Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Özet

Burada, mitokondrial oksijen tüketimi, beslenme enerji bilimi ve proton sızıntı, verimsizlik birincil nedeni mitokondriyal ATP nesil belirleyici bir kavram ölçme yöntemleri paylaşmak. Bu sonuçlar besin kullanımı mitokondriyal işlev değerlendirmek yardımcı olmak için kayıp enerjinin % 30 için hesap.

Özet

Oksijen tüketimi, proton sebep kuvvet (PMF) ve proton sızıntı mitokondriyal solunum veya ne kadar iyi mitokondri NADH ve FADH ATP dönüştürmek mümkün ölçülerini vardır. Nasıl verimli oksijen kullanımı ve doğrudan ATP üretmek mitokondri de oksijen ve karbon dioksit ve su besin oksidasyon birincil site olduğundan, besin metabolizma, verimliliği ile ilgilidir hayvanın besin gereksinimleri ve hayvan sağlık. Bu yöntemin amacı farklı ilaçlar, diyetler ve mitokondriyal metabolizma üzerindeki çevresel etkileri etkilerini incelemek için kullanılan mitokondrial solunum incelemektir. Sonuçları proton bağlı solunum (durum 3) ve proton sızıntı bağımlı solunum (devlet 4) ölçülen oksijen tüketimi içerir. Devlet 3 / devlet 4 Solunum oranı solunum denetim oranı (RCR) tanımlanır ve mitokondrial enerjik verimliliği temsil edebilir. Mitokondrial proton sızıntı ADP ATP sentezi verimliliğini azalan dan uncoupling Oksidatif fosforilasyon tarafından mitokondri zar potansiyel (MMP) dağılımı sağlar bir süreç var. Oksijen ve TRMP + Hassas elektrotlar mitokondrial yüzeylerde ve elektron taşıma zinciri inhibitörleri ile durum 3 ve devlet 4 solunum, mitokondri zar PMF (veya ATP üretmek için potansiyel) ölçmek için kullanılır ve proton sızıntısı. Bu yöntem için kısıtlamaları karaciğer dokusu gibi taze olmalı ve tüm biyopsi ve deneyleri az 10 h içinde gerçekleştirilmesi gerekir vardır. Bu toplanan ve bir günde yaklaşık 5 için tek bir kişi tarafından işlenen örneklerin sayısını sınırlar. Ancak, yalnızca 1 g karaciğer doku, bu yüzden örnek gerekli miktarda süt sığır gibi büyük hayvanlarda karaciğer boyutuna göre küçük ve küçük kurtarma zaman gerekli gereklidir.

Giriş

Mitokondri stres çok duyarlıdır ve hücresel çevreleri çok çeşitli metabolik hastalıklar katkıda bulunabilir. Oksijen tüketimi ve mitokondri proton sızıntısı mitokondri sağlık göstergeleri vardır. Bu kağıt tahmin mitokondrial enerji verimliliğinde oksijen tüketimi ve proton sızıntısı olmayan temel RCR kullanarak açıklanan yöntemleri. Bu sonuçlar besin kullanımı¹' kayıp enerjinin % 30 için hesap. Oksijen tüketimi ve proton sızıntı değişiklikleri için metabolik hastalık katkıda bulunur ve azalan enerji verimliliği sonuçları mitokondrial disfonksiyon tanımlayabilirsiniz. Bu yöntemler aynı zamanda mitokondrial solunum üzerinde farklı tedaviler etkisini incelemek için kullanılabilir. Mitokondrial oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik ölçme genel mitokondriyal işlev ve enerjik etkinliğini değerlendirmek için hedeftir.

Hepatik mitokondrial disfonksiyon süt sığır çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Hücresel metabolizma erken emzirme bir enerji açığı ile karşı karşıya zaman karbonhidrat ve lipid yakıtlar arasında geçiş yapma yeteneği sayısı ve mitokondri²hücre işlevi etkilenir. Mitokondri enerji ve artan β-oksidasyon için artan bir talep uyum yeteneği kusurları insülin direnci ile ilişkili hücre içi lipid birikimi yol açabilir ve erken emzirme süt ineklerin yağlı karaciğer oluşumuna yol açabilir. Mitokondri, keton vücut üretim ve kullanımı, site olarak ketozis süt inekleri³önemli bir rol oynayabilir. Mitokondri veya mitokondrial disfonksiyon eksikliği yakıt durumu çevre etkileyecek ve oksijen tüketimi veya RCR değişiklikleri yansıması.

Mitokondrial oksijen tüketimi değişiklikleri yanıt olarak inflamasyon. Yedi günlük eski yumurtlayanlar rastgele Eimeria maxima ve kontrol grubu⁴ile enfekte bir gruba ayrıldı. Coccidiosis meydan geçmesi değil yumurtlayanlar proton sızıntı ve daha yüksek RCR karaciğer mitokondri artan proton sızıntısı tarafından bir bağışıklık sınamasına yanıt belirten nedeniyle daha az oksijen tüketimi vardı. Proton sızıntı ve reaktif oksijen türleri üretim bir kez mitokondri zar disfonksiyon belirtisi olarak kabul edildi ve enerjik verimliliği için zararlı, şimdi bu protein ve kalsiyum içe mitokondri⁵ aktarmak için önemlidir Bilindiği ve ısı¹nesil için.

Solunum zinciri elektron sızıntı mitokondri reaktif oksijen türleri üretim ve oksidatif hasar mitokondri zar proteinleri, lipidler ve mitokondriyal DNA getirir; Mitokondri yaşlandıkça, hasar için özellikle daha fazla mitokondriyal metabolizma⁶ ve daha fazla duyarlılık inek hastalığı disfonksiyon neden mtDNA birikir. Pratikte, çok hayvancılık hayvan takviyeleri Cu, Zn ve Mn antioksidan işlevi artırmak için gibi yüksek düzeyde beslenir. Ancak, Cu yüksek düzeyde besleme, Zn ve Mn süt üretimi azalmıştır ve oksijen tüketimi proton sızıntısı (devlet 4 solunum)⁷nedeniyle arttı.

Sığır enerji verimliliği mitokondriyal işlevde rolünü önceki araştırma mitokondrial oksijen tüketimi ve proton sızıntı değişiklikler üzerinde odaklanan. Çok az sayıda çalışmalar süt sığır yayınlanmış ve üretim verimliliği sığır mitokondriyal işlev artık yem alımı (RFI) şeklinde en kartları karşılaştırın. Mitokondrial solunum oranları emzikli Holstein inek ve emzikli sığır ciğeri state 3, devlet 4 ve RCR ölçerek incelenmiş değişkenliği (Angus, Brangus ve Hereford)⁸inekler. Araştırmacılar herhangi bir korelasyon büyüme veya özellikleri sığır için sağım mitokondrial solunum bulamadık ama mitokondrial solunum ve özellikleri Holsteins için sağım arasında bir ilişki rapor vermedi. İki çalışmalarda, RFI sığır mitokondrial solunum oranları (state 3, devlet 4 ve RCR) kas mitokondri^9,10' karşılaştırıldı. DMI cevaben mitokondrial solunum oranları değişti ve düşük oranları daha az verimli sığır eti steers ile ilişkili bulunmuştur. Başka bir çalışmada, yüksek veya düşük RFI bulls gelen ederek RFI mitokondrial solunum oranları ve proton sızıntı kinetik Döl¹¹iki grubu ile karşılaştırıldığında. Kazanç kazanç sonuç içinde sığır mitokondrial solunum etkisi yapar teyit nedeniyle farklılıklar vardı.

Bu kağıt, RCR 3 antioksidan mineral laktasyondaki süt sığır besleme yanıt ölçmek için yöntemleri kullanılışını karaciğer inceleyerek bir deney sırasında oksijen tüketimi 4 devlet ve devlet 3 solunum ve PMF.

Protokol

Tüm yöntemleri, protokolü ve burada açıklanan çalışmaları Davis kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kaliforniya Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. alma karaciğer biyopsisi bir Holstein süt ineği

Not: Karaciğer biyopsisi lisanslı bir veteriner tarafından gerçekleştirilmelidir. Karaciğer biyopsi inekler konumlandırıldığı sitenin süt gerçekleştirilebilir. Laktasyondaki süt inekleri normalde Sağılan devam edebilir ve süt gıda tedariki önce veya sonra yordamın geri olması gerekmez. Bu en az 4 kişi karaciğer biyopsisi süt ineği üzerinde gerçekleştirmek için gereken önerilir: biyopsi, ineğin beyinsizler biyopsi alan ve hayvan hastalıklarıyla ilgili, laborant palaşma kaleme dışındaki korumak için durmak için bir hayvan işleyicisi gerçekleştirmek için a hayvan hastalıklarıyla ilgili er, malzemeleri ve biyopsi örnek için ve veteriner ve bir araç (Şekil 1) ve karaciğer örnek almak ve mitokondrial yalıtım başlamak için bir teknisyen arkasında olabilir temiz alan korumak.

1. Karaciğer biyopsisi önce bir ay vermek clostridia aşı inekler. Isıyla cerrahi havlu, biyopsi enstrümanı, neşter sahipleri ve cerrahî donanımlar tarafından cerrahi paketleri oluşturun.
2. Bir gün önce karaciğer biyopsisi, inek subkutan boynundan Ceftiofur hidroklorid 0,044 mL/kg vücut ağırlığı ile enjekte. Monitör inek sıcaklık, alımı ve dışkı puanları normal fonksiyonu için taban çizgisi olarak kullanın.
3. Mitokondri yalıtım medya (MIM) containining 220 mM mannitol, 70 mM sükroz, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA ve %0,1 (w/v) yağ asidi ücretsiz BSA, pH 7.4 4 ° C'de oluşturmak Örnek başına yaklaşık 30 mL-ecek var gerek.
4. İnek (Şekil 2) bir dersin bir yular ile gerektiği gibi fiziksel olarak kullanan dizginlemek. Yular kullanarak, kafasını ağından sol tarafına bağla. Gerekirse, kimyasal bir kısıtlama (Xylazine hidroklorür 100 mg/mL IV 0.010-0,015 adlı mg/kg vücut ağırlığı) kullanılabilir.
5. Biyopsi alanının sağ 10 - 11. interkostal alan (Şekil 3) bulunur. Düz bir çizgi doğru yumru bacak sağ omuz noktasına çizmek. Bu hat ile 10-11. interkostal alan kesiştiği biyopsi sitedir. 10 cm kare alan (Şekil 4) traş tarafından biyopsi olmak inek bölgeyi sterilize. Alan dairesel bir hareket kullanarak % 10 providone bodur (Şekil 5) ile yıkayın. Alan sprey % 70 etanol çözüm (Şekil 6). Tekrar providone ve etanol yıkar.
   Not: Holstein süt sığır et sığırı kıyasla biraz daha farklı bir konumda ciğer var.
6. %2 lidokain HCl (10-15 mL) yerel olarak deri ve temel kas ve bağ dokusu (Şekil 7) anestezi sağlamak için bölgeye enjekte et. Tekrar providone ve % 70 etanol yıkar.
   Not: Sinir uçlarının deride vardır ve kaslı değil iç organlar, yalnızca bir yerel anesthestic ama gereklidir. En az, inek sadece biraz baskı ve acısız biyopsi işlemi sırasında hissetmeniz gerekir.
7. 1-2 cm bıçak-kesi 10-11. interkostal alan (Şekil 8) deri yoluyla olun. Schackelford-Courtney sığır karaciğer biyopsisi enstrüman deri yoluyla geçmek ve diyafram ve karaciğer (Şekil 9, Şekil 10) içine devam ederken hafif bir kranial yönde biyopsi enstrümanı doğrudan. 1 g örnek karaciğer ve enstrüman (Şekil 11) kaldırın. Deri dikiş yerleşim (Şekil 12) ile kapatın.
8. Karaciğer örnek örnek, buz hemen mitokondri yalıtım için karşılamak için yeterli MIM bir konik boru yerleştirin
9. Onay kesi için herhangi bir kızarıklık, şişlik, ısı, veya biyopsi 24 saat içinde ağrı ve inek günde bir sonraki 3 gün (Şekil 13) için subkutan boynundan Ceftiofur hidroklorid 0,044 mL/kg vücut ağırlığı ile enjekte. İneğin sıcaklık, alımı ve dışkı puanları günlük 1 hafta sonra karaciğer biyopsisi için izleyin. Ateşi geliştirirse, antibiyotik veteriner takdirine devam edin.
   Not: bir inek karaciğer biyopsisi sonra 1s içinde dokunmak kesi site, recumbancy, kızarıklık, ısı veya reaksiyon tekme gibi ağrı, belirtileri varsa 1 mg/kg vücut ağırlığı IV enjeksiyonu sonucu flunixin meglumin ağrı ve iltihaplanma hafifletmek için kullanılabilir. İkinci bir enjeksiyon gerekirse yönetilebilir.
10. Dikişler 7 gün sonra biyopsi kaldırın.

2. süt ineği karaciğer üzerinden mitokondri yalıtma

1. En kısa zamanda karaciğer örnek inek kaldırıldıktan sonra karaciğer örnek kırmızı kan hücreleri kaldırmak ve ince örnek makasla kıyma MIM (adım 1.3) yıkayın. Karaciğer doku nemli tutmak için yeterli yalıtım ortamı içeren bir soğutulmuş ölçek kıyılmış.
2. Kıyılmış karaciğer buzun içinde inkübe ve MIM (1:4 w/v) içeren 0,16 mm izni bir teflon havaneli ile 30 mL Cam şişe yerleştirin.
3. 500 rpm'de teflon havaneli ile 4 vuruş/dk dk için karaciğer örnek lunaparkçı.
   Not: Karaciğer homogenate bir buz dolu ölçek MIM içinde tüm işlemi sırasında tutulur ve tüm aşağıdaki Santrifüjü adımları 4 ° C'de tamamlanır
4. Homogenate vasıl 500 x g 10 dk santrifüj kapasitesi, Pelet atmak, soğutulmuş santrifüj tüpü süpernatant aktarmak ve ardından elde edilen süpernatant 10.000 x g mitokondrial Pelet elde etmek 10 dk de santrifüj kapasitesi.
5. Resuspend ve Pelet MIM yağ asidi ücretsiz BSA ile 10 mL yıkayın ve 8100 x g 10 dk. atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi.
6. Resuspend ve Pelet MIM yağ asidi ücretsiz BSA olmadan 10 mL yıkayın ve 8100 x g 10 dk. atma süpernatant için de santrifüj kapasitesi.
7. Pelet yalıtım medya 200 µL içinde askıya alma ve oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik deneyleri için kullanılan kadar buz üzerine yerleştirin.
8. Bicinchoninic asit (BCA) seti üreticisinin Protokolü başına BSA ile standart olarak kullanarak protein konsantrasyonu Pelet süspansiyon (1/100 seyreltme) belirlemek. Tüm protein mitokondrial protein olarak kabul edilir.

3. ölçme mitokondrial oksijen tüketimi (devlet 4 3 ve devlet)

1. Oksijen tüketimi medya (OCM) 120 mM KCl, 5 mM KH₂PO₄, 5 mM MgCl₂oluşturmak, 5 mM Hepes ve 1 mM EGTA, pH %7,4 0,3 ile 30 ° C'de BSA kakaoyu. Yaklaşık 3 mL örnek başına gerekli olacaktır. Ayrıca 8 μg/mL oligomycin etanol çözeltisi hazırlamak.
2. 30 ° C'de OCM kuluçkaya Solunum odası, pompa ve oksijen elektrot üretici talimatları (oxygraph sistemi) göre ayarlayın. Oxygraph yazılım zaten bilgisayarda yüklü.
3. 1 mL OCM solunum odanın içine koyun ve karistirin. Bu çözüm hava ile doymuş hale gelir temin yardımcı olur.
4. 0.35 mg protein mitokondrial proteinin solunum odasına ekleyin ve sıcaklık 30 ° C'de muhafaza
5. Oksijen tüketimi yaklaşık 5 min için kaydedin. Oxygraph sistem kayıtları oksijen konsantrasyonu çok solunum arttıkça oksijen konsantrasyonu azalır. Ne zaman oksijen tüketimi olur sabiti (azalan düz bir çizgi), kayıt oksijen tüketimi (çizgisinin eğimini yoğunlukta oksijen/saat =). Bu temel oksijen tüketimi var.
6. Karmaşık etkisizleştirmek için 4 mM Rotenon çözümün 1,25 µL ekleyin ben ve 5 mM süksinat solunum odasında son bir konsantrasyon ulaşmak için 1 M süksinat çözümün 5 µL ekleyin. Bu durum 4 solunum var.
7. 100 μm kalınlığında solunum odasında son bir konsantrasyon ulaşmak için 100 mM ADP çözeltinin 1 µL ekleyin. Oksijen konsantrasyonu (artan solunum) azalacak ve sonra yaklaşık 5 dk düz bir çizgi haline geldikten sonra. Kayıt oksijen tüketimi (çizgisinin eğimini yoğunlukta oksijen/saat =). Bu durum 3 solunum var.
8. İsteğe bağlı: Çalıştır sonunda maksimal solunum ikna etmek için FCCP (0,2 mikron toplam hacim) ekleyin. Solunum için yaklaşık 5 dk (yaklaşık) kaydedin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur. Maksimal oksijen tüketimi bu.
9. Solunum Denetim oranı (RCR) durum 3 oksijen tüketimi denklemi kullanarak hesaplamak / 4 oksijen tüketimi eyalet.
10. Tüm solunum odası dışında çözümler Aspire edin. Odası Çift Kişilik deiyonize su ile birkaç defa durulayın.

4. ölçme mitokondrial membran potansiyeli (MMP) ve Proton sebep kuvvet (PMF)

1. 80 ng/mL nigericin etanol çözeltisi hazırlamak.
   Not: Bu kimyasalların etanol içinde çözülür ve etanol etanol elektron taşıma sistemi Böl ve mitchondrial disfonksiyon neden bu yana, 1 μL için eklenir miktarını sınırlamak için her türlü çabayı yapılmalıdır.
2. İyice odası Çift Kişilik deiyonize su ile durulama sonra OCM 1 mL solunum odanın içine yerleştirin ve bir manyetik heyecan bar ile karistirin. Bu çözüm hava ile doymuş hale gelir temin yardımcı olur. Kurulum odası için metil-triphenyl-phosphonium (TPMP +) hassas elektrot ekleyin. TPMP + elektrot bir pH metre bağlantısının kurulması ve değerleri pH metre ile okunur.
3. Mitokondrial protein 0.35 mg solunum odasına ekleyin.
4. Karmaşık ı. kayıt solunum için 2-5 dk (yaklaşık) etkisizleştirmek için 4 mM Rotenon çözümün 1,25 µL ekleyin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur.
5. 0,56 μL 2.8 µg oligomycin /0.35 mg mitokondrial protein ADP kullanımı engellemek için son bir konsantrasyon için 8 μg/mL oligomycin çözümü ekleyin. Solunum için 2-5 dk (yaklaşık) kaydedin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur.
6. 0,112 μL 80 ng/mL nigericin çözüm pH degrade mitokondriyal iç membran kaldırılması için ekleyin. Solunum için 2-5 dk (yaklaşık) kaydedin. Ne zaman oksijen tüketimi sabit, kayıt oksijen tüketimi olur.
   Not: Elektron taşıma engellemek için kullanılır Rotenon ve oligomycin zincir kompleksi ben ve ATP sentaz, anılan sıraya göre. Nigericin bir elektrot ile ölçülebilir bir K + degrade transmembran S + degradeyi dönüştürmek için eklenir.
7. Standart bir eğri hazırlamak için TPMP + 10 mM TPMP + çözüm 5 µL mitokondrial kuluçka ekleyerek. 2,5 μM TPMP + toplam konsantrasyon eklendi bu kadar dört kez daha tekrarlayın.
8. Solunum 1 M süksinat 5 μL odasına ekleyerek başlatın.
9. İstikrarlı bir izleme elde ettik kadar solunum kaydı ve sonra sistem malonat ekleyerek titre. Malonat eklemeler 0.5 µL, 1 µL, 1,5 µL, 3.0 µL, 6.0 µL, 9.0 µL, sonra 12.5 µL 0,1 mM malonat konsantrasyonları kuluçka odasında 0,1 0,2 0,3, 0.6, 1.2, 1.8 art arda gelen eklemeler elde etmek için malonat çözüm ve 2.5 mM olmalıdır.
10. İki elektrot (oksijen ve TPMP⁺) üzerinden veri toplama. Veri toplama yazılımı oxygraph sisteminden mitokondrial oksijen tüketimi ve mitokondri zar potansiyel simultane ölçümleri toplamak ve değişiklikleri gerçek zamanlı olarak oksijen tüketiminde gözlemlemek için kullanılabilir. Şekil 14 oxygraph sistemi deneme ilerledikçe oksijen tüketimi kayıtları nasıl gösterir.
11. MMP üzerinde Nernst denklemi dayalı mV Hesapla:
    MMP 61,5 günlük = (dış [TPMP +] [TPMP +] eklendi-) x TPMP+ bağlama düzeltme / (0,001 x mg protein/ml x [TPMP +])
    Bir TPMP + bağlama düzeltme 0.4 µL/mg mitokondrial protein^-1 kullanılır.
    Örnek hesaplama protokolü konsantrasyonlarda göre:
    MMP = 0,4 x 61,5 x oturum (5 mikron-2 µM) / (0,001 x 0.35 mg mitokondrial protein/mL x 2 µM)
    MMP 198.9 = mV
12. Oksijen tüketimi vs MMP (Şekil 15) bir grafik olarak çizme tarafından tahmin PMF. PMF 165 membran potansiyeli, oksijen tüketimi bildirilen mV.
    Not: malonat (0,1-2.5 mM) ile elektron taşıma zinciri Titrating proton sızıntı kinetik yanıt MMP için gösterir. O zaman, MMP oksijen tüketimi karşı komplo proton sızıntı kinetik belirler. PMF ortak membran potansiyeli, oksijen tüketimini hesaplama tarafından belirlenir (165 mV).
13. Örnek son çalışması sonunda maksimal solunum teşvik ve TPMP + temel düzeltme için serbest bırakmak için FCCP (0,2 mikron toplam hacim) ekleyin.
14. Tüm solunum odası dışında çözümler Aspire edin. Odası Çift Kişilik deiyonize su ile birkaç defa durulayın. Günün sonunda, odası da birkaç kez etanol ile durulanır.

Sonuçlar

RCR ve proton sızıntı kinetik gösteren olumlu sonuçları Tablo 1 ve Şekil 15, sırasıyla gösterilir. Bu çalışmada⁷, RCR ve protein sızıntısı kinetik ölçülen Holstein Süt ineklerin süt 70 gün, inekler 28 gün boyunca 1, Cu, Zn ve Mn 5 farklı seviyelerde beslenen sonra. Devlet 4, en fazla proton sızıntı bağlı solunum, Cu, Mn ve Zn (p < 0,1) mineral alımını tarafından etkilenmiş gi...

Tartışmalar

En kritik nokta protokolündeki temsilcisi karaciğer doku örneği alma ve mitokondri yalıtım en kısa zamanda biyopsi sonra başlangıcı. Solunum ölçüleri içinde çeşididir inek laboratuvar bir kısa ulaşım zaman nedeniyle düşük (Tablo 1). Taşıma süresini azaltmak için küçük bir laboratuvar süt ofiste kurulmuştur ve mitokondri biyopsi 10 dk içinde izole böylece her toplanan gibi karaciğer örnekleri için office laboratuvar sürüldüler. Kurulum ve proton degradeler kayıt far...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument	Sontec Instruments Englewood CO	1103-904
Suture	Fisher Scientific	19-037-516
Suture needles	NA	NA	Included with Suture
Scalpels	Sigma - Aldrich	S2896 / S2646	# for handle and blades
Surgery towels	Fisher Scientific	50-129-6667
Falcon tubes 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Tweezers	Sigma - Aldrich	Z168750
50 mL syringes	Fisher Scientific	22-314387
Injection needles (22, 2 1/2)	VWR	MJ8881-200342
Cow halter	Tractor Supply Co.	101966599
Cotton swabbing	Fisher Scientific	14-959-102
cotton gauze squares (4x4)	Fisher Scientific	22-246069
Medical scissors	Sigma - Aldrich	Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow			Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine			Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days			Provided by Veterinarian
Providone Scrub	Aspen Veteterinary Resources	21260221
Ethanol 70%	Sigma - Aldrich	793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight			Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL)			Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine			Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance	Fisher Scientific	02-911-527
Homogenizer Motor	Cole Parmer	EW-04369-10
Homogenizer Probe	Cole Parmer	EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL)	Cole Parmer	SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice	Fisher Scientific	FB100600
Refrigerated microfuge	Fisher Scientific	75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)	abcam	ab102536
Sucrose	Sigma - Aldrich	S7903-1KG
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma - Aldrich	EDS-1KG
BSA (fatty acid free)	Sigma - Aldrich	A7030-50G
Mannitol	Sigma - Aldrich	M4125-1KG
Deionized water	Sigma - Aldrich	38796
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode	Hansatech (PP Systems)	OXY1
Thermoregulated Water Pump	ADInstruments	MLE2001
Clark type Oxygen electrode	NA	NA
Autopipette (1 mL)	Cole Parmer	SK-21600-70	Included with Oxy1
Small magnetic stir bar	Fisher Scientific	14-513-95
Micropipette (10 μL)	Cole Parmer	SK-21600-60
pH meter	VWR
Chemicals
KCl	Sigma - Aldrich	P9333-1KG
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
KH2PO4	Sigma - Aldrich	P5655-1KG
MgCl2	Sigma - Aldrich	M1028-100ML
EGTA	Sigma - Aldrich	E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution)	Sigma - Aldrich	R8875-5G
Succinate (1 M solution)	Sigma - Aldrich	S3674-250G
ADP (100 mM solution)	Sigma - Aldrich	A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol)	Sigma - Aldrich	75351
FCCP	Sigma - Aldrich	C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode	World Precision Instruments.	DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution)	Sigma - Aldrich	M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma - Aldrich	75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma - Aldrich	N7143
FCCP	Sigma - Aldrich	C3920
TPMP	Sigma - Aldrich	T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA