Вынуждены слюноотделение как метод для анализа вектора компетенции комаров

Резюме

Для эффективного контроля комаров несут передачи вируса знание Векторный потенциал соответствующих комаров представляет особый интерес. Мы описываем принудительного слюноотделение как метод для анализа вектора компетенции Aedes albopictus и три различных таксонов Culex для передачи вируса Зика.

Аннотация

Вектор компетенция определяется как потенциал видов комаров для передачи комарами вирус (mobovirus) к узлу позвоночных. Жизнеспособные вирусные частицы передаются во время еды крови через слюну инфицированных комаров. Принудительного слюноотделение анализы позволяют определять потенциал вектора на основе единого комаров, избегая использования экспериментов на животных. Этот метод подходит для анализа большое количество комаров в одном эксперименте в течение короткого периода времени. Принудительного слюноотделение анализов были использованы для анализа 856 индивидуальных комары захваченных в Германии, в том числе два различных биотипов Culex pipiens pipiens , Culex torrentium , а также Aedes albopictus, которые были экспериментально зараженных с вирусом Зика (ZIKV) и инкубируют при 18 ° C или 27 ° C для двух и трех недель. Результаты показали отсутствие векторных компетенции различных таксонов Culex для ZIKV. В противоположность этому Aedes albopictus был восприимчивы к ZIKV, но только в 27 ° C, при скорости передачи данных похож на Aedes aegypti лабораторные колонии испытания параллельно.

Введение

В 2015 году, Зика вирус (ZIKV), связанный комарами вирус (mobovirus) семейства Flaviviridae, появились в Колумбии и Бразилии и быстро распространилась по всей Северной и Южной Америки и Карибского бассейна, вызывая эпидемии с заметным количеством Клинические случаи микроцефалия и синдром Гийена-Барре¹. Комаров рода Aedes aegypti и Aedes albopictus считаются первичных и вторичных векторов ZIKV², но также другие виды рода Aedes оказались иметь экспериментальный вектор компетентности³ . В отличие от вида Aedes большинство видов Culex тестирование пока не способны передавать вирус⁴. Просто неоднозначные результаты³представлены данные для Culex quinquefasciatus . В настоящее время отсутствует информация на комаров вектор компетенции для ZIKV в условиях умеренной температуре (< 20 ° C). Однако эта информация является существенной для оценки риска возможных распространяется на регионы с умеренным климатом, таких как Центральной Европы.

Компетентные вектор для ZIKV имеет возможность приобретать, сохранять, усиливают и наконец передачи вируса. Таким образом тестирование Москито тела или части тела, включая ноги, средняя, руководитель или слюнных желез, для ZIKV не достаточно, чтобы определить вектор компетенции. Он является обязательным для проверки инфекционных вирусных частиц в пределах выпустила слюны. Чтобы оценить компетентность вектор, инфекции (IR, количество ZIKV-инфицированных комаров органов за количество комаров наполненный) и скорость передачи данных (TR, количество комаров с ZIKV-позитивных слюны на количество ZIKV-инфицированных комаров органов), должны быть определены. IRs комаров могут легко анализироваться просто гомогенизации комары, следуют обратной транскриптазы в реальном времени полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР) ориентации ZIKV. Кроме того инфекция может быть также характеризуется определения вирусной копии номера за комаров. Напротив анализ скорости передачи зависит от выявления жизнеспособных вирусных частиц в слюне отдельных комаров. Это может достигаться путем кормления инфицированных комаров на восприимчивых принимающей животных, затем анализ виремии в хост-⁵. Однако этот метод опирается на подходящую модель организмов и является дорогостоящим и ограничен правилами защиты животных. Чтобы избежать использования лабораторных животных для анализа скорости передачи данных и снизить затраты, искусственное повторно систем с использованием крови капли были описаны⁶. Однако тестирование отдельных масштабе в сочетании с большим числом лиц является сложным и трудоемким. Первое описание пробирного слюноотделение индивидуальных масштабах был опубликован в 1966 году⁷ и в последние годы, принудительного слюноотделение экспериментов стал методом выбора для оценки компетенции вектор комаров^3,8 .

Основываясь на изучение компетентности наших вектор Центральной Европы комары Опубликовано недавно⁹, мы описываем принудительного слюноотделение, как сообщает Андерсон и др. ⁸ с некоторыми изменениями. Этот метод позволяет высокую пропускную способность стандартизированных эксперименты в условиях высокой биобезопасности уровня (BSL-3) и включает в себя выявление активных вируса клетки культуры на основе анализов. Эксперименты, описанные здесь включают 856 комаров. Они были заражены искусственной крови еды с ZIKV и впоследствии анализируется на наличие инфекционных вирусных частиц в слюне. Комаров, введены в эксперименты входят две популяции давно лаборатории А.е. aegypti и Culex pipiens pipiens биотипа molestus (Cx. p. molestus), а также поле поймали Culex pipiens pipiens биотипа pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) и два А.е. albopictus населения. За исключением одной из двух групп населения А.е. albopictus , которые собирались в Италии, все комары были собраны в Германии.

протокол

1. подготовить женщин комаров

1. Соберите большой клетке комаров с помощью аспиратор (примерно 400 комаров в большой клетке).
2. Анестезировать комаров с углекислым газом (CO₂), 7 s.
3. Сортировать 20 женщины на пластиковом флаконе (Ø 50 мм × 100 мм).
   Примечание: Если комаров звонок, используйте другой 3 s CO_2.
4. Голодать комаров на ночь.

2. искусственной крови еды

Примечание: Все шаги выполняются в условиях BSL-3.

1. Готовить инфекционных крови.
   1. Разбавить запасов вируса с концентрацией 1 x 10-⁸ металлической пластинкы формируя единиц (ОРП) / мл.
      Примечание: Запасов концентрация определяется путем выполнения культуры ткани инфекции доза 50 метод (TCID50) и рассчитывается по^10,11алгоритм Спирмена и Kärber.
   2. Mix человеческая кровь (консервация крови) от банка крови истек (не подходит для человека больше, но полезно для комаров) с фруктозой (8% раствор), отфильтровывать технического индикатора бычьим сывороточным (ФБС) и рабочий раствор запасов вируса (истек человеческой крови: фруктоза: ФБС: Рабочий раствор = 5:3:1:1).
      Примечание: Мы выбрали человеческой крови, потому что это известные природные млекопитающих принимающей ZIKV.
2. Заморозить 140 мкл крови еды смеси для дальнейшего анализа через TCID50.
3. Выполните искусственного кормления с использованием различных методов кормления, в зависимости от вида:
   1. Aedes aegypti: используйте мембраны, системы кормления для 30 мин (1 мл на фидер).
   2. Culex spp.: обеспечивают инфекционных кровь через палку хлопка на ночь и не согреться крови (300 мкл на флакон).
   3. Aedes albopictus: положить две капельки (по 50 мкл) в крови еды смесь в пластиковую пробирку и пусть комаров кормить 2 h. Не согреться крови.
      Примечание: Комаров будет кормить в первые 15 мин. Время длительного инкубации необходимо из соображений безопасности. Каплями крови дренируются после 2 h, таким образом уменьшается риск заражения во время сортировки кормить комаров.
4. Анестезировать комаров с CO₂ 7 s.
   Примечание: Если комаров звонок, используйте другой 3 s CO₂.
5. Сортировка и количество полностью наполненный комаров в новый флакон.
6. Добавление ватным тампоном, насыщенных с фруктозой (8% раствор) между флакона и вилкой.
7. Держите москитов на назначенный температура 18 ° C или 27 ° C, влажность 80% на 14 или 21 дней.
8. Кормить комаров с фруктоза насыщенный ватный тампон. Пополнять каждые 72 ч с 1,5 мл фруктозы (8% раствор) на флакон (до 20 комаров, в зависимости от кормления оценить, шаг 2.5).

3. принудительное слюноотделение Assay на 14 или 21 день

Примечание: Все шаги выполняются в условиях BSL-3.

1. Семя клеток Vero⁴ 2 x 10 / за хорошо в 96 также пластины с 200 мкл среднего роста (Dulbecco´s изменение орел среднего (DMEM) дополнены с 3% FBS, 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мг/мл, 5 мкг/мл амфотерицин B, 2 мм L-глютамина 1% несущественные аминокислот (NEAA), пируват натрия 1%).
2. Подготовьте устройство слюноотделение:
   1. Место прямоугольной стеклянной пластины (20 × 20 см) на скамейке в угол 30°.
      Примечание: Это необходимо за счет разрежения в лаборатории безопасности. Если пластина является горизонтальной или вертикальной, будет утечка жидкости.
   2. Место двухсторонней клейкой лентой на вершине стеклянной пластиной.
   3. Роль моделирования глины пока он достигает диаметром 0,5 см и приложите его горизонтально 1 см от двухсторонняя клейкая лента.
   4. Отрежьте первые 0,3 см наконечник наконечник фильтра 10 мкл.
      Примечание: Рекомендуется подготовить это перед началом эксперимента вне лаборатории биобезопасности.
   5. Наполните фильтр советы 10 мкл-фосфатный буфер (PBS, рН 7,4).
   6. Поместите фильтр советы на глина моделирования с кончика к липкой лентой.
   7. Безопасный советы фильтр с нежным давлением.
3. Подготовьте комаров:
   1. Анестезировать комаров с CO₂.
   2. Удалите ножки и крылья для иммобилизации комаров.
   3. Исправьте органов живых комаров на липкой ленте выше кончика фильтра.
   4. Осторожно поместите Хоботок в кончик фильтра.
   5. Запустите слюноотделение assay для 30 мин.
   6. Удалите фильтр советы и утилизируйте глины и ленты.

4. обработка слюны

Примечание: Шаги 4.1 – 4.6.2 выполняются в условиях BSL-3.

1. Высылать содержимое в реакции пробирки, содержащие 10 мкл PBS.
2. Осторожно перемешать и передачи содержимого в скважины подготовленный 96 хорошо пластину, используя один колодец на сэмпл.
3. Инкубируйте пластину для 7 дней при 37 ° C с 5% CO₂.
4. Для проверки ячейки на наличие цитопатического эффекта (CPE) используйте бинокль.
5. Если колодец является положительным для CPE, урожай супернатанта, дозирования 140 мкл в реакции трубку для извлечение RNA.
6. Очищайте РНК с помощью РНК добыча комплект.
   1. Mix 140 мкл супернатант с 560 мкл AVL буфера (вирусный литического буфера) и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
   2. 560 мкл этанола (96%) и вихревой образца.
      Примечание: Образцы инактивируются после этого шага и может быть освобожден из лаборатории BSL-3.
   3. Накапайте 630 мкл образца на столбец и центрифуги с 6000 x g за 1 мин.
   4. Фильтрат, накапайте оставшиеся 630 мкл на столбце отменить и повторить центрифугирования.
   5. Вымойте РНК, обязан мембраны колонны, добавив 500 мкл отмывающего буфера 1 колонка и центрифуги на 6000 x g за 1 мин.
   6. Отменить коллекции трубки и поместить столбец в новой коллекции трубки. Добавьте 500 мкл Отмывающий буфер 2 и центрифуги на 12 500 x g на 3 мин.
   7. Отказаться от сбора трубки и столбце в 1,5 мл реакции.
   8. Добавьте 50 мкл буфера и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
   9. Центрифуга на 6000 x g за 1 мин и затем удалить столбец.
7. Анализировать образцы для ZIKV РНК через RT-ПЦР.

5. обработка органов комаров

Примечание: Шаги 5.1 – 5.5 выполняются в условиях BSL-3.

1. Удаление тела комара и место каждого органа в реакции трубку.
   Примечание: Это возможно на данный момент паузы эксперимент и хранить образцы-80 ° c.
2. Добавьте 500 мкл гомогенизации СМИ (DMEM без каких-либо дополнениями) в реакции трубку.
3. Однородный тела с помощью мотора миксер и использовать новый пестик для каждого образца.
4. Добавьте 200 мкл огневки в 96-хорошо пластина для очистки.
   Примечание: Это возможно на данный момент паузы эксперимент и хранить образцы-80 ° c.
5. Инактивирует пластину по инкубации 60 мин при 60 ° C.
6. Очищайте РНК путем очистки автоматизированных нуклеиновых кислот.
   Примечание: Это возможно на данный момент паузы эксперимент и хранить образцы-80 ° c.

6. анализ

1. Количественного определения вирусных копий РНК с помощью RT-ПЦР.
   Примечание: Копий РНК были среднем над всеми органами ZIKV-инфицированных комаров и без включения ZIKV-отрицательных комаров.
2. Вычислите ИК, определяется как количество ZIKV-инфицированных комаров органов за количество кормить самок.
3. Вычислите TR, определяется как количество комаров с ZIKV-позитивных слюны на количество органов ZIKV-инфицированных комаров. Скорость передачи не может быть рассчитан для комбинаций видов температуры с не ZIKV-положительных органами.

Результаты

Aedes aegypti известен как компетентным вектор для ZIKV по крайней мере под¹²тропических климатических условиях. Таким образом мы использовали А.е. aegypti как позитивный элемент управления установить пробирного и анализировать IRs, а также технических регламентов на инкубация температура 27 ° c и влажности 80%. IR и TR были определены, как описано ранее, Фортуна и др. ¹³. оспаривается А.е. aegypti показал IR 50% и 72% и TR 42% и 31% в 14 и 21 дней после инфекции (dpi), соответственно (рис. 1A и 1B). Впоследствии Европейский комаров были протестированы для ZIKV инфекции и передачи с использованием тропических, а также умеренных климатических условий.

При 27 ° C температуре инкубации всех видов комаров показал ZIKV инфекции на 14 ДОИ, а также 21 dpi, за исключением Cx. p. pipiens и Cx. torrentium лиц, которые были позитивными в 14 ДОИ только. Всех видов Aedes показали выше IRs (между 50% и 72%), а также высокую концентрацию вирусной РНК (10⁶ до 10 образцы копий/комаров⁹ РНК) по сравнению с различных таксонов Culex , выявившей IRs, колеблется от 0 % и 32% и вирусной нагрузки 10³ до 10 особей⁴ РНК копий/комаров. Все виды Aedes отображается ZIKV-положительных слюны (TR 13 – 42%), тогда как ни один из образцов слюны из таксонов Culex ZIKV (Рисунок 1A и 1B). Интересно, что скорость передачи на 21 ДОИ были схожими в А.е. aegypti и А.е. albopictus из Германии (30%), но были значительно ниже в А.е. albopictus из Италии (13%).

Инкубации из оспаривается комаров на вмеру температуре от 18 ° C в целом показало, что нижняя вирус загружает видами Aedes (10⁴– 10⁶ РНК копий/комаров), а также в различных таксонов Culex (10^2-10⁴ Копий РНК/комаров). Однако при 18 ° C температуре инкубации, передача ZIKV не наблюдалось для любых видов комаров, расследование.

Рисунок 1: скорость передачи комаров, экспериментально зараженных ZIKV. Результаты исследований компетенции вектор с ZIKV видами различных комаров. Шесть различных комаров таксонов были заражены ZIKV и инкубировали при 27 ° C или 18 ° C в течение 14 (A) или (B) 21 дней. TR определяется как количество комаров с ZIKV-позитивных слюны на количество органов ZIKV-инфицированных комаров. Общее количество комаров расследование было 856, с минимум 30 лиц для каждого времени точки/температуры/комаров таксонов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Ранее было показано, что результаты, полученные с принудительным слюноотделение соответствуют классической повторно подавая эксперименты⁶. Однако, повторного кормления экспериментов и в наших представленных метода принудительного слюноотделение, невозможно напрямую доказательство слюноотделение активности или контролировать выпуск слюны. Чтобы доказать деятельность слюноотделение, образцы могут быть опробованы для других компонентов, присутствующих в слюне (например., белки, углеводы, и т.д.). Кроме того дополнительные ценообразующие позволит обнаружения вирусных копий РНК. Это, однако, требует расщепления образцов слюны для различных анализов, которые могут ограничить чувствительность в assay клетки культуры в случае очень низкой частиц чисел. В свою очередь это может привести к недооценке скорости определяется передачи.

Для воспроизводимых результатов необходимо обеспечить, чтобы все комары остаться в живых до конца эксперимента. Это контролируется визуально мониторинга активности движения тела комаров. Кроме того принцип использования слюноотделение assay для данного комаров видов испытание должно проводиться путем кормления управления вирусов, которые известны препроводит этот конкретный комаров видов. Наоборот каждый вирус, включены в эксперимент должен испытываться в восприимчивых комаров.

Принудительного слюноотделение анализов имеют много преимуществ. Большое количество комаров может испытываться одновременно на единичная база контролируемых стандартных условиях без конфликта с животными правила⁹.

Этот метод используется в нескольких лабораториях. Однако точной настройки могут различаться, что может привести к различия в результатах между лабораториями. Одним из важнейших компонентов является капилляр для сбора слюны, которые могут быть сделаны из стекла¹⁴ или пластиковые¹⁵. В соответствии с положениями высокая безопасность insectary третьего уровня биобезопасности, мы использовали пластиковый фильтр советы вместо стекла капилляров, тем самым уменьшая риск возникновения травм. Кроме того фильтр советы имеют то преимущество, что собранные жидкость легко могут быть переведены с помощью пипетки.

Настройка пробирного принудительного слюноотделение, представленные здесь основан на двух следователей, совместной работы и распределения обязанностей. Демобилизации комаров выполняется одним человеком, в то время как другие одновременно готовит установки принудительного слюноотделение. Это значительно сокращает время обработки и минимизирует риск образца переключение как меняется между демобилизации-на рабочем месте и слюноотделение плита не является необходимым. Кроме того она позволяет размещать комаров на устройстве принудительного слюноотделение сразу же после демобилизации. Это довольно короткий комаров, время обработки имеет важное значение для успешной принудительной слюноотделение. И наконец комаров может контролироваться непосредственно для подвижности на протяжении всего эксперимента.

Assay слюноотделение, представленные здесь используется для получения проницательности в Векторный потенциал видов комаров. Однако чтобы ответить на некоторые конкретные вопросы (например., количество укусов комаров, которые необходимы для заразить позвоночных), животных эксперименты по-прежнему может потребоваться.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inject+matic Sleeper	Inject+matic
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage	BugDorm Store
Drosophila cultivation tubes	carl roth	PK11.2	plastic vial for mosquitoes
Plug for drosophila cultivation tubes	carl roth	PK15.1
Constant climate chamber	Binder	KBF-240
Blood			banked human blood, expired, not usable for medical application
Dumont-Pincette Electronic SS	Dumont	B40c
Vero cells	BNITM
Flash light aspirator	Bioquip	2809
double-sided adhesive tape			no specific provider
Gammex Powder-free gloves with AMT	Ansell		for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit	altona diagnostics	591013
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit	Thermo fisher scientific	4462359	RNA isolation of mosquito bodies
Qiamp viral RNA Mini Kit	Qiagen	52906	RNA-Isolation of supernatant
filter tips (20 µL)	Sarstedt	701,116,210	Cut the first 3 mm of the tip
hand motor mixer	carl roth	sold out
micro pestles for hand motor mixer	carl roth	CXH8.1
DMEM		P0403550
L Glutamine Penicilin/Streptomycin	PAN	P0819100
Amphotericin B	PAN	P06-0110
Fructose	carl roth	4981.5
Phosphate buffered saline	PAN	P04-36500
FBS	PAN
Sodium Pyruvat	PAN	P0443100
MEM NAA	PAN	P0832100
Hemotek Feeder	Hemotek	PS6
Light Cycler	Roche	480 II
Light Cycler Software	Roche	480 SW 1.5.1
Modeling clay			no specific provider
King Fisher Flex Purification System	ThermoFisher scientific
Aedes albopictus			eggs were collected in Freiburg, Germany
Binocular	MOTIC	SMZ-168
Binocular light	MOTIC	MLC-150C
CO2-Incubator	Thermo scientific	MIDI 40