Forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos

Resumo

Controlo eficaz de transmissão do vírus a cargo de mosquito, o conhecimento do potencial vetor de respectivos mosquitos é de particular interesse. Descrevemos a salivação forçada como um método para analisar a competência vetorial do Aedes albopictus e três táxons de Culex diferentes para a transmissão de vírus Zika.

Resumo

Competência de vetor é definida como o potencial de uma espécie de mosquito para transmitir um vírus transmitidas por mosquitos (mobovirus) para um hospedeiro vertebrado. Partículas de vírus viáveis são transmitidas durante uma refeição de sangue através da saliva de um mosquito infectado. Ensaios de salivação forçada permitem determinar o potencial de vetor com base único mosquitos, evitando o uso de experiências com animais. O método é adequado para analisar um grande número de mosquitos em um experimento dentro de um curto período de tempo. Ensaios de salivação forçado foram usados para analisar 856 mosquitos individuais presos na Alemanha, incluindo dois diferentes biótipos de Culex pipiens pipiens , Culex torrentium , bem como Aedes albopictus, que foram infectados experimentalmente com vírus Zika (ZIKV) e incubados a 18 ° C ou 27 ° C, para duas e três semanas. Os resultados indicaram a falta de competência vetorial dos diferentes táxons Culex para ZIKV. Em contraste, o Aedes albopictus foi suscetível a ZIKV, mas apenas a 27 ° C, com taxas de transmissão semelhantes a uma colônia de laboratório Aedes aegypti testada em paralelo.

Introdução

Em 2015, vírus Zika (ZIKV), um vírus transmitidas por mosquitos (mobovirus) pertencente à família Flaviviridae, surgiu na Colômbia e no Brasil e espalhou-se rapidamente através das Américas e do Caribe, causando uma epidemia com um notável número de associados casos clínicos de microcefalia e síndrome de Guillain-Barré¹. Mosquitos da espécie Aedes aegypti e Aedes albopictus são considerados os vetores primários e secundários de ZIKV², mas outras espécies do género Aedes também provaram ter competência vetorial experimental³ . Em contraste com as espécies de Aedes , maior parte das espécies de Culex testadas até agora não é capazes de transmitir o vírus⁴. Apenas, os dados para o Culex quinquefasciatus fornecido resultados inconclusivos³. Neste momento, informação está faltando na competência de vetor mosquito para ZIKV sob condições de temperatura moderada (< 20 ° C). No entanto, esta informação é substancial para as avaliações de risco dos spreads possíveis para regiões com clima temperado como Europa Central.

Um vetor competente para ZIKV é capaz de adquirir, manter, ampliar e finalmente transmitir o vírus. Portanto, teste o mosquito corpos, ou partes dos corpos, incluindo pernas, intestino, cabeça ou glândulas salivares, para ZIKV não é suficiente para determinar a competência vetorial. É obrigatório para testar partículas infecciosas vírus dentro saliva lançado. Para avaliar a competência vetorial, tanto a taxa de infecção (IR, número de corpos de mosquito ZIKV positivo por número de mosquitos ingurgitados) e a taxa de transmissão (TR, número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo), tem que ser determinado. IRs de mosquitos podem ser facilmente analisados pelos mosquitos simplesmente homogeneização, seguidos de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real de transcriptase reversa (RT-qPCR) segmentação ZIKV. Além disso, a infecção pode ser ainda mais caracterizada por determinar o número de cópias virais por mosquito. Em contraste, a análise das taxas de transmissão se baseia na detecção de partículas de vírus viável na saliva de mosquitos individuais. Isto pode ser conseguido pela alimentação dos mosquitos infectados em animais suscetíveis do hospedeiro, seguidos pela análise da virémia no anfitrião⁵. No entanto, esse método se baseia em organismos-modelo apropriado e é caro e restrito por normas de bem-estar animal. Para evitar o uso de animais de laboratório para a análise de taxas de transmissão e reduzir os custos, artificial, sistemas de re-alimentação usar sangue gotículas tem sido descrito⁶. No entanto, testes em escala individual, combinada com um elevado número de indivíduos é difícil e demorado. A primeira descrição de um ensaio de salivação na escala individual foi publicada em 1966⁷ e durante os últimos anos, experiências de salivação forçada tornaram-se o método de escolha para avaliar a competência vetorial de mosquitos^3,8 .

Com base no nosso estudo de competência vetorial de Europa Central mosquitos recentemente publicado⁹, descrevemos salivação forçada, conforme relatado por Anderson et al. ⁸ , com algumas modificações. Este método permite alto rendimento padronizado experiências sob condições de biossegurança de alto nível (BSL-3) e inclui a identificação do vírus ativo pelos ensaios de cultura à base de célula. Os experimentos descritos aqui incluem 856 mosquitos. Eles foram infectados com ZIKV por refeição de sangue artificial e posteriormente analisados para a presença de partículas infecciosas vírus na saliva. Os mosquitos introduzidos dois experimentos composta por laboratório há muito estabelecidas populações de Ae. aegypti e Culex pipiens pipiens biótipo molestus (Cx. p. molestus), bem como campo pego Culex pipiens pipiens biótipo pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) e duas populações de Ae. albopictus . Com exceção de uma das duas populações Ae. albopictus , que foi recolhida na Itália, todos os mosquitos foram coletados na Alemanha.

Protocolo

1. prepare mosquitos fêmeas

1. Recolha os mosquitos de uma gaiola grande, usando um aspirador (aproximadamente 400 mosquitos por gaiola grande).
2. Anestesiar os mosquitos com dióxido de carbono (CO₂) para 7 s.
3. Classificar 20 fêmeas por frasco plástico (Ø 50 mm × 100 mm).
   Nota: Se os mosquitos acordar, use outro 3 s de CO_2.
4. Morrer de fome os mosquitos durante a noite.

2. farinha de sangue artificial

Nota: Todas as etapas são realizadas sob condições de BSL-3.

1. Prepare a refeição de sangue infecciosa.
   1. Diluir o estoque de vírus na concentração de 1 x 10⁸ placa formando unidades (PFU) / mL.
      Nota: A concentração das ações foi determinada através da realização de cultura de tecidos método de dose 50 infecção (TCID50) e calculada pelo Spearman & Karber algoritmo^10,11.
   2. Mix expirou sangue humano (preservação de sangue) no banco de sangue (não é adequado para humano, mas é útil para mosquitos) com frutose (8% solução), filtrado de soro bovino (FBS) e solução de trabalho do estoque de vírus (expirou sangue humano: frutose: FBS: solução de trabalho = 5:3:1:1).
      Nota: Nós escolhemos sangue humano, porque este é o host conhecido mamífero natural de ZIKV.
2. Congele a 140 µ l da mistura de farinha de sangue para posterior análise através de TCID50.
3. Realize alimentação artificial usando métodos de alimentação diferentes, dependendo da espécie:
   1. Aedes aegypti: Use uma membrana que alimentam o sistema por 30 min (1 mL por alimentador).
   2. Culex spp.: fornecem o sangue infeccioso através de um stick de algodão durante a noite e não aquecer o sangue (300 µ l por frasco).
   3. Aedes albopictus: Coloque duas gotas (50 µ l cada) da mistura de farinha de sangue num frasco de plástico e deixe os mosquitos alimentar por 2 h. Não aquecer o sangue.
      Nota: Os mosquitos irão alimentar nos primeiro 15 min. O tempo de incubação prolongada é necessário devido a razões de segurança. As gotas de sangue são drenadas depois alimentado de 2 h, que assim, reduzir o risco de contaminação durante a triagem dos mosquitos.
4. Anestesiar os mosquitos com CO₂ para 7 s.
   Nota: Se os mosquitos acordar, use outro 3 s de CO₂.
5. Classificação e contagem totalmente ingurgitadas mosquitos dentro de um frasco de novo.
6. Adicione uma almofada de algodão, saturada com frutose (8% solução) entre o frasco e um plug.
7. Mantém os mosquitos à temperatura designada de 18 ° C ou a 27 ° C, na umidade de 80% para 14 ou 21 dias.
8. Alimente os mosquitos com almofadas de algodão saturado de frutose. Reabastecer a cada 72 h com 1,5 mL de frutose (8% solução) por frasco (até 20 mosquitos, dependendo a alimentação taxa, consulte a etapa 2.5).

3. forçado a salivação ensaio no dia 14 ou 21

Nota: Todas as etapas são realizadas sob condições de BSL-3.

1. 2 x 10⁴ células de Vero de semente / por bem em um 96 bem placa com 200 µ l de meio de crescimento (modificado de Dulbecco´s eagle suplementado (DMEM) com 3% FBS, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 mg/mL, 5 µ g/mL, anfotericina B, 2 mM L-glutamina 1% não aminoácidos essenciais (timina), piruvato de sódio 1%).
2. Prepare o dispositivo salivação:
   1. Coloque uma placa de vidro quadrada (20 × 20 cm) no banco em um ângulo de 30°.
      Nota: Isto é necessário devido a sub-pressão no laboratório de segurança. Se a placa for horizontal ou vertical, o líquido irá vazar.
   2. Coloque a fita de adesivo dupla face em cima da placa de vidro.
   3. Papel a argila de modelagem até que ela atinge um diâmetro de 0,5 cm e anexá-lo horizontalmente 1 cm a fita adesiva de dupla face.
   4. Corte o primeiro 0,3 cm da ponta de uma ponta do filtro de 10 µ l.
      Nota: É aconselhável preparar isto antes de iniciar o experimento fora do laboratório de biossegurança.
   5. Encha as filtro dicas com 10 µ l de soro de tampão fosfato (PBS, pH 7,4).
   6. Coloque as pontas de filtro sobre a argila de modelagem com a ponta em direção a fita-cola.
   7. Segura as pontas do filtro com uma pressão suave.
3. Prepare os mosquitos:
   1. Anestesia os mosquitos com CO₂.
   2. Retire as pernas e as asas para imobilizar os mosquitos.
   3. Corrigi o mosquito vivos corpos sobre a fita-cola acima uma ponta do filtro.
   4. Coloque o narigudo suavemente a ponta do filtro.
   5. Execute o ensaio de salivação durante 30 min.
   6. Retire as pontas do filtro e descarte o barro e a fita.

4. processamento de Saliva

Nota: Etapas 4.1 – 4.6.2 são executadas sob condições de BSL-3.

1. Expulse o conteúdo para os tubos de reação contendo 10 µ l de PBS.
2. Misture delicadamente e transfira o conteúdo para os poços da placa 96 bem preparado usando um bem por amostra.
3. Incube a placa por 7 dias a 37 ° C com 5% de CO₂.
4. Use o binóculo para marcar as células para a presença de efeito citopático (ECP).
5. Se o poço é positivo para o CPE, recolher o sobrenadante por pipetagem µ l 140 em um tubo de reação para a extração de RNA.
6. Purifica o RNA usando um kit de extração de RNA.
   1. Mix 140 µ l do sobrenadante com 560 µ l de AVL buffer (tampão de Lise viral) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
   2. Adicione 560 µ l de etanol (96%) e a amostra de vórtice.
      Nota: As amostras são inactivadas após esta etapa e podem ser descarregadas fora do laboratório BSL-3.
   3. Pipeta 630 µ l da amostra em uma coluna e centrífuga com 6.000 x g por 1 min.
   4. Descartar o filtrado, pipetar os restantes µ 630 l na coluna e repetir a centrifugação.
   5. Lave o RNA, vinculado à membrana da coluna, adicionando 500 µ l de tampão 1 para a coluna e o centrifugador de lavagem a 6.000 x g por 1 min.
   6. Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um novo tubo de coleta. Adicione 500 µ l lavagem buffer 2 e centrifugar a 12.500 x g durante 3 min.
   7. Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um tubo de reação de 1,5 mL.
   8. Adicionar 50 µ l de tampão de eluição e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.
   9. Centrifugar a 6.000 x g por 1 min e em seguida, descartar a coluna.
7. Analise as amostras para o RNA ZIKV via RT-qPCR.

5. processamento de corpos de Mosquito

Nota: Etapas 5.1 – 5.5 são executadas sob condições de BSL-3.

1. Retire os corpos do mosquito e coloque cada corpo em um tubo de reação.
   Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.
2. Adicione 500 µ l de mídia de homogeneização (DMEM sem qualquer adendos) no tubo de reação.
3. Homogeneizar o corpo usando batedeira motor e usar um pistilo novo para cada amostra.
4. Adicione 200 µ l do homogeneizado em uma 96--placa para purificação.
   Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.
5. Desativar a placa de incubação para 60 min a 60 ° C.
6. Purifica o RNA pela purificação automatizado do ácido nucleico.
   Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.

6. análise

1. Quantificar as cópias de RNA Viral usando RT-qPCR.
   Nota: As cópias de RNA foram em média sobre todos os corpos de mosquito ZIKV-positivo e sem incluir os mosquitos ZIKV negativo.
2. Calcule o IR, definido como o número de corpos de mosquito ZIKV positivo por número de fêmeas alimentadas.
3. Calcule a TR, definida como o número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo. A taxa de transmissão não pode ser calculada para combinações de temperatura-espécies com nenhum corpo de ZIKV-positivo.

Resultados

Aedes aegypti é conhecido como um vetor competente para ZIKV pelo menos sob condições climáticas tropicais¹². Portanto, usamos Ae. aegypti como um controle positivo para estabelecer o ensaio e analisar a receita federal, bem como TRs em uma temperatura de incubação de 27 ° C e uma humidade de 80%. IR e TR... foram definidos conforme descrito por Fortuna et al. ¹³. desafiado Ae. aegypti mostrou IR de 50% e 72% e TR de 42% e 31% em 14 e 21 dias pós infecção (dpi), respectivamente (figura 1A e 1B). Posteriormente, mosquitos europeus foram testados para infecção ZIKV e transmissão usando condições climáticas tropicais, bem como temperadas.

A temperatura de incubação de 27 ° C, todas as espécies de mosquito mostraram infecção ZIKV 14 dpi, bem como 21 dpi, exceto Cx. pipiens p. e Cx. torrentium indivíduos, que foram positivos em 14 dpi apenas. Todas as espécies de Aedes mostraram maior IRs (entre 50% e 72%) bem como a maior concentração de RNA viral (10⁶ até 10 amostras de⁹ RNA cópias/mosquito) em comparação com os diferentes táxons de Culex , que revelou o IRs que variam entre 0 % e 32% e cargas virais de 10³ a 10 espécimes de cópias/mosquito⁴ RNA. Todas as espécies de Aedes exibido saliva ZIKV-positivo (TR 13 – 42%), Considerando que nenhuma das amostras de saliva de táxons o Culex contido ZIKV (figura 1A e 1B). Curiosamente, as taxas de transmissão em dpi 21 foram semelhantes nos Ae. aegypti e albopictus Ae... da Alemanha (30%), mas foram substancialmente menores em Ae. albopictus da Itália (13%).

Incubação de mosquitos desafiados a uma temperatura moderada de 18 ° C revelado geralmente baixa vírus carrega na espécie Aedes (⁴– 10 10⁶ RNA cópias/mosquito), bem como dos diferentes táxons Culex (10^2-10⁴ Cópias de RNA/mosquito). No entanto, a 18 ° C temperatura de incubação, transmissão de ZIKV não foi observada para qualquer das espécies de mosquito investigadas.

Figura 1: taxas de transmissão de mosquitos infectados experimentalmente com ZIKV. Resultados de estudos de competência vetorial com ZIKV em espécies diferentes de mosquitos. Seis táxons diferentes mosquito foram infectados com ZIKV e incubados a 27 ° C ou ° C 18 para 14 (A) ou 21 dias (B). TR é definido como o número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo. O número total de mosquitos investigado foi 856, com um mínimo de 30 indivíduos por táxons de ponto/temperatura/mosquito cada vez. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Anteriormente mostrou que os resultados obtidos com salivação forçada são na linha clássica de experimentos re-alimentação⁶. No entanto, em experimentos de re-alimentação e em nosso método apresentado de salivação forçada, é impossível diretamente a prova de atividade de salivação ou monitorar a liberação de saliva. Para provar a atividade de salivação, as amostras podem ser testadas para outros componentes presentes na saliva (ex., proteínas, carboidratos, etc.). Além disso, qPCRs adicional seria permitir a detecção de cópias de RNA virais. Isto, no entanto, requer separação de amostras de saliva para diversas análises, que podem limitar a sensibilidade no ensaio de cultura celular, em caso de números de partículas muito baixa. Por sua vez, isso pode levar a uma subestimação das taxas de transmissão de determinado.

Para obter resultados reprodutíveis, é necessário garantir que todos os mosquitos ficar vivos até o final do experimento. Isso é controlado pelo monitoramento visualmente a atividade de movimento de corpo dos mosquitos. Além disso, o uso do princípio do ensaio salivação para uma espécie de mosquito determinado tem que ser testado por vírus de controle, que são sabidos para ser transmitido por esta espécie de mosquito específico de alimentação. Vice-versa, cada vírus introduzido um experimento tem que ser testado em um mosquito suscetível.

Ensaios de salivação forçado têm muitas vantagens. Elevado número de mosquitos pode ser testado simultaneamente em um único espécime base em condições controladas e padronizadas sem entrar em conflito com normas de bem-estar dos animais⁹.

O método é usado por vários laboratórios. No entanto, as configurações exatas podem ser diferentes, que pode levar a diferenças nos resultados entre os laboratórios. Um componente crítico é o capilar para coletar a saliva, que pode ser feita de vidro¹⁴ ou¹⁵de plástico. Para cumprir com as normas de alta segurança de um insetário de nível 3 de segurança biológica, usamos dicas de filtro plásticas em vez de capilares de vidro, reduzindo assim o risco de lesões. Além disso, o filtro dicas tem a vantagem que o líquido coletado pode ser facilmente transferido usando uma pipeta.

A instalação do forçada salivação ensaio apresentado aqui é baseada em dois investigadores trabalhando juntos e compartilhando direitos. Desmobilização do mosquito é executada por uma pessoa, enquanto o outro simultaneamente prepara a instalação forçada de salivação. Isto reduz tempo de manuseio e minimiza o risco da amostra como mudar entre a desmobilização-local de trabalho e a salivação-placa de comutação não é necessário. Além disso, ele permite colocar os mosquitos no dispositivo de salivação forçada imediatamente após a desmobilização. Este mosquito bastante curto tempo de tratamento é essencial para o sucesso salivação forçada. Por último, os mosquitos podem ser monitorados diretamente para motilidade durante todo o experimento.

O ensaio de salivação apresentado aqui é usado para obter insights sobre o potencial vetor de espécies de mosquito. No entanto, para responder a algumas outras questões específicas (ex., os números de picadas de mosquito que são necessários para infectar os vertebrados), animal experimentos ainda podem ser necessários.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inject+matic Sleeper	Inject+matic
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage	BugDorm Store
Drosophila cultivation tubes	carl roth	PK11.2	plastic vial for mosquitoes
Plug for drosophila cultivation tubes	carl roth	PK15.1
Constant climate chamber	Binder	KBF-240
Blood			banked human blood, expired, not usable for medical application
Dumont-Pincette Electronic SS	Dumont	B40c
Vero cells	BNITM
Flash light aspirator	Bioquip	2809
double-sided adhesive tape			no specific provider
Gammex Powder-free gloves with AMT	Ansell		for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit	altona diagnostics	591013
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit	Thermo fisher scientific	4462359	RNA isolation of mosquito bodies
Qiamp viral RNA Mini Kit	Qiagen	52906	RNA-Isolation of supernatant
filter tips (20 µL)	Sarstedt	701,116,210	Cut the first 3 mm of the tip
hand motor mixer	carl roth	sold out
micro pestles for hand motor mixer	carl roth	CXH8.1
DMEM		P0403550
L Glutamine Penicilin/Streptomycin	PAN	P0819100
Amphotericin B	PAN	P06-0110
Fructose	carl roth	4981.5
Phosphate buffered saline	PAN	P04-36500
FBS	PAN
Sodium Pyruvat	PAN	P0443100
MEM NAA	PAN	P0832100
Hemotek Feeder	Hemotek	PS6
Light Cycler	Roche	480 II
Light Cycler Software	Roche	480 SW 1.5.1
Modeling clay			no specific provider
King Fisher Flex Purification System	ThermoFisher scientific
Aedes albopictus			eggs were collected in Freiburg, Germany
Binocular	MOTIC	SMZ-168
Binocular light	MOTIC	MLC-150C
CO2-Incubator	Thermo scientific	MIDI 40