蚊のベクトル能力を分析する方法として唾液の分泌を強制

要約

蚊媒介性ウイルス伝達の効率的な管理は、それぞれ蚊のベクトル ポテンシャルの知識が注目です。ヒトスジシマカと 3 異なるアカイエカ種はジカの伝達のためのベクトル能力を分析する方法として強制唾液分泌について述べる。

要約

ベクトル能力は蚊種の脊椎動物のホストに蚊媒介ウイルス (mobovirus) を送信可能性として定義されます。実行可能なウイルス粒子は感染蚊の唾液を介して血液の食事中に送信されます。強制唾液分泌の試金は、動物実験の使用を避け、単一の蚊に基づくベクトル ポテンシャルの決定を許可します。メソッドは、時間の短い期間内に 1 つの実験で蚊の数が多いを分析に適しています。ドイツ、2 つの異なるを含むに閉じ込められた 856 個体を用い強制唾液分泌の試金チカイエカ アカイエカバイオタイプアカイエカ torrentiumとして感染したヒトスジシマカ、 ジカ ウイルス (ZIKV) および 18 ° C または 2 〜 3 週間の 27 ° C で培養。結果は、ZIKV の別のアカイエカ群のベクトル能力の欠如を示した。対照的に、ヒトスジシマカは 27 ° C、ネッタイシマカ研究所植民地を並行してテストに類似した伝送レートでしか ZIKV に感受性であった。

概要

フラビコロンビア、ブラジルに登場し、急速に広がったアメリカ大陸とカリブ海の間での注目すべき数字と流行を引き起こしてファミリーに属する蚊媒介ウイルス (mobovirus) の関連付けられたジカ (ZIKV)、2015 年に小頭症とギラン症候群の¹症例ネッタイシマカとヒトスジシマカの種の蚊が ZIKV²のプライマリとセカンダリのベクトルと見なされますが、ヤブカ属の他の種がまた実験的ベクトル能力^{3 を持っている証明}.ヤブカ属の種と対照をなしてこれまでテストアカイエカ種のほとんどはウイルス⁴を送信することがありません。単に、ネッタイイエカのデータは決定的な結果³を提供しました。現時点では、情報が欠けている蚊ベクトル能力 ZIKV の適当な温度条件の下で (< 20 ° C)。ただし、この情報は中央ヨーロッパなどの温帯気候地域に可能なスプレッドのリスク評価に実質的です。

ZIKV の有能なベクトル、取得、維持、増幅し、最後にウイルスを送信することができます。したがって、テスト蚊ボディまたはボディの部分、ZIKV の足、腸、頭や唾液腺を含むはありませんベクトル能力を決定するのに十分です。リリースされた唾液内の感染性ウイルス粒子をテストするは必須です。ベクトル能力を評価するために感染率 (IR, 吸血蚊の数 ZIKV 陽性蚊体数) と伝送速度 (トランジスタ、ZIKV 陽性 ZIKV 陽性蚊体の数で唾液で蚊の数)、する必要があります。決定されます。逆転写酵素実時間ポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR-RT) 続いて単に均質化蚊によって蚊の IRs を簡単に分析できる ZIKV を対象とします。さらに、感染症は、蚊あたりウイルス コピー数を決定することによってさらに特徴付けられます。対照的に、透過率の分析は、個々 の蚊の唾液中実行可能なウイルス粒子の検出に依存します。これは、ホスト⁵におけるウイルス血症の分析に続いて、感受性宿主動物に感染した蚊の餌によって達成することができます。ただし、このメソッドは適切なモデル生物に依存し、コストがかかり、動物福祉規則によって制限されています。伝送レートの分析に実験動物の使用を回避し、コストを削減するには、再供給システム人工血しぶきがされているを使用して記述されている⁶。しかし、高個体数と組み合わせて個々 のスケールのテストは難しいと時間がかかるです。個々 の規模の唾液分泌の試金の最初の説明が掲載されました 1966年⁷と強制の唾液分泌の実験、近年中に蚊^{3,8 のベクトル能力を評価するための最適な方法となっています。}.

基づく中央ヨーロッパのベクトル能力研究蚊公開最近⁹、アンダーソンらによって報告された強制唾液分泌について述べる。⁸いくつかの変更。このメソッドにより、標準化高スループット高いバイオ セーフティ レベル条件 (BSL-3) 実験、細胞による培養の試金によってアクティブなウイルスの識別が含まれています。ここで説明した実験には、856 蚊が含まれます。ZIKV 人工吸血による感染、その後唾液で感染性のウイルス粒子の存在を分析します。実験で構成される 2 つの老舗実験Ae。 ネッタイシマカとチカイエカ アカイエカのバイオタイプチカイエカ(チカイエカ) としてフィールドの個体群に導入された蚊キャッチアカイエカアカイエカ アカイエカバイオタイプ アカイエカ (cx p. アカイエカ)、アカイエカ torrentium (cx torrentium)、2 つのAe。 ヒトスジシマカ集団。イタリアで収集された、2 つのAe。 ヒトスジシマカ集団の 1 つを除いてすべての蚊はドイツで収集されました。

プロトコル

1. メスの蚊を準備しなさい

1. 大きなケージから蚊を収集するには、吸引器 (大きなケージあたり約 400 蚊) を使用します。
2. 7 の二酸化炭素 (CO₂) 蚊を麻酔 s。
3. プラスチック バイアルあたり 20 の女性を並べ替える (Ø 50 mm × 100 mm)。
   注: 蚊が目覚める場合使用別 3 CO の s_2.
4. 一晩蚊を飢えさせます。

2. 人工血液の食事

注: すべての手順は、BSL 3 条件の下で実行されます。

1. 感染症の血液の食事を準備します。
   1. ウイルス株式の 1 x 10⁸プラーク形成単位 (PFU) の濃度を希釈/mL。
      注: ストック濃度に組織培養感染量 50 法 (TCID50) を行うことで決定されスピアマン & Kärber アルゴリズムの^10、11で計算。
   2. 血液バンクから人間の血液 (血液保存) にミックスの有効期限が切れて (には適していない蚊の役に立つが、もう、人間) フルクトース (8% 溶液)、濾過されるウシ血清 (FBS)、ウイルス ストックの実用的なソリューション (人間の血: 果糖: FBS を期限切れ。実用的なソリューション 5:3:1:1 を =)。
      注: 我々 は、ZIKV の知られている自然な哺乳類のホストは人間の血液を選んだ。
2. 吸血ミックス TCID50 によるさらなる分析のための 140 μ L を固定します。
3. 種に応じて、さまざまな給餌方法を用いた人工栄養に従います。
   1. ネッタイシマカ: 30 分 (フィーダーあたり 1 mL) システムを摂食膜を使用します。
   2. イエカ属: 綿スティックを介して感染血液を一晩提供し、血 (バイアルあたり 300 μ L) を暖かくはありません。
   3. ヒトスジシマカ: プラスチック バイアルに吸血ミックスの二液滴 (各 50 μ L) を入れて、2 時間フィード蚊を聞かせて。血液を暖かくはありません。
      注: 最初の 15 分で蚊が給紙されます。長時間インキュベーション時間は、安全上の理由のため必要です。2 h、従って汚染リスクは減るの並べ替え中に蚊を供給後、血飛沫が減ります。
4. CO₂ 7 の蚊を麻酔 s。
   注: 蚊が目覚める場合使用別 3 CO₂の s。
5. 並べ替えとカウントは、新しいバイアルに蚊を完全に充血。
6. 果糖 (8% 溶液) バイアルとプラグインの間で飽和状態に、綿のパッドを追加します。
7. 14 または 21 日間の 18 ° C または 27 ° C 湿度 80% での指定の温度で蚊を維持します。
8. 果糖飽和綿パッドと蚊をフィードします。1.5 ml のバイアルあたり果糖 (8% 溶液) のすべての 72 h を補充 (20 蚊まで給餌によって速度、ステップ 2.5 を参照してください)。

3. 強制 14 または 21 日に唾液分泌の試金

注: すべての手順は、BSL 3 条件の下で実行されます。

1. 2 x 10⁴ Vero 細胞をシード//、96 ウェル ウェル (Dulbecco´s 改変イーグル培地 (DMEM) 3 %fbs、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 100 mg/mL、5 μ g/mL アムホテリシン B、2 mM L グルタミンを添加した培 200 μ L で、1% 非必須アミノ酸 (NEAA)、ピルビン酸ナトリウム 1%)。
2. 唾液の分泌のデバイスを準備します。
   1. 30 ° の角度でベンチに二乗ガラス板 (20 × 20 cm) を配置します。
      注: これは安全ラボで伸ばしてくださいのために必要。プレートは水平方向または垂直方向に、液体のリークが発生します。
   2. ガラス板の上に両面テープを配置します。
   3. 役割それまでモデリング粘土は 0.5 cm の直径に達する、両面粘着テープから 1 cm 水平に取り付けます。
   4. 10 μ L フィルター チップの先端の最初の 0.3 cm を切った。
      注: このバイオ研究所外実験を開始する前に準備する勧めします。
   5. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) の 10 μ L で、フィルターのヒントを入力します。
   6. 粘着テープに向けてヒントとモデリング粘土にフィルターのヒントを配置します。
   7. 穏やかな圧力とフィルターの先端を保護します。
3. 蚊を準備します。
   1. CO₂の蚊を麻酔します。
   2. 脚と蚊を動けなく羽を削除します。
   3. フィルター チップ上粘着テープをリビング蚊の体を修正します。
   4. フィルター先端にそっと口吻を配置します。
   5. 30 分の唾液分泌の試金を実行します。
   6. フィルターのヒントを削除し、粘土とテープを破棄します。

4. 唾液の処理

注: 手順 4.1-4.6.2 は BSL 3 条件の下で実行されます。

1. 10 μ L の PBS を含む反応管に内容を排出します。
2. 穏やかに混合し、サンプルあたり 1 つの井戸を使用して準備された 96 well プレートのウェルにコンテンツを転送します。
3. 5% CO₂と 37 ° C で 7 日間の版を孵化させなさい。
4. 両眼を使用して、セル細胞変性効果 (CPE) の存在を確認します。
5. 井戸が CPE の正の場合は、RNA の抽出のための反応管にピペッティング 140 μ L で上澄みを収穫します。
6. RNA 抽出キットを使用して RNA を浄化します。
   1. AVL の 560 μ L で上澄みのミックス 140 μ L (ウイルスの換散バッファー) をバッファーし、室温で 10 分間インキュベートします。
   2. エタノール (96%) の渦サンプル 560 μ L を追加します。
      注: サンプルはこの手順後不活化し、BSL 3 研究室から排出することができます。
   3. ピペット 630 μ L 列と 1 分 6,000 × g で遠心分離機にサンプルの。
   4. ろ液は、列の残りの 630 μ L ピペットを破棄し、遠心分離を繰り返します。
   5. RNA を洗って、1 分間 6,000 x gでバッファー 1 列と遠心分離機を洗浄 500 μ L を追加することによって、列の生体膜に結合します。
   6. コレクションの管を破棄し、新しいコレクションの管に列を配置します。3 分 12,500 x gで 500 μ L 洗浄バッファー 2 と遠心分離機を追加します。
   7. コレクションの管を破棄し、反作用の管を 1.5 mL に列を配置します。
   8. 溶出バッファーの 50 μ L を追加し、室温で 1 分間インキュベートします。
   9. 1 分間 6,000 × gで遠心分離し、列を破棄します。
7. RT qPCR を介して ZIKV RNA のサンプルを分析します。

5. 蚊体処理

注: 手順 5.1-5.5 は、BSL 3 条件の下で実行されます。

1. 蚊の体を取り外し、反応管に各個体を置きます。
   注: この時点で実験を一時停止し、-80 ° C で試料を保存することが可能です。
2. 反応管に均質化メディア (DMEM 任意 supplementals なし) 500 μ L を追加します。
3. ハンド モーター ミキサーを使用して体を均質化し、各サンプルに関して新しい雌しべを使用します。
4. 浄化の 96 ウェル プレートに磨砕液 200 μ L を追加します。
   注: この時点で実験を一時停止し、-80 ° C で試料を保存することが可能です。
5. 60 ° C で 60 分間インキュベーションでプレートを不活性化します。
6. 自動核酸精製によって RNA を浄化します。
   注: この時点で実験を一時停止し、-80 ° C で試料を保存することが可能です。

6. 分析

1. RT qPCR を使用してウイルスの RNA のコピーを定量化します。
   注: すべての ZIKV 肯定的な蚊の体と ZIKV 負蚊を含めずに RNA のコピーを平均しました。
2. ZIKV 陽性蚊体供給, 個体数あたりの数として定義、IR を計算します。
3. ZIKV 陽性 ZIKV 陽性蚊体の数で唾液で蚊の数として定義されている TR を計算します。伝送速度は可能性がありますは ZIKV 陽性の遺体と一緒に種温度の組み合わせ計算されません。

結果

ネッタイシマカとして知られている有能なベクトル ZIKV の少なくとも¹²熱帯の気候条件の下で。したがって、我々 は肯定的な制御としてAe。 ネッタイシマカを使用アッセイを確立し、IRs として 27 ° C の孵化の温度、湿度 80% で TRs を分析します。IR と TR は、フォルトゥーナらによって前述したように定義されました。¹³。 挑戦Ae。 ネッタイシマカ50%、72% の IR と TR 42% と 31% 14, 21 日目にそれぞれ感染 (dpi) のポストを示した (図 1 aと1 b)。その後、欧州蚊 ZIKV 感染症、熱帯と温帯の気候条件を用いた伝送テストされています。

27 ° C の孵化の温度、すべて蚊種 14 dpi として 14 dpi のみで陽性であったcx p. アカイエカとcx torrentium個人以外の 21 dpi ZIKV 感染症を示した。ヤブカ属のすべての種がウイルス RNA 濃度が高いだけでなく、高い IRs (間 50%、72%) を示した (10⁶ 10⁹ RNA コピー/蚊標本まで) 0 まで IRs、明らかに異なるアカイエカ群と比較して% 32% と 10 のウイルス負荷³ 10⁴ RNA コピー/蚊標本にします。アカイエカ群から唾液のサンプルのどれも ZIKV (図 1 aおよび1 b) に含まれるに対し、ヤブカ属のすべての種は ZIKV 陽性唾 (TR 13-42%) を表示されます。興味深いことに、21 dpi で伝送速度 (30%)、ドイツからAe。 ネッタイシマカとヒトスジシマカ Ae。類似していたが, 実質的にイタリアからヒトスジシマカ Ae。 (13%)。

低いウイルス負荷ヤブカ属種 (10⁴– 10⁶ RNA コピー/蚊) だけでなく別のアカイエカ群 (10^2-10^{4、18 ° C の適当な温度で挑戦された蚊の孵化が一般に明らかにしました。}RNA のコピー/蚊)。ただし、18 ° C の孵化の温度で ZIKV の伝送は観察されなかった, 蚊種のいずれかの.

図 1: ZIKV 感染蚊の伝達率。別の蚊の種で ZIKV とベクトル能力研究の結果。分類群別の蚊 6 ZIKV に感染している、(B) の 21 日間または 14 (A) 18 ° C 27 ° C で培養しました。TR は、ZIKV 陽性 ZIKV 陽性蚊体の数で唾液で蚊の数として定義されます。蚊の調査の合計数は各時間のポイント/温度/蚊分類群の 30 人を最小限に抑えて、856 だったこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

以前、古典の再給餌実験⁶に沿って強制唾液の分泌により得られた結果が示されています。ただし、両方で再実験を給餌、強制唾液分泌の提示手法じゃない直接唾液分泌活動を証明または唾液の放出を監視することが可能。唾液の分泌活動を証明する唾液に存在するその他のコンポーネント サンプルをテストでした (e.g。、蛋白質、炭水化物など。)。さらに、追加の qPCRs は、ウイルスの RNA のコピーの検出になります。これは、ただし、唾液のサンプル様々 な解析では、非常に低い粒子数の場合細胞培養の試金の感受性が制限される場合の分割が必要です。ターンでは、これは断固とした伝送レートの過小評価につながる可能性があります。

再現性のある結果を得るのため、実験終了時まで、すべての蚊が生き続けることを確認する必要です。これは蚊の身体運動活動を視覚的に監視することによって制御されます。さらに、与えられた蚊種の唾液分泌の試金の原則使用はコントロール ウイルスは、この特定の蚊種によって感染すると知られている供給によってテストされます。逆に、実験に導入されたすべてのウイルス感受性蚊でテストするがあります。

強制唾液分泌の試金には、多くの利点があります。蚊の高い数字は、基本制御の標準化された条件の下で単一の標本で動物福祉規則⁹と競合することがなく、同時にテストできます。

メソッドは、いくつかの研究所によって使用されます。ただし、研究室間の結果の違いにつながることができる正確なセットアップは異なる場合があります。1 つの重要なコンポーネントは、ガラス¹⁴またはプラスチック¹⁵の作ることができる唾液を収集するために毛細血管です。バイオ セーフティ レベル 3 横の高い安全基準を遵守するためフィルター チップの代わりに使ってガラス管、怪我のリスクを減らします。さらに、フィルターのヒントには、ピペットを使用して集められた液体を転送する簡単にことができます利点があります。

ここに示す強制唾液分泌の試金のセットアップは、連携して職務を共有研究者 2 名に基づいています。他は同時に強制唾液分泌のセットアップを準備している間、蚊の demobilizing は一人で行います。これは、大幅に処理時間を短縮し、リスクを最小限に抑えるサンプルのスイッチとして復員職場と流涎プレートの間を変更する必要はありません。さらに、復員直後後強制唾液デバイス蚊に置くことができます。この幾分短い蚊の処理時間は成功した強制唾液分泌に不可欠です。最後に、全体の実験中の蚊を直接監視できます。

ここで紹介唾液分泌の試金は、蚊のベクトル ポテンシャルに洞察力を得るために使用されます。ただし、いくつかの他の特定の質問に答える (e.g。、蚊に刺され脊椎動物に感染するために必要な数)、動物実験が必要な可能性があります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inject+matic Sleeper	Inject+matic
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage	BugDorm Store
Drosophila cultivation tubes	carl roth	PK11.2	plastic vial for mosquitoes
Plug for drosophila cultivation tubes	carl roth	PK15.1
Constant climate chamber	Binder	KBF-240
Blood			banked human blood, expired, not usable for medical application
Dumont-Pincette Electronic SS	Dumont	B40c
Vero cells	BNITM
Flash light aspirator	Bioquip	2809
double-sided adhesive tape			no specific provider
Gammex Powder-free gloves with AMT	Ansell		for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit	altona diagnostics	591013
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit	Thermo fisher scientific	4462359	RNA isolation of mosquito bodies
Qiamp viral RNA Mini Kit	Qiagen	52906	RNA-Isolation of supernatant
filter tips (20 µL)	Sarstedt	701,116,210	Cut the first 3 mm of the tip
hand motor mixer	carl roth	sold out
micro pestles for hand motor mixer	carl roth	CXH8.1
DMEM		P0403550
L Glutamine Penicilin/Streptomycin	PAN	P0819100
Amphotericin B	PAN	P06-0110
Fructose	carl roth	4981.5
Phosphate buffered saline	PAN	P04-36500
FBS	PAN
Sodium Pyruvat	PAN	P0443100
MEM NAA	PAN	P0832100
Hemotek Feeder	Hemotek	PS6
Light Cycler	Roche	480 II
Light Cycler Software	Roche	480 SW 1.5.1
Modeling clay			no specific provider
King Fisher Flex Purification System	ThermoFisher scientific
Aedes albopictus			eggs were collected in Freiburg, Germany
Binocular	MOTIC	SMZ-168
Binocular light	MOTIC	MLC-150C
CO2-Incubator	Thermo scientific	MIDI 40