Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein

Resumo

Aqui, nós compartilhamos métodos de medição do consumo de oxigênio mitocondrial, um definição conceito de nutricional energética e vazamento de prótons, a principal causa de ineficiência na geração mitocondrial de ATP. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes para ajudar a avaliar a função mitocondrial.

Resumo

Consumo de oxigênio, prótons força (PMF) e vazamento de próton são medidas da respiração mitocondrial, ou quão bem as mitocôndrias são capazes de converter o NADH e DANIII em ATP. Desde que as mitocôndrias são também o local principal para o uso de oxigênio e nutriente oxidação de dióxido de carbono e água, quanto à eficácia, eles usam o oxigênio e produzem ATP diretamente se relaciona com a eficiência do metabolismo de nutrientes, as necessidades de nutrientes do animal, e saúde do animal. A finalidade desse método é examinar a respiração mitocondrial, que pode ser usada para examinar os efeitos das diferentes drogas, dietas e os efeitos ambientais sobre o metabolismo mitocondrial. Os resultados incluem o consumo de oxigênio, medido como respiração dependente de próton (estado 3) e respiração dependente do vazamento próton (estado 4). A relação da respiração estado 4 3 / estado é definida como índice de controlo respiratório (ICR) e pode representar a eficiência energética mitocondrial. Vazamento de próton mitocondrial é um processo que permite a dissipação do potencial de membrana mitocondrial (MMP) desacoplamento fosforilação oxidativa do ADP, diminuindo a eficiência da síntese de ATP. Oxigênio e TRMP + eletrodos sensíveis com substratos mitocondriais e inibidores da cadeia de transporte de elétrons são usados para medir o estado 3 e 4 do estado respiração, membrana mitocondrial PMF (ou o potencial para produzir ATP) e vazamento de próton. Limitações para este método são que o tecido do fígado deve ser tão fresco quanto possível e todas as biópsias e ensaios devem ser realizados em menos de 10 h. Isso limita o número de amostras que podem ser recolhidos e tratados por uma única pessoa de um dia para aproximadamente 5. No entanto, é necessário apenas 1 g de tecido hepático, então em grandes animais, como gado leiteiro, a quantidade de amostra necessária é pequena em relação ao tamanho do fígado e há pouco tempo de recuperação necessário.

Introdução

As mitocôndrias são muito sensíveis ao estresse e seu ambiente celular pode contribuir para uma ampla variedade de doenças metabólicas. Consumo de oxigênio e vazamento de prótons na mitocôndria são indicadores de saúde de mitocôndrias. Os métodos descritos neste papel estimativa mitocondrial eficiência de energia usando RCR baseiam no consumo de oxigênio, com e sem vazamento de próton. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes¹. Mudanças no consumo e próton vazamento de oxigênio podem identificar a disfunção mitocondrial, o que contribui para doenças metabólicas e resulta em eficiência energética diminuída. Esses métodos também podem ser usados para examinar o efeito de diferentes tratamentos na respiração mitocondrial. O objectivo geral de medição de consumo de oxigênio mitocondrial e cinética de vazamento de próton é para avaliar a função mitocondrial e eficiência energética.

Disfunção mitocondrial hepática tem sido associada com várias doenças no gado leiteiro. A capacidade do metabolismo celular para alternar entre combustíveis carboidrato e lipídios quando confrontados com um déficit de energia no início da lactação é influenciada pelo número e função da mitocôndria na célula². Defeitos na capacidade das mitocôndrias de adaptar-se a um aumento da demanda de energia e aumento da β-oxidação podem levar ao acúmulo de lipídios intracelulares associados com resistência à insulina e podem levar à formação de esteatose hepática em vacas leiteiras de início da lactação. Mitocôndrias, como local de produção do corpo de cetona e uso, podem desempenhar um papel chave em cetose em vacas leiteiras³. Falta de mitocôndrias ou disfunção mitocondrial afetará a disponibilidade de combustível para a periferia e reflectir-se em mudanças no consumo de oxigênio ou RCR.

Alterações de consumo de oxigênio mitocondrial em resposta à inflamação. Sete dias de idade frangos foram aleatoriamente a um grupo de infectados com maxima de Eimeria e um grupo de controle⁴. Frangos de corte que não sofreu desafio de coccidiose tinham menor consumo de oxigênio devido ao vazamento de próton e RCR superior indicando que mitocôndrias hepáticas respondem a um desafio imune por crescente fuga de próton. Durante a fuga de próton e reativa produção de espécies de oxigênio foi considerada um sinal de disfunção da membrana mitocondrial e prejudicial para a eficiência energética, agora sabe-se que é importante para a importação de proteínas e cálcio em mitocôndrias⁵ e para a geração de calor¹.

Vazamento de elétrons da cadeia respiratória faz mitocôndrias suscetíveis à produção de espécies reativas de oxigênio e danos oxidativos às proteínas da membrana mitocondrial, lipídios e DNA mitocondrial. Como idade de mitocôndrias, dano pode acumular-se especialmente ao DNA mitocondrial, causando mais de disfunção no metabolismo mitocondrial⁶ e maior suscetibilidade da vaca a doença. Na prática, muitos animais de pecuária são alimentados com altos níveis de suplementos tais como Cu, Zn e Mn para impulsionar a função antioxidante. No entanto, alimentando a altos níveis de Cu, Zn e Mn diminuição da produção de leite e aumentaram do consumo de oxigênio devido a próton vazamento (respiração estado 4)⁷.

Pesquisas anteriores sobre o papel da função mitocondrial em eficiência energética em gado centrou-se sobre as mudanças no consumo de oxigênio mitocondrial e vazamento de próton. Poucos estudos foram publicados no gado leiteiro e a maioria dos jornais comparam a eficiência de produção sob a forma de consumo de ração residual (RFI) para a função mitocondrial em bovinos de corte. Variabilidade na respiração mitocondrial taxas foram examinadas através da medição o estado 3, estado 4 e RCR em fígados de carne de vaca em lactação e vacas em lactação de Holstein vacas (Angus, Brangus e Hereford)⁸. Os pesquisadores não encontrou qualquer correlação na respiração mitocondrial com crescimento ou ordenha traços dos bovinos, mas fizeram relatório uma correlação entre a respiração mitocondrial e traços para Holsteins de ordenha. Em dois estudos, RFI foi comparado em bovinos de corte para taxas de respiração mitocondrial (estado 3, estado 4 e RCR) no músculo mitocôndrias^9,10. Taxas de respiração mitocondrial alterada em resposta a DMI e taxas baixas foram associadas com novilhos de carne menos eficientes. Em outro estudo, RFI de novilhos de touros de alta ou baixos RFI foram comparados com as taxas de respiração mitocondrial e cinética de vazamento de protões entre os dois grupos de descendência¹¹. As diferenças foram devido ao ganho confirmando a conclusão de que a ganhar faz não respiração mitocondrial impacto em bovinos de corte.

Neste trabalho, um experimento para examinar o fígado RCR em resposta à alimentação 3 minerais antioxidante para gado de leite em lactação ilustra o uso de métodos para medir consumo de oxigênio durante 4 do estado e estado 3 respiração e PMF.

Protocolo

Todos os métodos, protocolo e estudos aqui descritos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia, Davis.

1. a obtenção de uma biópsia do fígado de uma vaca leiteira de Holstein

Nota: Uma biópsia do fígado deve ser realizada por um veterinário licenciado. Biópsias do fígado podem ser executadas no site onde se situam as vacas leiteiro. Vacas leiteiras em lactação podem continuar a ser ordenhada normalmente e leite não precisa ser retirada da fonte de alimentos antes ou após o procedimento. É recomendável que pelo menos 4 pessoas são necessários para realizar a biópsia do fígado em uma vaca leiteira: um veterinário para realizar a biópsia, um domador de animais repousar à anca da vaca para proteger a área da biópsia e veterinário, um técnico de laboratório do lado de fora da caneta de arqu er ferramentas, materiais e biópsia da amostra e para o veterinário e mantêm a área limpa, que pode ser na traseira de um veículo (Figura 1) e um técnico para recuperar a amostra de fígado e começar o isolamento mitocondrial.

1. Um mês antes de biópsias hepáticas, dar vacas uma vacinação de clostridia. Crie pacotes cirúrgicos por toalhas cirúrgicas de autoclavagem, instrumento de biópsia, titulares de bisturi e equipamento cirúrgico.
2. Um dia antes da biópsia do fígado, injete a vaca com cloridrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg de peso corporal por via subcutânea no pescoço. Monitorar a temperatura de vaca, a ingestão e fecais Partituras para usar como uma linha de base para a função normal.
3. Criar o manitol 220mm mitocôndrias isolamento mídia (MIM) containining, sacarose 70 mM, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA e 0,1% (p/v) ácido graxo livre BSA, pH 7,4 a 4 ° C. Serão necessários aproximadamente 30 mL por amostra.
4. Conter a vaca fisicamente utilizando uma chave de braço com um halter conforme necessário (Figura 2). Usando o cabresto, amarre a cabeça para o lado esquerdo do poste. Se necessário, um contenção química (xilazina cloridrato 100mg/mL IV em 0.010-0.015 mg/kg de peso corporal) pode ser usado.
5. A área da biópsia é encontrado no espaço de intercostal direito 10 - 11 (Figura 3). Desenhe uma linha reta de coxae o tubérculo certo ao ponto do ombro direito. No local da biópsia é onde esta linha cruza-se com o espaço intercostal 10-11. Esterilize a área da vaca a biopsar cortando uma área quadrada de 10 cm (Figura 4). Lave a área com esfoliante de providone de 10% (Figura 5) usando um movimento circular. Pulverizar a área com solução de etanol 70% (Figura 6). Repetição de lavagens de providone e etanol.
   Nota: O fígado está em uma posição ligeiramente diferente em vacas leiteiras Holstein, em comparação com bovinos de corte.
6. Injete lidocaína a 2% HCl (10-15 mL) localmente à área para fornecer anestesia da pele e músculo subjacente e do tecido conjuntivo (Figura 7). Repeti providone e lavagens de etanol 70%.
   Nota: As terminações nervosas estão na pele e músculos, mas os órgãos internos não, tão somente um local anesthestic é necessária. No máximo, a vaca deve apenas sentir alguma pressão e sem dor durante o procedimento de biópsia.
7. Faça uma facada de 1-2cm-incisão através da pele do espaço intercostal 10-11 (Figura 8). Passar de um instrumento de biópsia do fígado bovino Schackelford-Courtney através da pele e direcionar o instrumento em uma ligeira direção cranial, continuando através do diafragma e o fígado (Figura 9, Figura 10). Obter uma amostra de 1g do fígado e retire o instrumento (Figura 11). Feche a pele com a colocação de sutura (Figura 12).
8. Colocar a amostra de fígado em um tubo cônico com suficiente de MIM para cobrir a amostra, no gelo para isolamento de mitocôndrias imediata
9. Incisão de seleção para qualquer vermelhidão, inchaço, calor, ou dor dentro de 24 horas da biópsia e injetar a vaca com cloridrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg de peso corporal por via subcutânea no pescoço uma vez por dia durante os próximos 3 dias (Figura 13). Monitore temperatura da vaca, a ingestão e escores fecais diariamente por 1 semana após a biópsia do fígado. Se desenvolve uma febre, continue antibióticos a critério do veterinário.
   Nota: Se uma vaca está exibindo sinais de dor, tais como chutar para o local da incisão, recumbancy, vermelhidão, calor ou reação ao toque dentro de 1h após a biópsia do fígado, uma injeção de IV 1 mg/kg de peso corporal de flunixin meglumine pode ser usada para aliviar a dor e inflamação. Uma segunda injeção pode ser administrada se necessário.
10. Remova suturas 7 dias após a biópsia.

2. isolar mitocôndrias de fígado de vaca leiteira

1. Logo que possível após a amostra de fígado é retirada da vaca, lave a amostra de fígado em MIM (etapa 1.3) para remover as células vermelhas do sangue e picar finamente a amostra com uma tesoura. O fígado deve ser picado num copo gelado contendo suficientes meios de isolamento para manter o tecido úmido.
2. Coloque o fígado picado dentro de um frasco de vidro de 30 mL com um pilão de teflon de afastamento 0,16 mm incubada em gelo e contendo a MIM (1:4 w/v).
3. Homogeneizar a amostra de fígado em um pilão de teflon em 500 rpm por um minuto com 4 ciclos/min.
   Nota: O fígado homogeneizado é mantido em um copo cheio de gelo em MIM durante todo o processo, e todas as seguintes etapas de centrifugação são concluídas em 4 ° C
4. Homogeneizado em 500 x g durante 10 minutos de centrifugação, descartar a pelota, transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga refrigerada e centrifugar o sobrenadante resultante a 10.000 x g durante 10 minutos obter a pelota mitocondrial.
5. Resuspenda e lave o pellet em 10 mL de MIM com ácido graxo livre BSA e centrifugar a 8100 x g durante 10 min. Discard sobrenadante.
6. Resuspenda e lave o pellet em 10 mL de MIM sem ácido graxo livre BSA e centrifugar a 8100 x g durante 10 min. Discard sobrenadante.
7. Suspender o sedimento em 200 µ l de mídia de isolamento e Coloque gelo até utilizado para consumo de oxigênio e ensaios cinéticos de vazamento de próton.
8. Determine a concentração da proteína, da suspensão da pelota (diluição 1/100), usando o kit de (BCA) ácido Bicinchoninic acordo com o protocolo do fabricante com BSA como padrão. Toda proteína é considerada proteína mitocondrial.

3. medição do consumo de oxigênio mitocondrial (estado 4 3 e estaduais)

1. Criar mídia de consumo de oxigênio (OCM) de 120 mM KCl, 5mm KH₂PO₄, 5mm MgCl₂, 5mm Hepes e 1mm EGTA, pH 7,4 a 30 ° C, com 0,3% desengordurada BSA. Serão necessários aproximadamente 3 mL por amostra. Também prepare uma solução de 8 oligomicina μg/mL em etanol.
2. Incubar a OCM a 30 ° C. Configure o eletrodo de câmara, bomba e oxigênio de respiração de acordo com as instruções do fabricante (sistema oxygraph). O software de oxygraph já deve estar instalado no computador.
3. Coloque 1 mL de OCM na câmara de respiração e agite vigorosamente. Isso ajudará a garantir que a solução se torna saturada com ar.
4. Adicionar a proteína de 0,35 mg de proteína mitocondrial para a câmara de respiração e manter a temperatura a 30 ° C.
5. Registrar o consumo de oxigênio por aproximadamente 5 min. A concentração de oxigênio de registros de sistema de oxygraph assim como a respiração aumenta, a concentração de oxigênio diminui. Quando o consumo de oxigênio se torna constante (uma linha reta decrescente), consumo de oxigênio de registro (inclinação da linha = concentração de oxigênio/hora). Este é o consumo de oxigênio de linha de base.
6. Adicionar 1,25 µ l da solução de rotenona 4mm para inibir o complexo eu e em seguida, adicione 5 µ l de solução 1 M de succinato para atingir uma concentração final de succinato de 5mm na câmara respiratória. Esta é a respiração do estado 4.
7. Adicione 1 µ l de solução de ADP 100 mM para atingir uma concentração final de 100 μM na câmara de respiração. Concentração de oxigênio vai diminuir (respiração aumentada) e, em seguida após aproximadamente 5 min torna-se uma linha reta. Registrar o consumo de oxigênio (inclinação da linha = concentração de oxigênio/hora). Esta é a respiração do estado 3.
8. Opcional: No final da corrida, adicione FCCP (volume total de 0,2 μM) para induzir a respiração máxima. Grave a respiração por cerca de 5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro. Este é o consumo máximo de oxigênio.
9. Calcular o controle respiratório Ratio (RCR) usando a equação de estado 3 consumo de oxigênio / estado 4 consumo de oxigênio.
10. Aspire todas as soluções fora da câmara de respiração. Lave a câmara várias vezes com água desionizada.

4. medir o potencial de membrana mitocondrial (MMP) e força motriz de prótons (PMF)

1. Prepare a solução de 80 nigericin ng/mL em etanol.
   Nota: Estes produtos químicos são dissolvidos em etanol, e todo esforço deve ser feito para limitar a quantidade de etanol que é adicionada a menos de 1 μL, desde que o etanol pode desacoplar o sistema de transporte de elétrons e causar disfunção mitchondrial.
2. Após enxaguar cuidadosamente a câmara com água desionizada, coloque 1 mL da OCM na câmara de respiração e agitar vigorosamente com uma barra de agitação magnética. Isso ajudará a garantir que a solução se torna saturada com ar. Adicione o eletrodo metil-trifenil-do phosphonium (TPMP +) sensível para instalação de câmara. TPMP + eletrodo deve ser ligado a um medidor de pH e valores são lidos a partir do medidor de pH.
3. Adicione 0,35 mg de proteína mitocondrial para a câmara de respiração.
4. Adicione 1,25 µ l da solução de rotenona 4mm para inibir a respiração do complexo I. registro para 2-5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro.
5. Adicione 0,56 μL de solução de oligomicina 8 μg/mL para uma concentração final de 2,8 µ g oligomicina 0,35 mg de proteína mitocondrial para inibir a utilização da ADP. Grave a respiração durante 2-5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro.
6. Adicione solução de nigericin 0.112 μL 80 ng/mL para abolir o gradiente de pH através da membrana mitocondrial interna. Grave a respiração durante 2-5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro.
   Nota: Rotenona e oligomicina são usados para bloquear o transporte de elétrons da cadeia no complexo I e a ATP sintase, respectivamente. Nigericin é adicionado para converter do transmembrane H + gradiente um gradiente K + que pode ser medido com um eletrodo.
7. Prepare uma curva padrão para TPMP + pela adição de 5 µ l de solução TPMP + 10 mM para a incubação mitocondrial. Repita este passo quatro vezes mais até uma concentração total de 2,5 μM TPMP + foi adicionada.
8. Inicie a respiração, adicionando 5 μL de succinato de 1M para a câmara.
9. Gravar a respiração até que você tenha conseguido um traço estável e titula-se em seguida o sistema adicionando malonato. Adições de malonato devem ser 0,5 µ l, 1 µ l, 1,5 µ l, µ l 3.0, 6,0 µ l, 9.0 µ l, então 12,5 µ l de 0,1 mM malonato solução para alcançar adições sucessivas de malonato concentrações em câmara úmida de 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8 e 2,5 mM.
10. Colete dados de dois eletrodos (oxigênio e TPMP⁺). Software de aquisição de dados do sistema de oxygraph pode ser usado para coletar medições simultâneas de consumo de oxigênio mitocondrial e potencial de membrana mitocondrial e observar alterações no consumo de oxigênio em tempo real. A Figura 14 mostra como o sistema de oxygraph registra o consumo de oxigênio no decorrer do experimento.
11. Calcule MMP na mV com base na equação de Nernst:
    MMP = 61,5 log ([TPMP +] adicionado – external [TPMP +]) correção de ligação x TPMP+ / (x 0,001 mg de proteína/mL x TPMP [+])
    Uma correção de vinculação TPMP + 0,4 µ l/mg de proteína mitocondrial^-1 é usada.
    Cálculo de exemplo baseado em concentrações no protocolo:
    MMP = 61,5 x log (5 µM – 2 µM) x 0,4 / (0.001 x 0,35 mg proteína mitocondrial/mL x 2 µM)
    MMP = 198.9 mV
12. Estimativa do DPP plotando um gráfico de consumo de MMP vs oxigênio (Figura 15). PMF é relatado como o consumo de oxigênio em um potencial de membrana de 165 mV.
    Nota: Titulada a cadeia de transporte electrónico com malonato (0,1 a 2,5 mM) mostra a resposta cinética do vazamento de protões para MMP. Em seguida, MMP a conspirar contra o consumo de oxigênio determina a cinética de vazamento do próton. PMF é determinado pelo cálculo do consumo de oxigênio em um potencial de membrana comum (165 mV).
13. No final da última corrida da amostra, adicione FCCP (volume total de 0,2 μM) para induzir a respiração máxima e liberar TPMP + para correção de linha de base.
14. Aspire todas as soluções fora da câmara de respiração. Lave a câmara várias vezes com água desionizada. No final do dia, a câmara deve também ser lavada várias vezes com etanol.

Resultados

Resultados positivos, mostrando a cinética de vazamento RCR e prótons são mostrados na tabela 1 e Figura 15, respectivamente. No presente estudo⁷, RCR e proteína vazamento cinética foram medidos em vacas leiteiras Holstein em 70 dias no leite depois que as vacas tinham sido alimentadas 1 dos 5 níveis diferentes de Cu, Zn e Mn por 28 dias. Estado 4, respiração de vazamento-dependente de próton máximo, tinha um...

Discussão

O ponto mais crítico no protocolo é obter uma amostra representativa de tecido hepático e começando o isolamento da mitocôndria, logo que possível após a biópsia. Variação nas medições de respiração é baixa (tabela 1) devido a um tempo de transporte curto de vaca para laboratório. Para reduzir o tempo de transporte, foi instituído um pequeno laboratório no escritório da leiteria, e amostras de fígado foram levadas para o laboratório de escritório como cada uma foi coletada para que ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument	Sontec Instruments Englewood CO	1103-904
Suture	Fisher Scientific	19-037-516
Suture needles	NA	NA	Included with Suture
Scalpels	Sigma - Aldrich	S2896 / S2646	# for handle and blades
Surgery towels	Fisher Scientific	50-129-6667
Falcon tubes 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Tweezers	Sigma - Aldrich	Z168750
50 mL syringes	Fisher Scientific	22-314387
Injection needles (22, 2 1/2)	VWR	MJ8881-200342
Cow halter	Tractor Supply Co.	101966599
Cotton swabbing	Fisher Scientific	14-959-102
cotton gauze squares (4x4)	Fisher Scientific	22-246069
Medical scissors	Sigma - Aldrich	Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow			Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine			Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days			Provided by Veterinarian
Providone Scrub	Aspen Veteterinary Resources	21260221
Ethanol 70%	Sigma - Aldrich	793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight			Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL)			Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine			Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance	Fisher Scientific	02-911-527
Homogenizer Motor	Cole Parmer	EW-04369-10
Homogenizer Probe	Cole Parmer	EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL)	Cole Parmer	SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice	Fisher Scientific	FB100600
Refrigerated microfuge	Fisher Scientific	75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)	abcam	ab102536
Sucrose	Sigma - Aldrich	S7903-1KG
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma - Aldrich	EDS-1KG
BSA (fatty acid free)	Sigma - Aldrich	A7030-50G
Mannitol	Sigma - Aldrich	M4125-1KG
Deionized water	Sigma - Aldrich	38796
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode	Hansatech (PP Systems)	OXY1
Thermoregulated Water Pump	ADInstruments	MLE2001
Clark type Oxygen electrode	NA	NA
Autopipette (1 mL)	Cole Parmer	SK-21600-70	Included with Oxy1
Small magnetic stir bar	Fisher Scientific	14-513-95
Micropipette (10 μL)	Cole Parmer	SK-21600-60
pH meter	VWR
Chemicals
KCl	Sigma - Aldrich	P9333-1KG
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
KH2PO4	Sigma - Aldrich	P5655-1KG
MgCl2	Sigma - Aldrich	M1028-100ML
EGTA	Sigma - Aldrich	E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution)	Sigma - Aldrich	R8875-5G
Succinate (1 M solution)	Sigma - Aldrich	S3674-250G
ADP (100 mM solution)	Sigma - Aldrich	A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol)	Sigma - Aldrich	75351
FCCP	Sigma - Aldrich	C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode	World Precision Instruments.	DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution)	Sigma - Aldrich	M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma - Aldrich	75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma - Aldrich	N7143
FCCP	Sigma - Aldrich	C3920
TPMP	Sigma - Aldrich	T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA