A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי הכבד ואת פרוטון הדליפה קינטיקה להעריך נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר לחלב הולשטיין
In This Article
Summary
כאן, אנו חולקים שיטות למדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי, הגדרת המושג של energetics תזונתי, פרוטון הנזילה, הגורם העיקרי של חוסר היעילות בדור מיטוכונדריאלי של ATP. תוצאות אלו יכול להסביר 30% מהאנרגיה שקוע ניצול מזין כדי לעזור להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי.
Abstract
צריכת החמצן, פרוטון מניע כוח (PMF) ויש דליפת פרוטון המידות של נשימה מיטוכונדריאלי, או כמה טוב המיטוכונדריה הם מסוגלים להמיר NADH ו FADH ATP. מאז המיטוכונדריה הם גם האתר הראשי עבור השימוש החמצן וחמצון מזין פחמן דו-חמצני ומים, איך ביעילות הם להשתמש בחמצן, מייצרים ATP ישירות מתייחס יעילות חילוף החומרים התזונתיים, דרישות התזונתי של החיה, ו בריאות של החיה. מטרת שיטה זו היא לבחון את הנשימה מיטוכונדריאלי, אשר יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעה של תרופות שונות, דיאטות and השפעות סביבתיות על חילוף החומרים מיטוכונדריאלי. התוצאות כוללות צריכת החמצן הנמדדת נשימה התלויים פרוטון (המדינה 3) ומערכת פרוטון הדליפה התלויים נשימה (4 המדינה). היחס של המדינה 4 3 / המדינה נשימה מוגדר יחס בקרת הנשימה (RCR) ולייצג מיטוכונדריאלי יעילות אנרגטית. פרוטון מיטוכונדריאלי הדליפה היא תהליך המאפשר פיזור של פוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי (MMP) על ידי זרחון חמצוני uncoupling מ- ADP להפחתת היעילות של סינתזת ATP. חמצן ו- TRMP + אלקטרודות רגיש עם מצעים מיטוכונדריאלי, מעכבי שרשרת האלקטרונים תחבורה משמשות למדידת מצב 3 ו- 4 מצב נשימה, ממברנה מיטוכונדריאלי PMF (או פוטנציאל לייצר ATP), דליפת פרוטון. מגבלות לשיטה זו הם כי רקמת הכבד חייבים להיות טריים ככל האפשר, ביופסיות וכל מבחני חייב להתבצע תוך פחות מ 10 h. זה מגביל את מספר דוגמאות אשר ניתן לאסוף ולהשתמש שעובדו על-ידי אדם אחד ביום אחד כדי כ 5. עם זאת, רק 1 גרם של רקמת הכבד נדרש, כך בבעלי חיים גדולים, כגון בקר לחלב, כמות הדגימה הצורך הוא קטן יחסית לגודל כבד, יש מעט זמן ההחלמה הדרוש.
Introduction
המיטוכונדריה הם מאוד רגיש ללחץ, הסביבה התאית שלהם יכול לתרום למגוון רחב של מחלות מטבוליות. צריכת החמצן פרוטון דליפת בתוך המיטוכונדריה אינדיקטורים של המיטוכונדריה בריאות בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בשיטות המתוארות הזה יעילות אנרגיה מיטוכונדריאלי הערכה של נייר באמצעות RCR מבוסס על צריכת חמצן עם וללא דליפה פרוטון. תוצאות אלו יכול להסביר 30% מהאנרגיה איבד ניצול מזין1. שינויים דליפת חמצן צריכת ואת פרוטון יכול לזהות בתפקוד מיטוכונדריאלי אשר תורם למחלות מטבוליות ותוצאות יעילות אנרגיה ירד. שיטות אלה יכולים לשמש גם כדי לבחון את ההשפעה של טיפולים שונים על נשימה מיטוכונדריאלי. המטרה הכוללת של מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי וקינטיקה הדליפה פרוטון הוא להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי ויעילות אנרגטית.
בעיות בתפקוד הכבד מיטוכונדריאלי כבר קשור למחלות רבות בבקר לחלב. היכולת של חילוף החומרים הסלולר כדי לעבור בין הפחמימות, השומנים דלקים להתמודדות עם גירעון האנרגיה הנקה מוקדם מושפעת את המספר והתפקוד של המיטוכונדריה בתא2. ליקויים ביכולת של המיטוכונדריה להסתגל הביקוש אנרגיה וβ-חמצון מוגבר יכול להוביל להצטברות של השומנים תאיים הקשורים עם תנגודת לאינסולין, עלול להוביל להיווצרות של כבד שומני בפרות חלב הנקה מוקדם. המיטוכונדריה, כמו האתר של הגוף קטון בייצור ושימוש, יכול לשחק תפקיד מפתח ketosis פרות חלב3. חוסר המיטוכונדריה או בתפקוד מיטוכונדריאלי תשפיע על דלק זמינות לפריפריה, יבואו לידי ביטוי שינויים צריכת חמצן או RCR.
שינויים בצריכת החמצן מיטוכונדריאלי בתגובה לדלקת. בת שבע יום פטם חולקו באופן אקראי לקבוצת נגוע Eimeria maxima ו שליטה קבוצה4. פטם זה לא עברה כגון האתגר היה צריכת חמצן נמוכה בשל דליפת פרוטון RCR גבוה המציין כי המיטוכונדריה הכבד להגיב לאתגר המערכת החיסונית על ידי הגדלת הדליפה פרוטון. בעת דליפת פרוטון ומגיבים הפקת מינים חמצן פעם אחת נחשב סימן של חוסר תפקוד ממברנה מיטוכונדריאלי, פוגעת יעילות אנרגטית, עכשיו זה ידוע שזה חשוב עבור ייבוא של חלבונים וסידן לתוך המיטוכונדריה5 , ובשביל הדור של חום1.
דליפת אלקטרונים בשרשרת הנשימה הופכת המיטוכונדריה רגישים ייצור מינים חמצן תגובתי, נזק חמצוני מיטוכונדריאלי קרום חלבונים, שומנים, דנ א מיטוכונדריאלי. כמו גיל המיטוכונדריה, נזק יכול להצטבר במיוחד כדי mtDNA גורם נוסף תפקוד חילוף החומרים מיטוכונדריאלי6 ו ולרגישות רבה יותר של הפרה למחלות. בפועל, חיות משק רבות אכלו רמות גבוהות של תוספי מזון כגון Cu, Zn, Mn כדי להגביר את הפונקציה נוגד חמצון. אולם, האכלה רמות גבוהות של Cu, Zn, Mn ירד ייצור החלב, גדלה צריכת חמצן בשל פרוטון דליפה (4 מצב הנשימה)7.
מחקרים קודמים על התפקיד של הפונקציה מיטוכונדריאלי ביעילות אנרגיה בבקר התמקדה שינויים צריכת החמצן מיטוכונדריאלי פרוטון הדליפה. אך מעט מחקרים פורסמו ב בקר לחלב והשווה רוב המסמכים יעילות הייצור בצורה של צריכת המזון שיורית (RFI) לפונקציה מיטוכונדריאלי ב בקר. השתנות בנשימה מיטוכונדריאלי המחירים נבחנו על ידי מדידת מצב 3, 4 והמדינה RCR ב הכבדים של פרות הולשטיין מניקות והן מניקות בשר פרות (אנגוס, Brangus והרפורד)8. החוקרים לא מצאו קשר בנשימה מיטוכונדריאלי עם צמיחה או חליבה תכונות עבור בקר אבל דיווחת מתאם בין נשימה מיטוכונדריאלי חליבה תכונות עבור Holsteins. שני מחקרים, RFI נמשל ב בקר תעריפי נשימה מיטוכונדריאלי (המדינה 3, 4 והמדינה RCR) שרירים המיטוכונדריה9,10. נשימה מיטוכונדריאלי המחירים השתנו בתגובה DMI, המחירים הנמוכים היו קשורים עם שוורים בשר פחות יעילה. במחקר אחר, RFI של שוורים מתוך שוורים RFI גבוה או נמוך הושוו עם שיעורי נשימה מיטוכונדריאלי וקינטיקה הדליפה פרוטון בין שתי הקבוצות של רומא11. ההבדלים היו בגלל רווח המאשרת למסקנה לזכות אינה לא ההשפעה נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר.
בנייר זה, ניסוי בחינת הכבד RCR בתגובה 3 חמצון מינרלים להאכלת בקר לחלב מניקות מדגימה השימוש בשיטות למדידת צריכת החמצן במהלך המדינה 4 ואת המדינה 3 נשימה ומערכת PMF.
Protocol
כל השיטות, פרוטוקול ולימודי המתוארים כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס.
1. לקבל את ביופסיה של הכבד של פרה חלב הולשטיין
הערה: ביופסיה של הכבד צריכה להתבצע על-ידי וטרינר מורשה. ביופסיות כבד יכול להתבצע באתר חלב שבה ממוקמים הפרות. מניקות פרות חולבות ניתן להמשיך לחלוב בדרך כלל, חלב לא צריך להיות מופנמים של אספקת המזון לפני או אחרי הניתוח. מומלץ כי לפחות 4 אנשים נדרשים לבצע את ביופסית הכבד על פרה חלב: וטרינר לבצע את הביופסיה, מטפל בבעלי חיים עומדים על הירך של הפרה כדי להגן על אזור ביופסיה של וטרינר, טכנאי מעבדה בצד החיצוני של העט כדי להפוך פניו er כלים, חומרים, ביופסיה לטעום מן הוטרינר ולשמור על האזור נקי, אשר יכול להיות בחלק האחורי של הרכב (איור 1), טכנאי כדי לאחזר את דגימת כבד ולהתחיל מיטוכונדריאלי בידוד.
- חודש אחד לפני ביופסיות כבד, לתת פרות חיסון clostridia. ליצור ערכות כירורגי על ידי מגבות כירורגי autoclaving, מכשיר ביופסיה, מחזיקי האזמל ציוד כירורגי.
- יום אחד לפני ביופסית הכבד, להחדיר את הפרה Ceftiofur הידרוכלוריד 0.044 מ"ל לק"ג משקל גוף subcutaneously בצוואר. צג טמפרטורה פרה, צריכת ותוצאות צואה לשימוש כקו תפקוד תקין.
- ליצור המיטוכונדריה בידוד מדיה (MIM) containining מ מ 220 מניטול, סוכרוז 70 מ מ, 20 מ מ HEPES EDTA 1 מ מ, BSA חינם של חומצת שומן 0.1% (w/v), pH 7.4 ב 4 º C. יהיה צורך כ- 30 מ לכל דגימה.
- לרסן את הפרה פיזית ניצול בפריחה עם מחבל התלייה לפי הצורך (איור 2). באמצעות את הלטר, לקשור את ראשה לצד השמאלי stanchion. במידת הצורך, מעצורים כימי (חריגות השירותים הווטרינריים הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"ל הרביעי-0.010-0.015 מ ג/ק ג משקל גוף) יכול לשמש.
- האזור של הביופסיה הוא למצוא את הזכות 10-11 לחלל הבין-צלעי (איור 3). לצייר קו ישר מן coxae פקעת נכון עד לנקודה של הכתף הימנית. הביופסיה היא איפה הקו מצטלב עם המרחב הבין-צלעי 10-11. לחטא את האזור של הפרה להיות ביופסיה על ידי גילוח שטח מרובע 10 ס מ (איור 4). לשטוף את האזור עם 10% providone סקראב (איור 5) בתנועות מעגליות. תרסיס אזור עם 70% אתנול פתרון (איור 6). אני חוזר שוטף providone ואתנול.
הערה: הכבד הוא בעמדה שונה במקצת ב בקר לחלב הולשטיין לעומת בקר. - להזריק לידוקאין 2% HCl (10-15 מ ל) באופן מקומי לאזור כדי לספק הרדמה של העור, כבסיס שריר, רקמת חיבור (איור 7). חזור על providone ו-70% אתנול שוטף.
הערה: קצות העצבים בעור, שרירים, אבל האיברים הפנימיים לא, אז רק anesthestic מקומית נדרשת. לכל היותר, הפרה רק להרגיש קצת לחץ וכאב לא במהלך ההליך ביופסיה. - עושים 1-2 ס מ דקירה-חתך דרך העור של המרחב הבין-צלעי 10-11 (איור 8). לעבור מכשיר ביופסיה בכבד שור Schackelford-קורטני דרך העור ולכוון את המכשיר ביופסיה בכיוון הגולגולת קלה והמשיכו דרך הסרעפת ואת לתוך הכבד (איור 9, איור 10). להשיג דגימה 1 g של הכבד ולהסיר את המכשיר (איור 11). סגור את העור עם תפר השמה (איור 12).
- המקום הכבד מדגם צינור חרוטי עם מם מספיק כדי לכסות את הדגימה, על הקרח לבידוד המיטוכונדריה מיידית
- החתך הסימון עבור כל אדמומיות, נפיחות, חום, או כאב תוך 24 שעות של ביופסיה, להחדיר את הפרה Ceftiofur הידרוכלוריד 0.044 מ"ל לק"ג משקל גוף subcutaneously בצוואר פעם ביום למשך 3 הימים (איור 13). צג טמפרטורה של הפרה, צריכת ותוצאות צואה מדי יום במשך שבוע לאחר ביופסיה של הכבד. אם מתפתח חום, המשך אנטיביוטיקה שיקול דעתו של הוטרינר.
הערה: אם פרה הוא מפגין סימנים של כאב, כגון בעיטות החתך, recumbancy, אודם, חום או התגובה לגעת בתוך 1 h לאחר הביופסיה בכבד, זריקה הרביעי 1 מ"ג/ק"ג משקל גוף של flunixin meglumine ניתן להקל על כאב ודלקת. זריקה שנייה יכולה להינתן אם יש צורך בכך. - הסרת התפרים 7 ימים לאחר ביופסיה.
2. בידוד המיטוכונדריה מן הכבד לפרה
- בהקדם האפשרי לאחר המדגם הכבד מוסר הפרה, לשטוף את דגימת כבד במם (שלב 1.3) כדי להסיר תאי דם אדומים, דק מינצ הדגימה עם מספריים. הכבד צריך להיות טחון בתוך צוננת המכיל מספיק מדיה בידוד כדי לשמור את הרקמה לחות.
- מקום הכבד טחון לתוך בקבוקון זכוכית 30 מ עם המרוסקים טפלון על סיווג 0.16 מ"מ מודגרות בקרח, המכיל מם (1:4 w/v).
- Homogenize כבד מדגם שהעקב טפלון-500 סל ד עבור דקה עם קווים 4/min.
הערה: homogenate הכבד נשמרת על הספל וגדוש קרח במם במהלך התהליך כולו, ואת כל השלבים הבאים צנטריפוגה הושלמו ב 4 ° C - צנטריפוגה homogenate ב 500 g x 10 דקות, למחוק צניפה, להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה צוננת, ואז centrifuge את תגובת שיקוע שנוצר ב g 10,000 x 10 דקות להשיג בגדר מיטוכונדריאלי.
- Resuspend לרחוץ בגדר ב 10 מ"ל של מים עם חומצת שומן BSA חינם, צנטריפוגה-g 8100 x עבור 10 דקות להשליך תגובת שיקוע.
- Resuspend לרחוץ בגדר ב 10 מ"ל של MIM בלי חומצת שומן BSA חינם, צנטריפוגה-g 8100 x עבור 10 דקות להשליך תגובת שיקוע.
- להשעות את צניפה ב- µL 200 אמצעי בידוד ומניחים על הקרח עד המשמש צריכת החמצן של פרוטון הדליפה מבחני קינטי.
- לקבוע ריכוז חלבון של המתלה גלולה (דילול 1/100) באמצעות ערכת (BCA) חומצה Bicinchoninic לכל הפרוטוקול של היצרן עם BSA התקנית. כל חלבון הוא נחשב מיטוכונדריאלי חלבון.
3. מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי (מצב המדינה ו 3-4)
- יצירת מדיה צריכת חמצן (OCM) מ- 120 מ"מ אשלגן כלורי, 5 מ מ ח'2PO4, 5 מ מ MgCl2, 5 מ מ Hepes ו 1 מ"מ EGTA, pH 7.4 ב 30 ° C עם 0.3% defatted BSA. יהיה צורך כ- 3 מ לכל דגימה. גם להכין פתרון של 8 oligomycin μg/מ"ל אתנול.
- דגירה OCM ב 30 º C. להגדיר את הנשימה קאמרית, משאבת חמצן האלקטרודה לפי הוראות היצרן (oxygraph system). התוכנה oxygraph כבר צריך להיות מותקן במחשב.
- מקום 1 מ"ל של OCM אל החדר נשימה ומערבבים נמרצות. פעולה זו תסייע להבטיח כי הפתרון יהיה רווי האוויר.
- להוסיף 0.35 מ ג חלבון חלבון מיטוכונדריאלי לתא נשימה ולשמור על טמפרטורה 30 ° C.
- צריכת החמצן התקליטים במשך כ 5 דקות. ריכוז החמצן oxygraph רשומות מערכת כל כך כמו מגביר נשימה, ריכוז חמצן פוחתת. כאשר צריכת חמצן הופך קבוע (קו ישר יורדת), צריכת החמצן התקליטים (שיפוע של קו = ריכוז חמצן/שעה). זה צריכת חמצן בסיסית.
- להוסיף µL 1.25 של 4 מ מ פתרון rotenone לעכב מתחם אני ולאחר מכן להוסיף 5 µL של 1 מ' פתרון succinate להגיע ריכוז סופי בקנה הנשימה של 5 מ מ succinate. זהו מצב 4 נשימה.
- להוסיף 1 µL של 100 מ מ פתרון ADP להגיע ריכוז סופי בקנה הנשימה של 100 μM. ריכוז חמצן יקטן (נשימה מוגבר) ולאחר מכן לאחר כ 5 דקות הופך להיות קו ישר. להקליט את צריכת החמצן (שיפוע של קו = ריכוז חמצן/שעה). זהו מצב 3 נשימה.
- אופציונלי: בסוף המרוץ, להוסיף FCCP (הנפח הכולל של 0.2 μM) לזירוז נשימה מקסימלי. לתעד את הנשימה למשך בערך 5 דקות (בערך). כאשר צריכת חמצן הופך צריכת חמצן מתמדת, להקליט. זה צריכת חמצן מירבית.
- לחשב באמצעות המשוואה צריכת החמצן המדינה 3 יחס בקרת הנשימה (RCR) / המדינה צריכת חמצן 4.
- תשאף את כל הפתרונות מתוך נשימה. יש לשטוף את החדר כמה פעמים עם מים יונים כפול.
4. מדידת פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי (MMP) וכוח מניע פרוטון (PMF)
- להכין תמיסת nigericin 80 ננוגרם למ"ל אתנול.
הערה: הכימיקלים האלה הם מומס באתנול, כל מאמץ כדי להגביל את כמות האתנול הנוספים μL פחות מ- 1, מאז אתנול יכול לנתק את מערכת התחבורה אלקטרון ולגרום mitchondrial לקוי. - לאחר שטיפה ביסודיות את התא עם מים יונים כפול, מקום 1 מ"ל של OCM אל החדר נשימה ומערבבים נמרצות עם פס מגנטי מערבבים. פעולה זו תסייע להבטיח כי הפתרון יהיה רווי האוויר. הוסף מתיל-triphenyl-phosphonium אלקטרודה (TPMP +) רגיש לקנה ההתקנה. TPMP + אלקטרודה אמור להיות מחובר מד pH, ערכים הנקראות מד pH.
- להוסיף 0.35 מ ג חלבון מיטוכונדריאלי תא נשימה.
- הוסף µL 1.25 של 4 מ מ פתרון rotenone לעכב נשימה מורכבת אני רשומה למשך 2-5 דקות (בערך). כאשר צריכת חמצן הופך צריכת חמצן מתמדת, להקליט.
- הוסף μL 0.56 של 8 μg/mL oligomycin לפתרון הסופי ריכוז µg 2.8 oligomycin /0.35 מ"ג חלבון מיטוכונדריאלי לעכב ADP ניצול. לתעד את הנשימה למשך 2-5 דקות (בערך). כאשר צריכת חמצן הופך צריכת חמצן מתמדת, להקליט.
- הוסף 0.112 μL 80 ננוגרם למ"ל nigericin פתרון לבטל את ההדרגה pH על פני קרום פנימי מיטוכונדריאלי. לתעד את הנשימה למשך 2-5 דקות (בערך). כאשר צריכת חמצן הופך צריכת חמצן מתמדת, להקליט.
הערה: Rotenone, oligomycin משמשים כדי לחסום תעבורה אלקטרונים בשרשרת במתחם ו- ATP סינתאז, בהתאמה. Nigericin נוספת כדי להמיר transmembrane H + צבע הדרגתי K + שניתן למדידה עם אלקטרודה. - היכונו עיקול רגיל TPMP + על-ידי הוספת 5 µL של 10 מ מ TPMP + פתרון מיטוכונדריאלי הדגירה. חזור על שלב זה ארבע פעמים נוספות עד ריכוז מוחלט של 2.5 μM TPMP + נוספה.
- ליזום נשימה על-ידי הוספת 5 μL של 1 מ' succinate לתא.
- להקליט את הנשימה עד שהשגת עקבות יציב ולאחר מכן titrate את המערכת על-ידי הוספת malonate. תוספות של malonate צריך להיות 0.5 µL, 1 µL, 1.5 µL, 3.0 µL, 6.0 µL, µL 9.0, ואז 12.5 µL של 0.1 מ מ Malonate פתרון כדי להשיג תוספות רצופים של ריכוז malonate בחדר דגירה של 0.1 0.2 0.3, 0.6, 1.2, 1.8 ו- 2.5 מ מ.
- לאסוף נתונים שתי אלקטרודות (חמצן, TPMP+). תוכנה רכישת נתונים ממערכת oxygraph ניתן לאסוף בו זמנית מדידות של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי ואת מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית ולבחון שינויים בצריכת חמצן בזמן אמת. איור 14 מראה איך oxygraph רישום צריכת החמצן בהמשך הניסוי.
- לחשב MMP ב mV בהתבסס על משוואת נרנסט:
MMP = יומן 61.5 ([TPMP +] נוסף – חיצוניים [TPMP +]) x TPMP+ מחייב תיקון / (0.001 x מ"ג למ"ל חלבון x [TPMP +])
TPMP + מחייב תיקון של 0.4 mg/µL של חלבון מיטוכונדריאלי-1 משמש.
דוגמה החישוב מתבסס על ריכוזי בפרוטוקול:
MMP = יומן x 61.5 (5 מיקרומטר – 2 מיקרומטר) x 0.4 / (0.001 x 0.35 מ ג חלבון מיטוכונדריאלי/mL x 2 מיקרומטר)
MMP = 198.9 mV - הערכת PMF ידי גרף של MMP לעומת צריכת החמצן (איור 15). PMF המדווח צריכת חמצן פוטנציאל הממברנה של 165 mV.
הערה: Titrating את השרשרת אלקטרון תחבורה עם malonate (0.1-2.5 מ מ) מראה את התגובה קינטי של פרוטון דליפה MMP. לאחר מכן, התוויית MMP נגד צריכת החמצן קובע קינטיקה הדליפה פרוטון. PMF נקבעת על-ידי חישוב צריכת חמצן קרום נפוצות פוטנציאליים (165 mV). - בסוף ההפעלה האחרונה של המדגם, להוסיף FCCP (הנפח הכולל של 0.2 μM) כדי לגרום נשימה מקסימלי ולשחרר TPMP + לתיקון בסיסית.
- תשאף את כל הפתרונות מתוך נשימה. יש לשטוף את החדר כמה פעמים עם מים יונים כפול. בסופו של היום, התא צריך גם לשטוף כמה פעמים עם אתנול.
תוצאות
תוצאות חיוביות מציג קינטיקה הדליפה RCR ופרוטון מוצגים בטבלה 1 ו- 15 איור, בהתאמה. ב מחקר7, RCR ו חלבון הדליפה קינטיקה נמדדו ב פרות הולשטיין-70 יום בחלב אחרי הפרות היו הואכלו 1 של 5 רמות שונות של Zn, Cu, Mn במשך 28 ימים. המדינה 4, נשימה מקסימלית הפרוט?...
Discussion
הנקודה שבה רוב בפרוטוקול קבלת מדגם מייצג רקמת הכבד, מתחיל את ניתוקה של המיטוכונדריה בהקדם האפשרי לאחר ביופסיה. וריאציה במדידות נשימה הוא נמוך (טבלה 1) בשל תקופה קצרה בתחבורה ציבורית פרה למעבדה. כדי לצמצם את זמן תחבורה, מעבדה קטנה הוקם במשרד של החלב, דגימות הכבד גורשו למעבדה office כפי ...
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרנות Alltech פתח משרד החקלאות דרך המרכז לבריאות בעלי חיים מזון ב- UC דיוויס בית הספר לרפואה וטרינרית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).
- National Research Council. . Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved