi만에서 긍정 했다 Cx. p. pipiens 및 Cx torrentium 개인을 제외 하 고 21 dpi에서 ZIKV 감염을 보였다. 모든 Aedes 종 높은 바이러스 성 RNA 농도 뿐만 아니라 높은 국세청 (사이 50% 및 72%)을 보였다 (10⁶ 10⁹ RNA 복사본/모기 표본까지)는 0 사이 배열 하는 국세청을 밝혀 다른 Culex taxa에 비해 % 그리고 32%와 10 바이러스 부하³ 10⁴ RNA 복사본/모기 표본. 모든 Aedes 종 Culex taxa에서 타 액 샘플의 ZIKV (그림 1A 및 1B)을 포함 하는 반면 ZIKV 양성 침 (TR 13-42%), 표시. 흥미롭게도, 21 dpi에서 전송 속도 Ae aegypti 및 Ae albopictus 독일 (30%)에서 유사 했다 하지만 이탈리아에서 Ae albopictus 에 실질적으로 더 낮은 (13%) 했다.

인큐베이션 18 ° C의 적당 한 온도에 도전된 모기의 일반적으로 낮은 바이러스 로드 Aedes 종 (10⁴– 10⁶ RNA 복사본/모기) 뿐만 아니라 다른 Culex taxa (10^2-10^{4 공개} RNA 복사본/모기). 18 ° C 부 화 온도에서 ZIKV의 전송 하지 조사 모기 종에 대 한 관찰 되었다.

그림 1: 전송 속도 ZIKV 실험적으로 감염 하는 모기의. 다른 모기 종에 ZIKV 가진 벡터 능력 학문의 결과. 6 다른 모기 taxa ZIKV에 감염 되었고 27 ° C 또는 18 ° C 14 (A) 또는 (B) 21 일 알을 품을. TR은 ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수로 정의 됩니다. 조사 하는 모기의 총 수는 856, 각 시간 포인트/온도/모기 taxa에 30 개인의 최소 이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

그것은 이전 강제 타 액 분 비와 함께 얻은 결과 고전 다시 먹이 실험⁶라인 표시 되었습니다. 그러나, 다시 실험을 먹이 강제 타 액 분 비의 우리의 제시 방법에서, 직접 타 액 분 비 활동 증거 또는 타 액의 릴리스를 모니터링 수는 없습니다. 증명 하기 위해 타 액 분 비 활동, 샘플 시험 될 수 있었다 다른 구성 요소는 타 액에 존재 하는 위해 (예., 단백질, 탄수화물, 등.). 또한, 추가 qPCRs 바이러스 성 RNA 사본의 감지를 수 있습니다. 그러나 이것은,, 셀 문화 분석 결과 매우 낮은 입자 번호 경우에 민감도 제한할 수 있습니다 다양 한 분석에 대 한 타 액 샘플의 분할 필요 합니다. 차례 차례로,이 과소 결정된 전송 속도의 발생할 수 있습니다.

재현 가능한 결과 위해 그것은 모든 모기는 실험의 끝까지 살아 남기 위해 필요한입니다. 이것은 시각적으로 모기의 몸 운동 활동을 모니터링 하 여 제어 됩니다. 또한, 주어진된 모기 종에 대 한 타 액 분 비 분석 실험의 원리 사용 제어 바이러스,이 특정 모기 종에 의해 전송 될 알려진 먹이로 테스트할 수 있다. 반대로, 실험에 도입 하는 모든 바이러스 감염 모기에서 테스트할 수 있다.

강제 타 액 분 비 분석 실험은 많은 이점이 있다. 모기의 높은 숫자를 동시에 제어 표준화 된 조건 하에서 기본 단일 표본에 동물 복지 규정⁹와 충돌 하지 않고 테스트할 수 있습니다.

메서드는 여러 실험실에 의해 사용 됩니다. 그러나, 정확한 설정을 달라질 수 있습니다, 실험실 사이 결과에 차이를 낼 수 있는. 하나의 중요 한 구성 요소는 유리¹⁴ 또는 플라스틱¹⁵의 만들 수 있는 타 액을 수집 하는 모 세관. Biosafety 수준 3 insectary의 높은 안전 규정을 준수, 우리 플라스틱 필터 팁 대신 사용 유리 모 세관, 상해의 위험 감소. 또한, 필터 팁을 수집된 액체 쉽게 옮겨질 수는 피 펫을 사용 하 여 하는 이점이 있다.

여기에 제시 된 강제 타 액 분 비 분석 실험의 설치 두 조사 협력 및 업무 공유를 기반으로 합니다. 모기의 demobilizing 다른 동시에 강제 타 액 분 비 설치를 준비 하는 동안 한 사람에 의해 수행 됩니다. 이 크게 처리 시간을 단축 하 고 위험을 최소화 샘플의 철거 작업 환경 및 타 액 분 비 판 사이 변경으로 전환 필요 하지 않습니다. 또한, 제 대 직후 강제 타 액 분 비 장치에 모기를 배치 하는 수 있습니다. 처리 시간이 오히려 짧은 모기 성공적인 강제 타 액 분 비에 필수적 이다. 마지막으로, 모기는 모든 실험을 통해 운동에 대 한 직접 모니터링할 수 있습니다.

여기에 제시 된 타 액 분 비 분석 결과 모기 종의 벡터 잠재력에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 몇 가지 구체적인 질문에 대답 (예., 척추 동물을 감염 하는 데 필요한 모기 물린의 숫자), 동물 실험 필요 수.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inject+matic Sleeper	Inject+matic
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage	BugDorm Store
Drosophila cultivation tubes	carl roth	PK11.2	plastic vial for mosquitoes
Plug for drosophila cultivation tubes	carl roth	PK15.1
Constant climate chamber	Binder	KBF-240
Blood			banked human blood, expired, not usable for medical application
Dumont-Pincette Electronic SS	Dumont	B40c
Vero cells	BNITM
Flash light aspirator	Bioquip	2809
double-sided adhesive tape			no specific provider
Gammex Powder-free gloves with AMT	Ansell		for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit	altona diagnostics	591013
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit	Thermo fisher scientific	4462359	RNA isolation of mosquito bodies
Qiamp viral RNA Mini Kit	Qiagen	52906	RNA-Isolation of supernatant
filter tips (20 µL)	Sarstedt	701,116,210	Cut the first 3 mm of the tip
hand motor mixer	carl roth	sold out
micro pestles for hand motor mixer	carl roth	CXH8.1
DMEM		P0403550
L Glutamine Penicilin/Streptomycin	PAN	P0819100
Amphotericin B	PAN	P06-0110
Fructose	carl roth	4981.5
Phosphate buffered saline	PAN	P04-36500
FBS	PAN
Sodium Pyruvat	PAN	P0443100
MEM NAA	PAN	P0832100
Hemotek Feeder	Hemotek	PS6
Light Cycler	Roche	480 II
Light Cycler Software	Roche	480 SW 1.5.1
Modeling clay			no specific provider
King Fisher Flex Purification System	ThermoFisher scientific
Aedes albopictus			eggs were collected in Freiburg, Germany
Binocular	MOTIC	SMZ-168
Binocular light	MOTIC	MLC-150C
CO2-Incubator	Thermo scientific	MIDI 40