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요약

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 산소 소비, 영양에 너 지론, 및 양성자 누출, 미토 콘 드리 아에서 ATP 비능률적의 주요 원인의 정의 개념을 측정 하기 위한 방법 공유. 이러한 결과 미토 콘 드리 아 기능을 평가할 수 있도록 영양소 사용률에 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다.

초록

산소 소비, 양성자 동기 힘 (PMF) 그리고 양성자 누출 측정의 미토 콘 드리 아 호흡, 또는 얼마나 잘 미토 콘 드리 아 ATP로 NADH와 FADH 변환할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아도 산소 사용 및 이산화탄소와 물에 영양분 산화에 대 한 기본 사이트 이기 때문에, 그들이 얼마나 효율적으로 산소를 사용 하 고 직접 ATP를 생산 영양소 대사의 효율성에 관한 동물의 영양소 요구 사항 및 동물의 건강입니다. 이 방법의 목적은 다른 약물, 다이어트와 미토 콘 드리 아 대사에 환경에 미치는 영향의 효과 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 미토 콘 드리 아 호흡을 살펴보는 것입니다. 결과 산소 소비를 양성자 종속 호흡 (주 3) 및 양성자 누출 종속 호흡 (주 4)으로 측정 포함 됩니다. 주 3 / 주 4 호흡의 비율 호흡 제어 비율 (RCR)로 정의 되 고 미토 콘 드리 아 에너지 효율을 나타낼 수 있습니다. 미토 콘 드 리아 양성자 누출에서 ADP ATP 합성의 효율을 감소 연결을 푸는 산화 인 산화에 의해 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 (MMP)의 소비를 허용 하는 프로세스입니다. 미토 콘 드리 아 기질 및 전자 수송 체인 억제제 산소와 TRMP + 민감한 전극 상태 3 주 4 호흡, 미토 콘 드 리아 멤브레인 PMF (또는 ATP 생산 잠재력)를 측정 하는 데 사용는 양성자 누출. 이 방법에 한계는 간 조직을 최대한 신선한 해야 모든 생 검 및 분석 실험 10 h이 하에서 수행 되어야 합니다. 이 샘플을 수집 하 고 약 5 하루에 한 사람에 의해 처리 수의 수를 제한 합니다. 그러나, 간 조직 1 g만 필요, 그래서 젖소와 같은 큰 동물에 필요한 샘플의 금액은 간 크기에 상대적으로 작은 작은 복구 시간이 필요 합니다.

서문

미토 콘 드리 아 스트레스에 매우 민감합니다 그리고 그들의 세포질 환경 다양 한 대사 질환에 기여할 수 있다. 산소 소비와 양성자 누출 미토 콘 드리 아에는 미토 콘 드리 아 건강의 지표입니다. 산소 소비와 양성자 누출 없이 RCR을 사용 하 여이 종이 견적 미토 콘 드 리아 에너지 효율에 설명 된 방법을 기반으로 합니다. 이러한 결과 영양소 사용률1에서 손실 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다. 산소 소비와 양성자 누출에 변화는 신진 대사 질환에 기여 하 고 감소 에너지 효율에서 결과 미토 콘 드 리아 기능 장애를 식별할 수 있습니다. 이러한 방법 또한 미토 콘 드리 아 호흡에 다른 처리의 효과 검사를 사용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 측정의 전반적인 목표는 미토 콘 드리 아 기능 및 에너지 효율 평가입니다.

간 미토 콘 드 리아 기능 장애 젖소에 여러 가지 질병으로 연결 되었습니다. 수 유 초기에 에너지 적자를 직면 하는 때 지질과 탄수화물 연료 전환 세포질 물질 대사 수 숫자 셀2에 미토 콘 드리 아의 기능에 의해 좌우 된다. 에너지와 증가 β-산화에 대 한 증가 수요에 적응 하는 미토 콘 드리 아의 능력에 결함이 인슐린 저항와 관련 된 세포내 지질의 축적으로 이어질 수 있습니다 그리고 젖소 초 유에에서 지방 간의 형성으로 이어질 수 있습니다. 미토 콘 드리 아, 케 톤 체 생산 및 사용의 사이트로 젖소3ketosis에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 또는 미토 콘 드 리아 기능 장애의 부족 주변에 연료 가용성에 영향을 미칠 것이 고 산소 소비 또는 RCR 변화에 반영.

염증 반응의 미토 콘 드리 아 산소 소비 변화입니다. 7-하루-오래 된 브로 일러에 감염 된 Eimeria 맥시 마 와 제어 그룹4그룹에 무작위로 지정 되었다. Coccidiosis 도전 받아야 하지 않았다 broilers 양성자 누출 및 높은 RCR 간 미토 콘 드리 아 증가 양성자 누출에 의해 면역도 전에 대응을 나타내는 낮은 산소 소비를 했다. 양성자 누출 동안 및 반응성 산소 종 생산 미토 콘 드 리아 멤브레인 부전의 상징으로 간주 한 번 했다 고 에너지 효율, 해로운 지금 알려져 있다 미토 콘 드리 아5 으로 단백질과 칼슘의 가져오기에 대 한 중요 하다는 것 열1의 세대에 대 한.

호흡기 체인에서 전자 누출에 게 미토 콘 드리 아 반응 산소 종 생산 및 산화 손상에 취약 미토 콘 드 리아 멤브레인 단백질, 지질 및 미토 콘 드리 아 DNA. 미토 콘 드리 아 나이, 손상 더 미토 콘 드리 아 대사6 에 더 큰 민감성 질병에 암소의 부전을 일으키는 mtDNA를 특히 누적 될 수 있습니다. 실제로, 많은 가축 동물 보충 항 산화 기능을 강화 하는 Cu, Zn와 Mn 등의 상부를 먹인 다. 그러나, 높은 수준의 Cu, Zn와 Mn 우유 생산 감소 유와 양성자 누출 (상태 4 호흡)7인 산소 소비를 증가.

미토 콘 드 리아 기능 가축에 에너지 효율에서의 역할에 대 한 이전 연구는 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출에 변화에 집중 했다. 젖소에 거의 연구 출판 되었습니다 및 대부분 논문 쇠고기 가축에 미토 콘 드리 아 기능에 잔여 먹이 섭취 (RFI)의 형태로 생산 효율을 비교 합니다. 미토 콘 드리 아 호흡 속도 양모 홀스타인 암소를 젖을 쇠고기 간에서 주 3, 주 4 및 RCR을 측정 하 여 시험 되었다 다양성 소 (앵거스, Brangus와 헤 리)8. 연구원은 성장 또는 쇠고기 가축에 대 한 특성을 짤 미토 콘 드리 아 호흡에 어떤 상관 관계를 찾지 못했습니다 하지만 미토 콘 드리 아 호흡 및 우유 홀스타인 열에 대 한 특성 간의 상관 관계를 보고 했다. 두 연구, RFI 근육 mitochondria9,10에 미토 콘 드리 아 호흡 요금 (3, 4 주와 RCR 상태) 쇠고기 가축에 비교 되었다. 미토 콘 드리 아 호흡 속도 DMI에 대 한 응답에서 변경 하 고 낮은 속도 덜 효율적인 쇠고기 steers와 관련 되었다. 또 다른 연구에서는, 높은 또는 낮은 RFI 불스에서 steers의 RFI 미토 콘 드리 아 호흡 속도 양성자 누출 속도 론 자손11의 두 그룹 사이 비교 되었다. 차이 때문에 이득 얻을 결론 쇠고기 가축에서 미토 콘 드리 아 호흡을 영향 하지 않습니다 확인 했다.

이 논문에서는, 실험 3 항 산화 미네랄 양모 젖소를 먹이에 대 한 응답 RCR에서는 측정 하는 방법 사용 하는 간 검사 중 산소 소비 4 고 3 호흡 및 PMF 상태.

프로토콜

모든 메서드, 프로토콜 및 여기서 설명 하는 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 캘리포니아 대학, 데이비스 승인 되었다.

1. 홀스타인 낙농 암소에서 간 생 검을 얻기

참고: 간 생 검은 허용한 수 의사에 의해 수행 되어야 한다. 간 생 검 젖소는 유제품 사이트에 수행할 수 있습니다. 일반적으로 젖을 계속 젖이 젖소 그리고 우유 식량 공급 절차 전후에서 철회 될 필요가 없습니다. 적어도 4 명 낙농 소에 간 생 검을 수행 해야 하는 것이 좋습니다: 생 검, 생 검 위치 및 수 의사, 세가에 펜의 외부에 실험실 기술자를 보호 하기 위해 암소의 엉덩이에 서는 동물 처리기를 수행 하는 수 의사 어 도구, 재료와 생 수 의사에서 샘플 고 뒤쪽에 차량 (그림 1), 그리고 간 샘플을 검색 하 여 미토 콘 드리 아 격리 시작 기술 자가 될 수 있는 깨끗 한 영역을 유지.

  1. 1 개월 간 생 검 전에 주고 소 clostridia 예방 접종. 압력가 마로 소독 외과 수건, 생 검 계기, 메스 홀더 및 수술 장비 수술 팩을 만듭니다.
  2. 간 생 검 전에 1 일 Ceftiofur 염 0.044 mL/kg bodyweight 목에 피하와 암소를 주사. 암소 온도, 입구 및 정상적인 기능에 대 한 기준으로 사용 하 여 배설물로 점수를 모니터링 합니다.
  3. 4 ° c.에 미토 콘 드리 아 격리 미디어 (MIM) containining 220 m m 마 니 톨, 70mm 자당, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, 및 0.1% (w/v) 지방산 무료 BSA, pH 7.4 만들기 샘플 당 약 30 mL이 필요 합니다.
  4. 제 지 소 필요에 따라 물리적으로 고삐를 놓지를 활용 하 여 (그림 2). 고삐를 사용 하 여 그녀의 머리는 기둥의 왼쪽에 넥타이. 필요한 경우, 화학 구속 (Xylazine 0.010 0.015에서 염 산 100 mg/mL 4 mg/kg 체중) 사용할 수 있습니다.
  5. 생 검의 영역 오른쪽 10-11 늑 공간 (그림 3)에서 발견 된다. 오른쪽 어깨의 지점에 오른쪽 결 절 coxae에서 직선을 그립니다. 생 검 사이트가이 라인 10-11 늑 공간와 교차 하는 곳입니다. 10 cm의 사각형 영역 (그림 4)를 면도 하 여 biopsied 되도록 암소의 영역을 소독. 10 %providone 스크럽 (그림 5) 원형 모션을 사용 하 여 영역을 씻어. 스프레이 영역 70% 에탄올 용액 (그림 6). 반복 providone 및 에탄올 세척입니다.
    참고: 간 쇠고기 가축에 비해 홀스타인 젖소에서 약간 다른 위치에 있다.
  6. 피부와 내부 근육과 결합 조직 (그림 7)의 마 취를 제공 하기 위해 지역에 2% lidocaine HCl (10-15 mL)를 로컬로 주사. Providone 및 70% 에탄올 세척을 반복 합니다.
    참고: 피부에 신경 엔딩은 고 하지 내부 장기, anesthestic만 로컬 하지만 근육이 필요 하다. 대부분, 암소만 느껴야 어떤 압력과 고통 생 검 절차 중.
  7. 1-2 cm 자상-절 개를 통해 10-11 늑 공간 (그림 8)의 피부를 확인 합니다. 피부를 통해 Schackelford-코 티 소 간 생 검 계기를 통과 하 고 통해 횡 경 막과 간 (그림 9, 그림 10)에 계속 하는 동안 약간의 두개골 방향에 생 악기를 직접. 간 1 g 샘플을 악기 (그림 11)를 제거 합니다. 피부 봉합 배치 (그림 12)를 닫습니다.
  8. 즉각적인 미토 콘 드리 아 격리에 대 한 얼음에 샘플을 충당 하기 위해 충분 한 MIM 원뿔 튜브에 장소 간 샘플
  9. 어떤 빨갛게, 붓기에 대 한 검사 절 개 열, 또는 생 검의 24 시간 이내에 통증 및 주입 암소 목에 피하 Ceftiofur 염 0.044 mL/kg bodyweight (그림 13) 다음 3 일 동안 하루에 한 번. 간 생 검 후 1 주 동안 암소의 온도, 섭취 및 배설물 점수 매일 모니터링 합니다. 발열을 개발 하 고, 수 의사의 판단에 따라 항생제를 계속 합니다.
    참고: 지금까지 소 간 생 검 후 1 시간 이내 터치 통증, 절 개 사이트, recumbancy, 빨갛게, 열, 또는 반응에서 내보내는 등의 흔적을 전시는 경우에 1 mg/kg bodyweight IV 주입 flunixin meglumine의 통증과 염증을 완화 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 필요한 경우 두 번째 주사를 관리할 수 있습니다.
  10. 생 후 7 일 봉합을 제거 합니다.

2. 미토 콘 드리 아에서 낙농 소 간 격리

  1. 간 샘플 암소에서 제거 후에 가능한 한 빨리 붉은 혈액 세포를 제거 하 고 잘게가 위로 샘플을 말하다 (1.3 단계) MIM에 간 샘플을 씻어. 간 촉촉한 조직 유지에 충분 한 절연 미디어를 포함 하는 냉된 비 커에 다진 합니다.
  2. 0.16 m m 허가 얼음에서 incubated와 MIM (1:4 w/v)를 포함 하는 테 플 론 유 봉 다진된 간 30 mL 유리 유리병에 넣습니다.
  3. 4 선/min 분 500 rpm에 테 플 론 유 봉 간 샘플 균질
    참고: 간 homogenate 전체 과정에서, MIM에 얼음 포장 비 커에 보관 됩니다 및 모든 다음 원심 분리 단계 4 ° C에서 완료
  4. 10 분 동안 500 x g에서 homogenate 원심, 펠 릿을 버리고, 냉장된 원심 분리기 튜브에 상쾌한을 전송 및 다음 결과 상쾌한 미토 콘 드리 아 펠 렛을 얻기 위해 10 분 동안 10000 x g에서 원심.
  5. Resuspend 및 지방산 무료 BSA와 MIM의 10 mL에 펠 릿을 세척 하 고 10 분 삭제 상쾌한 8100 x g에서 원심.
  6. Resuspend와 MIM 지방산 무료 BSA 없이 10 mL에 펠 릿을 세척 하 고 10 분 삭제 상쾌한 8100 x g에서 원심.
  7. 격리 미디어의 200 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 고 산소 소비와 양성자 누출 운동 분석 실험을 위해 사용 될 때까지 얼음에 놓습니다.
  8. 표준으로 BSA와 제조 업체의 프로토콜 당 Bicinchoninic 산 (BCA) 키트를 사용 하 여 펠 렛 서 스 펜 션 (1/100 희석)의 단백질 농도 결정 합니다. 모든 단백질은 미토 콘 드리 아 단백질 간주.

3. 미토 콘 드리 아 산소 소비 (주 3 주 4) 측정

  1. 5 mM Hepes와 1mm EGTA, pH 7.4 0.3 %30 ° C에서 defatted BSA, 120 m m KCl, 5mm KH2포4, 5 mM MgCl2에서 산소 소비 미디어 (OCM)를 만듭니다. 샘플 당 약 3 mL이 필요 합니다. 또한 8 μ g/mL oligomycin 에탄올에서의 솔루션을 준비 합니다.
  2. 30 ° c.에 OCM을 품 어 호흡 약 실, 펌프 및 산소 전극 제조 지시 (oxygraph 시스템)를 설정 합니다. Oxygraph 소프트웨어는 이미 컴퓨터에 설치 되어야 한다.
  3. 호흡 챔버로 OCM의 1 mL를 배치 하 고 적극적으로 저 어. 이 솔루션 공기 포화 된다 확실히 도움이 됩니다.
  4. 호흡 약 실에 미토 콘 드리 아 단백질의 0.35 mg 단백질을 추가 하 고 30 ° c.에 온도 유지
  5. 약 5 분 동안 산소 소비를 기록 합니다. Oxygraph 시스템 레코드 산소 농도 그래서 호흡 증가, 산소 농도 감소합니다. 산소 소비 되 면 상수 (감소 직선), 기록 산소 소비 (선의 기울기 농도 산소/시간 =). 이것은 초기 산소 소비입니다.
  6. 1.25 µ L 복잡 하 4 m m로 테 논 솔루션의 추가 나 5mm 호박의 호흡기 실에서 최종 농도 도달 1 M 합성 솔루션의 5 µ L 추가. 이것은 상태 4 호흡 이다.
  7. 100 μ M의 호흡 실에서 최종 농도 도달 100 m m ADP 솔루션의 1 µ L를 추가 합니다. 산소 농도 (증가 한 호흡) 줄어 다음 직선 약 5 분 후. 산소 소비를 기록 (선의 기울기 농도 산소/시간 =). 이것은 상태 3 호흡 이다.
  8. 선택 사항: 실행의 끝에, 최대한 호흡을 유도 하기 위해 FCCP (0.2 μ M 총 볼륨) 추가 합니다. (약) 약 5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다. 이것은 극대 산소 소비입니다.
  9. 호흡 제어 비율 (RCR) 방정식 상태 3 산소 소비를 사용 하 여 계산/4 산소 소비 상태.
  10. 호흡 약 실에서 솔루션의 모든 발음. 더블 이온된 물으로 여러 번 챔버 린스.

4. 미토 콘 드리 아 막 잠재력 (MMP) 및 양성자 동기 힘 (PMF) 측정

  1. 에탄올에 80 ng/mL nigericin의 솔루션을 준비 합니다.
    참고: 이러한 화학 물질은 에탄올, 해산 하 고 모든 노력 에탄올 전자 교통 시스템 연결을 푸십시오 하 고 mitchondrial 장애를 일으킬 수 있기 때문에 1 μ, 추가 되는 에탄올의 양을 제한 하 여야 한다.
  2. 철저 하 게 rinsing 후 이중 이온된 수와 챔버, 1 mL는 OCM의 호흡 챔버에 놓고 저으 적극적으로 자기 저 어 바. 이 솔루션 공기 포화 된다 확실히 도움이 됩니다. 메 틸-triphenyl-phosphonium (TPMP +) 민감한 전극 설치 챔버를 추가 합니다. TPMP + 전극 pH 미터에 연결 되어야 하 고 값 pH 미터에서 읽혀집니다.
  3. 호흡 약 실에 미토 콘 드리 아 단백질의 0.35 밀리 그램을 추가 합니다.
  4. (약) 2-5 분에 대 한 복잡 한 I. 기록 호흡을 억제 하기 위해 4 m m로 테 논 솔루션의 1.25 µ L를 추가 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다.
  5. 2.8 µ g oligomycin ADP 사용률을 억제 하기 위해 미토 콘 드리 아 단백질의 /0.35 mg의 최종 농도 대 한 8 μ g/mL oligomycin 솔루션의 0.56 μ를 추가 합니다. (약) 2-5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다.
  6. 미토 콘 드리 아 내 막에 걸쳐 pH 기온 변화도 폐지 하 고 0.112 μ 80 ng/mL nigericin 솔루션을 추가 합니다. (약) 2-5 분 동안 호흡을 기록 합니다. 때 산소 소비 일정, 기록 산소 소비 된다.
    참고:로 테 논과 oligomycin 전자 수송을 차단 하는 데 사용 됩니다 체인 복잡 한에 어 ATP synthase, 각각. Nigericin 전극으로 측정 될 수 있다 K + 그라데이션 막 횡단 H + 그라데이션 변환에 추가 됩니다.
  7. 미토 콘 드리 아 외피를 10 m m TPMP + 솔루션의 5 µ L을 추가 하 여 TPMP +에 대 한 표준 곡선을 준비 합니다. TPMP + 2.5 μ M의 총 농도 추가 될 때까지이 단계 4 번 더 반복 합니다.
  8. 실로 1m 호박의 5 μ를 추가 하 여 호흡을 시작 합니다.
  9. 안정 된 추적을 달성 때까지 호흡을 기록 하 고 malonate를 추가 하 여 시스템을 적정 하십시오. Malonate의 추가 0.5 µ L, 1 µ L, 1.5 µ L, 3.0 µ L, 6.0 µ L, 9.0 µ L, 0.1 m m의 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8, 보육 실에서 malonate 농도의 연속 추가 달성 하기 위해 Malonate 솔루션 및 2.5 m m의 다음 12.5 µ L 이어야 한다.
  10. 두 개의 전극 (산소와 TPMP+)에서 데이터를 수집 합니다. 미토 콘 드 리아 산소 소비와 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 동시 측정을 수집 하 여 실시간으로 산소 소비에 변화 관찰 oxygraph 시스템에서 데이터 수집 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 그림 14 oxygraph 시스템 실험 진행으로 산소 소비를 기록 하는 방법을 보여 줍니다.
  11. Nernst 방정식에 따라 mV에 MMP를 계산:
    MMP 61.5 로그 = ([TPMP +] 추가-외부 [TPMP +]) x TPMP+ 바인딩 수정 / (단백질/ml 0.001 x mg x [TPMP +])
    미토 콘 드리 아 단백질-1 의 0.4 µ L/mg의 TPMP + 바인딩 수정 사용 됩니다.
    예제 계산 프로토콜에 농도에 따라:
    MMP = 0.4 x 61.5 x 로그 (5 µ M-2 µ M) / (0.001 x 0.35 mg 미토 콘 드리 아 단백질/mL x 2 µ M)
    MMP 198.9 = mV
  12. 견적 PMF MMP 대 산소 소비 (그림 15)의 그래프를 그려서. PMF 165의 막 잠재력에 산소 소비량으로 보고 mV.
    참고: Titrating malonate (0.1 ~ 2.5 m m)와 전자 전송 체인 MMP를 양성자 누출의 운동 응답을 보여 줍니다. 다음, 산소 소비에 대 한 MMP를 플로팅 양성자 누출 속도를 결정 합니다. PMF 일반적인 막 잠재력에 산소 소비를 계산 하 여 결정 (165 mV).
  13. 샘플의 마지막 실행의 끝에, 최대한 호흡을 유도 및 릴리스 TPMP + 기준 정정 FCCP (0.2 μ M 총 볼륨)을 추가 합니다.
  14. 호흡 약 실에서 솔루션의 모든 발음. 더블 이온된 물으로 여러 번 챔버 린스. 하루의 끝에, 챔버 한다 또한 수 씻어 서 몇 번 에탄올과.

결과

RCR와 양성자 누출 속도 보여주는 긍정적인 결과 각각 표 1 과 그림 15에 표시 됩니다. 이 연구7, RCR 및 단백질 누출에서 속도 론 측정 되었다 홀스타인 젖소에서 우유에 70 일 후 소는 28 일에 대 한 Cu, Zn와 Mn의 5 가지 레벨의 1을 공급 했다. 주 4, 최대 양성자 누출 종속 호흡, Cu, Mn, Zn (p < 0.1)의 미네랄 섭취에 의해 영?...

토론

프로토콜에서 가장 중요 한 포인트는 대표 간 조직 샘플을 얻기 이며 생 후 즉시 미토 콘 드리 아의 격리를 시작. 호흡 측정에 변이 실험실으로 암소에서 짧은 전송 시간으로 인해 낮은 (표 1). 전송 시간을 줄이기 위해, 작은 실험실 세워졌다는 유제품의 사무실에서 그리고 각 미토 콘 드리 아 생의 10 분 안에 고립 됐다 있도록 수집으로 간 샘플 사무실 실험실에 기반 했다. 설치 및 사?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 연구 센터를 통해 Alltech 및 USDA 해치 자금 음식 동물 건강에 UC 데이비스 수의 학부의 지원 한다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrumentSontec Instruments Englewood CO1103-904
SutureFisher Scientific19-037-516
Suture needlesNANAIncluded with Suture
ScalpelsSigma - AldrichS2896 / S2646# for handle and blades
Surgery towelsFisher Scientific50-129-6667
Falcon tubes 50 mLFisher Scientific14-432-22
TweezersSigma - AldrichZ168750
50 mL syringesFisher Scientific22-314387
Injection needles (22, 2 1/2)VWRMJ8881-200342
Cow halterTractor Supply Co.101966599
Cotton swabbingFisher Scientific14-959-102
cotton gauze squares (4x4)Fisher Scientific22-246069
Medical scissorsSigma - AldrichZ265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cowProvided by Veterinarian
Clostridia VaccineProvided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 daysProvided by Veterinarian
Providone ScrubAspen Veteterinary Resources21260221
Ethanol 70%Sigma - Aldrich793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweightProvided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL)Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumineProvided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearanceFisher Scientific02-911-527
Homogenizer MotorCole ParmerEW-04369-10
Homogenizer ProbeCole ParmerEW-04468-22
Auto Pipette (10 mL)Cole ParmerSK-21600-74
Beaker (500 mL) with iceFisher ScientificFB100600
Refrigerated microfugeFisher Scientific75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL)Fisher ScientificAM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)abcamab102536
SucroseSigma - AldrichS7903-1KG
Tris-HClSigma - AldrichT1503-1KG
EDTASigma - AldrichEDS-1KG
BSA (fatty acid free)Sigma - AldrichA7030-50G
MannitolSigma - AldrichM4125-1KG
Deionized waterSigma - Aldrich38796
HepesSigma - AldrichH3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrodeHansatech (PP Systems)OXY1
Thermoregulated Water PumpADInstrumentsMLE2001
Clark type Oxygen electrodeNANA
Autopipette (1 mL)Cole ParmerSK-21600-70Included with Oxy1
Small magnetic stir barFisher Scientific14-513-95
Micropipette (10 μL)Cole ParmerSK-21600-60
pH meterVWR
Chemicals
KClSigma - AldrichP9333-1KG
HepesSigma - AldrichH3375-500G
KH2PO4Sigma - AldrichP5655-1KG
MgCl2Sigma - AldrichM1028-100ML
EGTASigma - AldrichE3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution)Sigma - AldrichR8875-5G
Succinate (1 M solution)Sigma - AldrichS3674-250G
ADP (100 mM solution)Sigma - AldrichA5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol)Sigma - Aldrich75351
FCCPSigma - AldrichC2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrodeWorld Precision Instruments.DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution)Sigma - AldrichM1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezerSigma - Aldrich75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezerSigma - AldrichN7143
FCCPSigma - AldrichC3920
TPMPSigma - AldrichT200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA

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