Mesure d’oxygéne mitochondries du foie et la cinétique de fuite Proton pour estimer la Respiration mitochondriale chez les vaches laitières Holstein

Résumé

Ici, nous partageons des méthodes pour mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale, un concept définissant d’Energétique nutritionnelle et fuite de protons, la principale cause d’inefficacité dans la production mitochondriale de l’ATP. Ces résultats peuvent représentent 30 % de l’énergie perdue dans l’utilisation des nutriments pour aider à évaluer la fonction mitochondriale.

Résumé

La consommation d’oxygène, motif de proton force (CMR) et fuite de protons sont les mensurations de la respiration mitochondriale, ou comment bien les mitochondries sont en mesure de convertir NADH et FADH en ATP. Étant donné que les mitochondries sont également le principal site pour l’utilisation de l’oxygène et de nutriments oxydation de dioxyde de carbone et l’eau, l’efficacité avec laquelle ils utilisent de l’oxygène et produisent de l’ATP directement a trait à l’efficacité du métabolisme des nutriments, les besoins nutritionnels de l’animal, et santé de l’animal. Le but de cette méthode consiste à examiner la respiration mitochondriale, qui peut être utilisée pour examiner les effets des différents médicaments, régimes alimentaires et effets sur le métabolisme mitochondrial. Les résultats comprennent la consommation d’oxygène mesurée en respiration dépendante de proton (État 3) et la respiration de dépendant de fuite de proton (État 4). Le ratio de la respiration État 4 3 / Etat est défini comme rapport de contrôle respiratoire (RCR) et peut représenter efficacité énergétique mitochondriale. Fuite de protons mitochondriale est un procédé qui permet la dissipation du potentiel de membrane mitochondrial (MMP) par découplage de la phosphorylation oxydative d’ADP, diminution de l’efficacité de la synthèse d’ATP. Oxygène et TRMP + électrodes sensibles avec mitochondriales substrats et inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons sont utilisés pour mesurer l’État 3 et 4 de l’état respiratoire, membrane mitochondriale PMF (ou susceptibles de produire de l’ATP) et fuite de protons. Limitations de cette méthode sont que le tissu hépatique doit être aussi fraîche que possible et toutes les biopsies et les essais doivent être effectuées en moins de 10 h. Cela limite le nombre d’échantillons qui peuvent être collectées et traitées par une seule personne par jour à environ 5. Cependant, seulement 1 g de tissu hépatique est nécessaire, donc dans les grands animaux, tels que les vaches laitières, la quantité d’échantillon nécessaire est faible par rapport à la taille du foie et il y a peu temps de récupération nécessaire.

Introduction

Les mitochondries sont très sensibles au stress et leur environnement cellulaire peut contribuer à une grande variété de maladies métaboliques. Consommation d’oxygène et la fuite de protons dans les mitochondries sont des indicateurs de santé de mitochondries. Les méthodes décrites dans ce document estimation mitochondrial l’efficacité énergétique à l’aide de RCR basent sur la consommation d’oxygène avec et sans fuite de protons. Ces résultats peuvent représentent 30 % de l’énergie perdue dans l’utilisation des éléments nutritifs¹. Changements dans la fuite de proton et de la consommation d’oxygène peuvent identifier un dysfonctionnement mitochondrial qui contribue aux maladies métaboliques et se traduit par une diminution de l’efficacité énergétique. Ces méthodes peuvent également être utilisées pour étudier l’effet des différents traitements sur la respiration mitochondriale. L’objectif général de mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale et la cinétique de fuite de proton est d’évaluer la fonction mitochondriale et efficacité énergétique.

Dysfonctionnement mitochondrial hépatique a été associé à plusieurs maladies chez les vaches laitières. La capacité du métabolisme cellulaire pour basculer entre les carburants glucidiques et lipidiques, face à un déficit énergétique en début de lactation est influencée par le nombre et la fonction des mitochondries dans la cellule². Défauts de la capacité des mitochondries pour s’adapter à une demande accrue d’énergie et de la β-oxydation accrue peuvent entraîner une accumulation de lipides intracellulaires associés à l’insulino-résistance et peuvent conduire à la formation de foie gras chez les vaches laitières de lactation précoce. Mitochondries, comme le site de production de corps cétoniques et utilisation, peuvent jouer un rôle clé dans le ketosis chez les vaches laitières³. Absence de mitochondries ou dysfonctionnement mitochondrial aura une incidence combustibles disponibles vers la périphérie et se reflétée des changements dans la consommation d’oxygène ou RCR.

Changements de consommation d’oxygène mitochondriale en réponse à l’inflammation. Poulets de chair âgés de sept jours ont été assignés au hasard à un groupe infecté par Eimeria maxima et un groupe de contrôle⁴. Poulets de chair qui ne subissent pas de défi de coccidiose avaient faible consommation d’oxygène due à la fuite de protons et RCR supérieur indiquant que les mitochondries du foie répondent à une stimulation immunitaire par fuite de protons croissante. Tout en fuite de protons et réactive production d’espèces oxygénées était autrefois considéré comme un signe de dysfonctionnement de la membrane mitochondriale et préjudiciable à l’efficacité énergétique, maintenant on sait qu’il est important pour l’importation de protéines et de calcium dans les mitochondries⁵ et pour la génération de chaleur¹.

Fuite d’électrons de la chaine respiratoire rend les mitochondries sensibles à la production d’espèces réactives de l’oxygène et les dommages oxydatifs aux protéines de la membrane mitochondriale, lipides et l’ADN mitochondrial. Comme l’âge des mitochondries, des dommages peuvent s’accumuler en particulier d’ADNmt occasionne un autre dysfonctionnement du métabolisme mitochondrial⁶ et une plus grande susceptibilité de la vache à la maladie. Dans la pratique, de nombreux animaux d’élevage est nourris des niveaux élevés de suppléments tels que Cu, Zn et Mn pour stimuler la fonction antioxydante. Toutefois, nourrir des niveaux élevés de Cu, Zn et Mn diminue la production de lait et a augmenté la consommation d’oxygène due à proton fuite (respiration État 4)⁷.

Des recherches antérieures sur le rôle de la fonction mitochondriale dans l’efficacité énergétique chez les bovins a mis l’accent sur les changements dans la consommation d’oxygène mitochondriale et fuite de protons. Très peu d’études ont été publiées chez les vaches laitières et la plupart des papiers comparer l’efficacité de production sous la forme d’ingestion d’aliments résiduelle (DDR) à la fonction mitochondriale chez les bovins de boucherie. Variabilité de la respiration mitochondriale, les taux ont été examinés en mesurant l’État 3, 4 et RCR dans le foie des vaches Holstein en lactation et lactation boeuf vaches (Brangus, Angus et Hereford)⁸. Les chercheurs n’a pas trouvé aucune corrélation dans la respiration mitochondriale avec croissance ou traite des traits pour les bovins, mais n’a signalé une corrélation entre la respiration mitochondriale et traite des traits pour Holsteins. Dans deux études, RFI a été comparée en bovins de boucherie au taux de respiration mitochondriale (État 3, État 4 et RCR) dans le muscle mitochondries^9,10. Les taux de la respiration mitochondriale ont changé en réaction à la DMI et faibles taux étaient associés à bouvillons de boeuf moins efficaces. Dans une autre étude, RFI de boeufs de hautes ou basses bulls RFI ont été comparés avec des taux de la respiration mitochondriale et la cinétique de fuite de protons entre les deux groupes de descendants¹¹. Différences étaient attribuables à gain en confirmant la conclusion que le gain n'est pas impact la respiration mitochondriale en bovins de boucherie.

Dans cet article, une expérience examinant foie RCR en réponse à l’alimentation des bovins laitiers en lactation 3 minéraux antioxydants illustre l’utilisation de méthodes de mesure de consommation d’oxygène pendant 4 d’État et état 3 la respiration et au CMR.

Protocole

Toutes les méthodes, protocole et études décrites ici ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Californie à Davis.

1. obtenir une biopsie du foie d’une vache laitière Holstein

Remarque : Une biopsie hépatique doit être effectuée par un vétérinaire agréé. Biopsies du foie peuvent être effectuées sur le site laitier où se trouvent les vaches. Vaches laitières en lactation peuvent continuer à être traite normalement et le lait ne doit pas être retiré de l’alimentation avant ou après la procédure. Il est recommandé qu’au moins 4 personnes sont nécessaires pour effectuer la biopsie du foie sur une vache laitière : un vétérinaire pour effectuer la biopsie, un dresseur pour s’établir à la hanche de la vache pour protéger la zone de biopsie et le vétérinaire, un technicien de laboratoire à l’extérieur de la plume de transf euh outils, de matériaux et de biopsie vers et depuis le vétérinaire de l’échantillon et maintiennent la zone propre, qui peut être à l’arrière d’un véhicule (Figure 1) et un technicien pour récupérer l’échantillon du foie et commencer l’isolation mitochondriale.

1. Un mois avant les biopsies du foie, donner des vaches une vaccination clostridia. Créer des packs chirurgicaux par serviettes chirurgicales autoclavage, instrument de biopsie, détenteurs de bistouri et matériel chirurgical.
2. Un jour avant la biopsie hépatique, injecter la vache avec le Ceftiofur chlorhydrate 0,044 mL/kg de poids corporel par voie sous-cutanée dans le cou. Surveiller la température de vache, l’ingestion et fécales partitions à utiliser comme point de référence pour la fonction normale.
3. Créer des mitochondries isolement multimédia (MIM) containining 220 mM de mannitol, saccharose de 70 mM, 20 mM HEPES, EDTA 1 mM et 0,1 % (p/v) d’acide gras libre BSA, pH 7,4 à 4 ° C. Il faudra environ 30 mL par exemple.
4. Restreindre physiquement utilisant une prise de tête avec un licol selon les besoins de la vache (Figure 2). À l’aide de la corde, attacher sa tête sur le côté gauche de la colonnette. Si nécessaire, une contention chimique (Xylazine chlorhydrate 100 mg/mL IV à 0,010-0,015 mg/kg de poids corporel) peut être utilisé.
5. La zone de la biopsie se trouve à la droite 10 - 11ème espace intercostal (Figure 3). Dessiner une ligne droite de la droite tuber coxae et aboutissant à la pointe de l’épaule droite. Le site de la biopsie est l’intersection de cette ligne avec l’espace intercostal 10-11. Stériliser le domaine de la vache pour être biopsiées en se rasant une zone carrée de 10 cm (Figure 4). Laver la zone avec 10 % providone scrub (Figure 5) en utilisant un mouvement circulaire. Zone de pulvérisation avec une solution d’éthanol à 70 % (Figure 6). Répétition des lavages providone et éthanol.
   Remarque : Le foie est dans une position légèrement différente chez les vaches laitières de Holstein par rapport aux bovins de boucherie.
6. Injecter localement lidocaïne 2 % HCl (10 à 15 mL) à la zone d’anesthésie de la peau et sous-jacent de muscles et du tissu conjonctif (Figure 7). Répétez les providone et les lavages de l’éthanol 70 %.
   NOTE : Les terminaisons nerveuses sont dans la peau et le muscle, mais pas viscères, ainsi qu’un local anesthestic est nécessaire. Tout au plus, la vache doit seulement se sentir peu de pression et pas de douleur au cours de la procédure de biopsie.
7. Faire une coup de poignard-incision de 1 à 2 cm à travers la peau de l’espace intercostal 10-11 (Figure 8). Passer un instrument de biopsie hépatique bovine Schackelford-Courtney à travers la peau et directe de l’instrument de biopsie dans un sens crânien léger tout en continuant à travers le diaphragme et le foie (Figure 9, Figure 10). Obtenir un échantillon de 1 g du foie et retirer l’instrument (Figure 11). Fermer la peau avec le placement de suture (Figure 12).
8. Mettre l’échantillon du foie dans un tube à fond conique avec assez MIM pour couvrir l’échantillon, sur la glace pour l’isolement immédiat de mitochondries
9. Cocher en cas de toute rougeur, gonflement, chaleur, ou la douleur dans les 24 heures de la biopsie et injecter la vache avec le Ceftiofur chlorhydrate 0,044 mL/kg de poids corporel par voie sous-cutanée dans le cou une fois par jour pour les 3 prochains jours (Figure 13). Surveiller la température de la vache, l’ingestion et scores fécales par jour pendant 1 semaine après une biopsie du foie. Si une fièvre apparaît, continuer les antibiotiques à la discrétion du vétérinaire.
   Remarque : Si une vache est présentant des signes de douleur, tels que les coups de pied dans le site d’incision, recumbancy, rougeur, chaleur ou réaction à toucher moins de 1 h après la biopsie du foie, une injection de IV 1 mg/kg de poids corporel de flunixine méglumine peut servir à soulager la douleur et l’inflammation. Une deuxième injection peut être administrée si nécessaire.
10. Enlever les sutures 7 jours après la biopsie.

2. isoler les mitochondries du foie de la vache laitière

1. Dès que possible après que l’échantillon du foie est prélevé à la vache, laver l’échantillon du foie en MIM (étape 1.3) pour enlever les globules rouges et émincer finement l’échantillon avec des ciseaux. Le foie doit être haché dans un bêcher réfrigéré contenant assez milieux d’isolement pour garder le tissu humide.
2. Placez le foie haché dans un flacon en verre 30 mL avec un pilon de téflon de 0,16 mm dégagement incubés dans la glace et contenant du MIM (1:4 p/v).
3. Homogénéiser l’échantillon du foie au pilon de téflon à 500 tr/min pour un min avec 4 coups/min.
   Remarque : L’homogénat de foie est conservée dans un bécher sous glace en MIM durant tout le processus et toutes les étapes de centrifugation suivantes soient terminées à 4 ° C
4. Centrifuger l’homogénat à 500 x g pendant 10 min, jeter pellet, transférer le surnageant dans un tube à centrifuger réfrigérés et puis centrifuger le surnageant obtenu à 10 000 g pendant 10 min obtenir le culot mitochondrial.
5. Resuspendre et laver le culot dans 10 mL de MIM avec les acides gras libres BSA et centrifuger à 8100 x g pendant 10 min. jetez surnageant.
6. Resuspendre et laver le culot dans 10 mL de MIM sans acide gras libre BSA et centrifuger à 8100 x g pendant 10 min. jetez surnageant.
7. Suspendre le culot dans 200 µL de milieux d’isolement et le placer sur la glace jusqu'à ce qu’utilisé pour la consommation d’oxygène et analyses cinétiques de fuite proton.
8. Déterminer la concentration de la protéine de la suspension de pellet (dilution 1/100) utilise Bicinchoninic acide (BCA) ensemble selon le protocole du fabricant avec BSA comme la norme. Toutes les protéines est considérée comme une protéine mitochondriale.

3. mesurer la consommation d’oxygène mitochondriale (État 4 3 et de l’État)

1. Créer un support de consommation d’oxygène (OCM) de 120 mM KCl, 5 mM KH₂PO₄, 5 mM MgCl₂, 5 mM Hepes et 1 mM EGTA, pH 7,4 à 30 ° C avec 0,3 % dégraissés BSA. Il faudra environ 3 mL par exemple. Aussi préparer une solution de 8 μg/mL oligomycine dans l’éthanol.
2. Incuber les OCM à 30 ° C. Mis en place une électrode chambre, pompe et l’oxygène de la respiration selon les instructions du fabricant (système oxygraph). Le logiciel d’oxygraph devrait déjà être installé sur l’ordinateur.
3. Placer 1 mL de l’OCM dans la chambre de respiration et remuez vigoureusement. Cela aidera à assurer que la solution devient saturée avec de l’air.
4. Ajouter 0,35 mg de protéine des protéines mitochondriales à la chambre de respiration et de maintenir la température à 30 ° C.
5. Enregistrer la consommation d’oxygène pendant environ 5 min. La concentration en oxygène oxygraph système dossiers alors que la respiration augmente, la concentration en oxygène diminue. Lorsque la consommation d’oxygène devient constante (une ligne droite décroissante), consommation d’oxygène record (pente de la droite = concentration d’oxygène/heure). Il s’agit de la consommation d’oxygène de base.
6. Ajouter 1,25 µL de solution de roténone 4 mM pour inhiber complexe je puis ajouter 5 µL de solution de succinate de 1 M pour atteindre une concentration finale dans la chambre respiratoire du succinate de 5 mM. Il s’agit de la respiration État 4.
7. Ajouter 1 µL de solution ADP 100 mM pour atteindre une concentration finale dans la chambre de respiration de 100 μM. Concentration d’oxygène va diminuer (une augmentation de la respiration), puis après environ 5 min devient une ligne droite. Enregistrer la consommation d’oxygène (pente de la droite = concentration d’oxygène/heure). Il s’agit d’État 3 la respiration.
8. En option : À la fin de l’exécution, ajoutez FCCP (volume total de 0,2 μM) pour induire la respiration maximale. Enregistrer la respiration pendant environ 5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne. Il s’agit de la consommation maximale d’oxygène.
9. Calculer le Ratio de contrôle respiratoire (RCR) à l’aide de l’équation de consommation d’oxygène État 3 / 4 la consommation d’oxygène d’État.
10. Aspirer toutes les solutions de la chambre de respiration. Rincer la chambre plusieurs fois avec de l’eau désionisée double.

4. mesurer le potentiel de Membrane Mitochondrial (MMP) et Force motrice de Proton (PMF)

1. Préparer la solution de 80 nigéricine ng/mL dans de l’éthanol.
   Remarque : Ces substances chimiques sont dissous dans l’éthanol, et tout doit être fait pour limiter la quantité d’éthanol qui est ajouté au moins 1 μL, étant donné que l’éthanol peut dételer le système de transport d’électrons et risquez d’être mitchondrial.
2. Après rincer abondamment la chambre avec de l’eau désionisée double, placer 1 mL de l’OCM dans la chambre de respiration et remuer vigoureusement avec une barre magnétique remuer. Cela aidera à assurer que la solution devient saturée avec de l’air. Ajouter méthyl-triphényl-phosphonium (PGEF +) sensible électrode pour le programme d’installation de la chambre. PGEF + électrode doit être raccordé à un pH-mètre et valeurs sont lues à partir du pH-mètre.
3. Ajouter 0,35 mg de protéines mitochondriales à la chambre de respiration.
4. Ajouter 1,25 ml de solution de roténone 4 mM pour inhiber la respiration complexe I. dossier pendant 2-5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne.
5. Ajouter 0.56 μL de 8 μg/mL de solution de l’oligomycine pour une concentration finale de 2,8 µg oligomycine 0,35 mg de protéine mitochondriale pour inhiber l’utilisation de l’ADP. Enregistrer la respiration pendant 2-5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne.
6. Ajouter 0,112 μL 80 ng/mL de solution de nigéricine pour abolir le gradient de pH à travers la membrane mitochondriale interne. Enregistrer la respiration pendant 2-5 min (environ). Quand la consommation d’oxygène devient constante, record d’oxygéne.
   Remarque : La roténone et l’oligomycine servent à bloquer le transport des électrons chain au complexe I et l ' ATP synthase, respectivement. Nigéricine est ajouté pour convertir un gradient de K + qui peut être mesuré avec une électrode de gradient transmembranaire de H +.
7. Préparer une courbe d’étalonnage pour PGEF + en ajoutant 5 µL de solution PGEF + 10 mM à l’incubation mitochondriale. Répétez cette opération quatre fois plus, jusqu'à ce qu’une concentration totale de 2,5 μM PGEF + a été ajoutée.
8. Initier la respiration en ajoutant 5 μL de succinate de 1M à la chambre.
9. Enregistrer la respiration jusqu'à ce que vous avez réalisé une trace stable, et puis titrer le système en ajoutant le malonate. Ajouts de malonate devraient être 0,5 µL, 1 µL, 1,5 µL, 3,0 µL, µL 6.0, 9.0 µL, puis 12,5 µL de 0,1 mM Malonate solution pour réaliser des ajouts successifs des concentrations de malonate dans la chambre d’incubation de 0,1, 0,2, 0,3, 0,6, 1,2, 1,8 et 2,5 mM.
10. Collecter les données des deux électrodes (oxygène et PGEF⁺). Logiciel d’acquisition de données provenant du système d’oxygraph permet de collecter des mesures simultanées de la consommation d’oxygène mitochondriale et le potentiel de membrane mitochondrial et observer les changements dans la consommation d’oxygène en temps réel. La figure 14 montre comment le système d’oxygraph enregistre la consommation d’oxygène en cours de l’expérience.
11. Calculer les MMP dans mV basé sur l’équation de Nernst :
    MMP = 61,5 log ([PGEF +] ajouté – externe [PGEF +]) correction de liaison x TPMP+ / (x 0,001 mg de protéine/mL x [PGEF +])
    Une correction de liaison PGEF + 0,4 µL/mg de protéine mitochondriale^-1 est utilisée.
    Exemple de calcul basé sur les concentrations dans le protocole :
    MMP = 61,5 x log (5 µM – 2 µM) x 0,4 / (0,001 x 0,35 mg protéine mitochondriale/mL x 2 µM)
    MMP = 198,9 mV
12. Estimation PMF en traçant un graphique des MMP contre la consommation d’oxygène (Figure 15). CMR est signalée comme la consommation d’oxygène à un potentiel de membrane de 165 mV.
    NOTE : Titrage de la chaîne de transport d’électrons avec le malonate (0,1 à 2,5 mM) montre la réaction cinétique de fuite de protons de MMP. Alors, complot MMP contre la consommation d’oxygène détermine cinétique de fuite de protons. CMR est déterminée en calculant la consommation d’oxygène à un potentiel de membrane commune (165 mV).
13. À la fin de la dernière exécution de l’exemple, ajouter FCCP (volume total de 0,2 μM) pour induire la respiration maximale et libérer PGEF + pour la correction de la ligne de base.
14. Aspirer toutes les solutions de la chambre de respiration. Rincer la chambre plusieurs fois avec de l’eau désionisée double. À la fin de la journée, la chambre devrait également être rincée plusieurs fois avec de l’éthanol.

Résultats

Résultats positifs cinétique de fuite RCR et proton sont indiquées dans le tableau 1 et Figure 15, respectivement. Dans cette fuite de protéines, RCR et⁷étude cinétique ont été mesurés chez les vaches laitières Holstein à 70 jours dans le lait après les vaches avaient été nourries avec 1 de 5 différents niveaux de Cu, Zn et Mn pendant 28 jours. État 4, respiration de proton maximale de fuite-dépendante...

Discussion

Le point le plus critique dans le protocole est obtenir un échantillon représentatif de tissu hépatique et commence l’isolation des mitochondries dès que possible après la biopsie. Variations dans les mesures de la respiration sont faible (tableau 1) en raison d’un temps de transport court de vache au laboratoire. Afin de réduire les temps de transport, un petit laboratoire a été mis en place dans le Bureau de la laiterie, et échantillons de foie ont été chassés au laboratoire du bureau c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liver Biopsy
Equipment
Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument	Sontec Instruments Englewood CO	1103-904
Suture	Fisher Scientific	19-037-516
Suture needles	NA	NA	Included with Suture
Scalpels	Sigma - Aldrich	S2896 / S2646	# for handle and blades
Surgery towels	Fisher Scientific	50-129-6667
Falcon tubes 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Tweezers	Sigma - Aldrich	Z168750
50 mL syringes	Fisher Scientific	22-314387
Injection needles (22, 2 1/2)	VWR	MJ8881-200342
Cow halter	Tractor Supply Co.	101966599
Cotton swabbing	Fisher Scientific	14-959-102
cotton gauze squares (4x4)	Fisher Scientific	22-246069
Medical scissors	Sigma - Aldrich	Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow			Provided by Veterinarian
Clostridia Vaccine			Provided by Veterinarian
Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days			Provided by Veterinarian
Providone Scrub	Aspen Veteterinary Resources	21260221
Ethanol 70%	Sigma - Aldrich	793213
Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight			Provided by Veterinarian
2% lidocaine HCl (10-15 mL)			Provided by Veterinarian
1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine			Provided by Veterinarian
Isolation of Mitochondria (liver)
Equipment
Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance	Fisher Scientific	02-911-527
Homogenizer Motor	Cole Parmer	EW-04369-10
Homogenizer Probe	Cole Parmer	EW-04468-22
Auto Pipette (10 mL)	Cole Parmer	SK-21600-74
Beaker (500 mL) with ice	Fisher Scientific	FB100600
Refrigerated microfuge	Fisher Scientific	75-002-441EW3
Microfuge tubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	AM12400
Chemicals
Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)	abcam	ab102536
Sucrose	Sigma - Aldrich	S7903-1KG
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma - Aldrich	EDS-1KG
BSA (fatty acid free)	Sigma - Aldrich	A7030-50G
Mannitol	Sigma - Aldrich	M4125-1KG
Deionized water	Sigma - Aldrich	38796
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,  pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator
Mitochondrial Oxygen Comsuption
Equipment
Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode	Hansatech (PP Systems)	OXY1
Thermoregulated Water Pump	ADInstruments	MLE2001
Clark type Oxygen electrode	NA	NA
Autopipette (1 mL)	Cole Parmer	SK-21600-70	Included with Oxy1
Small magnetic stir bar	Fisher Scientific	14-513-95
Micropipette (10 μL)	Cole Parmer	SK-21600-60
pH meter	VWR
Chemicals
KCl	Sigma - Aldrich	P9333-1KG
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
KH2PO4	Sigma - Aldrich	P5655-1KG
MgCl2	Sigma - Aldrich	M1028-100ML
EGTA	Sigma - Aldrich	E3889-100G
Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA
Rotenone (4 mM solution)	Sigma - Aldrich	R8875-5G
Succinate (1 M solution)	Sigma - Aldrich	S3674-250G
ADP (100 mM solution)	Sigma - Aldrich	A5285-1G
Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol)	Sigma - Aldrich	75351
FCCP	Sigma - Aldrich	C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP electrode	World Precision Instruments.	DRIREF-2
Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs
Malonate (0.1 mM solution)	Sigma - Aldrich	M1296
Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma - Aldrich	75351
Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer	Sigma - Aldrich	N7143
FCCP	Sigma - Aldrich	C3920
TPMP	Sigma - Aldrich	T200
TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,  pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA