JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ספקטרוסקופיית פאראמגנטיים תהודה (EPR) היא שיטה ברורה וחד משמעית למדוד בחינם רדיקלים. השימוש של הגששים ספין סלקטיבי מאפשר זיהוי של רדיקלים חופשיים בתאים הסלולר שונה. אנו מציגים שיטה מעשית ויעילה, לאסוף דגימות ביולוגיות המסייעים בטיפול, אחסון של העברת דגימות EPR מעבדתיים.

Abstract

זיהוי מדויק וספציפי של מינים חמצן תגובתי (ROS) בתאים הסלולר ורקמות שונים חיוני למחקר של חמצון-חיזור מוסדר איתות בהגדרות ביולוגי. ספקטרוסקופיית פאראמגנטיים תהודה (EPR) היא השיטה רק ישיר כדי להעריך רדיקלים חופשיים חד משמעית. היתרון שלו הוא שהוא מזהה רמות הפיזיולוגיות של מינים ספציפיים עם ירידה לפרטים גבוה, אבל זה דורש טכנולוגיה מיוחדת, הכנת הדוגמא זהיר, ולהבטיח הפקדים המתאימים לפירוש מדויק של הנתונים. Hydroxylamine מחזורית ספין הגששים להגיב באופן סלקטיבי סופראוקסיד או אחרים רדיקלים ליצירת אות nitroxide זה ניתן לכמת על ידי EPR ספקטרוסקופיה. ספין תא חדיר הגששים וזונדים ספין שנועד לצבור במהירות בתוך המיטוכונדריה לאפשר קביעת ריכוז סופראוקסיד בתאים הסלולר שונה.

תאים בתרבית, השימוש הסלולרי חדיר 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) יחד עם וללא תא אטום סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) רעלני או השימוש תא חדיר פג-SOD, מאפשר הבידול של חוץ-תאי של סופראוקסיד cytosolic. 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido מיטוכונדריאלי] piperidinium dichloride (mito-טמפו-H) מאפשר מדידה של ROS מיטוכונדריאלי (בעיקר סופראוקסיד).

ניתן להחיל ספין הגששים וספקטרוסקופיה EPR גם למודלים ויוו . סופראוקסיד יכול להתגלות חוץ-תאית נוזלים כגון דם ונוזלי מכתשי, כמו גם רקמות כגון רקמת הריאה. מספר שיטות מוצגים לעבד, לאחסן רקמות למדידות EPR ולהעביר תוך ורידי 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) ספין המקדח בתוך vivo. בזמן מדידות יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, המתקבל במבחנה ויוו דגמים יכול גם להיות מאוחסן ב- 80 ° C ודוגמאות נותחו על ידי EPR-77 K... הדגימות יכול להיות מאוחסנת באורווה צינורות מיוחדים ב-80 מעלות צלזיוס ולהפעיל ב K 77 כדי לאפשר מעשית, יעיל, ושיטה לשחזור מקלה על אחסון, העברת דגימות.

Introduction

בעוד אמצעים של סטרס חמצוני, מינים חמצן תגובתי חשובים בחקר מחלות מגוונות בכל מערכות איברים, הגילוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) הוא מאתגר עקב מחצית חיים קצר תגובתיות גבוהה. טכניקת פאראמגנטיים תהודה (EPR) אלקטרון הוא השיטה ברורה וחד משמעית ביותר לגילוי רדיקלים חופשיים. ספין הגששים יש יתרונות על פני הגששים פלורסנט הנפוצות. למרות הגששים פלורסנט הם יחסית זול וקל להשתמש ולספק גילוי מהיר, רגיש של ROS, יש להם מגבלות רציניות בשל אותות מלאכותית, חוסר יכולת לחשב ריכוזים ROS, וחוסר כללי ירידה לפרטים1 .

כדי להקל על השימוש של EPR עבור מחקרים ביולוגיים, מגוון רחב של ספין הגששים היו מסונתז שיכול למדוד מגוון מינים רדיקלים חופשיים ביולוגית רלוונטית וכן פו2, pH וחמצון-חיזור קובע2,3, 4,5,6,7. ספין מלכודות גם פותחו כדי ללכוד רדיקלים קצרת ימים, טופס ארוך-חי adducts, אשר מאפשר זיהוי על ידי EPR8. שני המעמדות (ספין הגששים ומלכודות ספין) יש יתרונות ומגבלות. שיעור נפוץ אחד של הגששים ספין הם hydroxylamines מחזורית, אשר EPR-שקט ו להגיב עם רדיקלים קצרת ימים כדי ליצור nitroxide יציב. Hydroxylamines מחזורית להגיב עם סופראוקסיד 100 פעמים מהר יותר מאשר מלכודות ספין, ומאפשרת להם להתחרות עם נוגדי חמצון הסלולר, אך הם חוסר ירידה לפרטים, דורשים שימוש הפקדים המתאימים, כדי לזהות את המינים רדיקלי או מקור אחראית על האות nitroxide. בעוד ספין מלכודות ירידה לפרטים מוצג עם ברורים ספקטרלי שדפוסי בהתאם המינים לכוד, יש להם קינטיקה איטי סופראוקסיד ספין השמנה, נוטים כילוי של הקיצוני adducts. יישומים עבור ספין השמנה כבר מתועדת היטב המחקר הביו-רפואי9,10,11,12,13.

המטרה של הפרויקט הזה היא להדגים שיטות מעשיות EPR לעיצוב ניסויים, הכנת דוגמאות כדי לזהות סופראוקסיד באמצעות ספין רגשים תאים סלולריים שונים בתוך חוץ גופית , רקמות שונות תאים ויוו. מספר כתבי יד פרסום פרוטוקולים רלוונטיים מטרות אלה, באמצעות ספין יישוב חדיר התא, התא אטום, מיטוכונדריאלי הגששים לרקמות היעד תאים סלולריים שונים במבחנה ואת תהליך לניתוח במודלים של העכבר 14 , 15. אנחנו בונים על הגוף הזה של הספרות על-ידי אימות גישה כדי למדוד סופראוקסיד באמצעות בדיקה ספין (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine תאים סלולריים שונים במבחנה כדי להבטיח מדויק מדידות, סימון בעיות פוטנציאליות טכני אשר עשויים להטות את תוצאות. כמו כן, אנו מספקים שיטות לביצוע מדידות EPR ב דם נוזל שטיפה bronchoalveolar, רקמת הריאה באמצעות המכשיר ספין CMH. מחקרים אלה השוואה בין שיטות שונות כדי לעבד את הרקמות, כמו גם להציג שיטה להזריק עוד ספין הגישוש, CPH, לתוך עכברים לפני קצירת רקמות. לבסוף, אנו מפתחים שיטה מעשית כדי לאחסן דגימות אבובים טפלון (PTFE) כדי לאפשר אחסון והעברת דגימות לפני EPR מדידות-77 K...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו בדנוור אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.

1. הכנת נוגדנים

  1. Diethylenetriaminepentaacetic חומצה (DTPA) מניות (150 מ"מ)
    1. להוסיף 2.95 גר' DTPA (393.35 g/mol) עד 10 מ"ל מים יונים.
    2. כדי להמיס DTPA, להוסיף 1 M NaOH dropwise ולהביא pH של 7.0.
    3. להביא את אמצעי האחסון 50 מ ל מים עבור ריכוז DTPA הסופי של 150 מ מ, ולאחסן ב 4 º C.
  2. פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) (50 מ מ, pH 7.4)
    1. להכין 5 מ' של נתרן כלורי (NaCl) (g 58.44/mol; 29.22 g/100 מ"ל).
    2. להכין 1 מ' של אשלגן פוספט dibasic HK2PO4 (g 174.18/mol; 17.42 g/100 מ"ל)
    3. להכין 1 מ' של אשלגן פוספט monobasic ח'2PO4 (g 136.1/mol; 13.61 g/100 מ"ל). מערבבים 3 מ"ל של 5 M NaCl עם mL 4.24 של 1 מ' אשלגן פוספט dibasic ו- 0.760 מ של 1 מ' אשלגן פוספט monobasic. בדוק את ה-pH.
    4. להביא את אמצעי האחסון 100 מ ל מים יונים.
    5. לאחסן בטמפרטורת החדר (RT) לטווח קצר (ימים) ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך (שבועות).
  3. מאגר קרבס-Henseleit (KHB) המכיל 100 מיקרומטר DTPA
    1. 50 מ ל צינור חרוטי צנטריפוגה, להוסיף µL 33.3 בפתרון מניות DTPA 150 מ מ.
    2. להביא אמצעי אחסון 50 מ עם מאגר קרבס-Henseleit (KHB).
    3. להכין מאגר טריים עם DTPA בכל יום, לשמור את זה RT.
  4. טריס-EDTA מאגר המכיל סוכרוז
    1. להכין מלאי טריס 0.5 M: להמיס 15.14 גר' טריס בסיס (121.14 g/mol) 150 מ ל מים יונים. באמצעות HCl, להתאים את רמת ה-pH ל 7.8 ולהביא נפח סופי של 250 מ.
    2. להמיס נמצא 21.4 גר' סוכרוז (g 342.29/mol; ריכוז סופי = 0.25 mM) ב- 150 מ ל מים יונים.
    3. הוסף 5 מ של מניות טריס סוכרוז להשגת ריכוז טריס הסופי של 10 מ מ.
    4. להוסיף 0.5 מ"ל של 0.5 M EDTA מניות טריס-סוכרוז להשגת ריכוז סופי של 1 מ מ.
    5. בדוק את ה-pH ולהתאים אותו כך 7.4.
    6. להביא נפח סופי של 250 מ ל מים יונים ולאחסן ב 4 º C.
  5. שור כדוריות דם אדומות Cu/Zn סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) מניות (30,000 U/mL)
    1. לשקם U 30,000 של SOD 1 מ"ל ל- PBS (כ 5.7 מ ג, בהתאם לפעילות של SOD הרבה).
    2. מערבבים היטב, aliquot, ולאחסן ב-20 ° C לטווח קצר (6-12 חודשים) וב-80 מעלות לאחסון לטווח ארוך.
  6. הפתרון עובד SOD (1000 U/mL)
    1. להעביר aliquot 30 µL של 30,000 מניות SOD U/mL µL 870 ל- PBS סטרילי.
    2. לשמור את הפתרון על קרח, ולהשתמש בו טריים.
  7. Phorbol 12-פעילים 13-אצטט (PMA) מניות (5 מ מ)
    1. להמיס 1 מ ג של PMA (616.83 g/mol) בשנת 325 µL של דימתיל סולפוקסיד (ריכוז סופי = 5 מ מ).
    2. Aliquot פתרון PMA 5 מ מ ואחסן אותו ב-20 ° C.
  8. הפתרון עובד PMA (125 µM)
    1. לדלל עם aliquot 10 µL מניות PMA 5 מ מ לתוך µL 390 ל- PBS סטרילי.
    2. לשמור את הפתרון על הקרח ולהשתמש בו טריים.
    3. עבור פקד הרכב עבור ובחום, להשתמש µL 10 של דימתיל סולפוקסיד ב 390 µL ל- PBS.
  9. Diphenyliodonium כלוריד (מח ש) (2.5 mM)
    1. להמיס 3.2 מ"ג וטבול (316.57 g/mol) 4 מ"ל. להשיג מלאי 2.5 מ מ.
    2. להכין את הפתרון ולהשתמש בו טריים.
  10. דפרוקסמין מסילייט מלח (DFO) (20 מ מ)
    1. להמיס 4.5 מ"ג של DFO (656.79 g / mol) ב- µL 340 להשיג מלאי 20 מ מ.
    2. להכין את הפתרון ולהשתמש בו טריים.
  11. הכנת antimycin A (AA) מניות (5 מ מ)
    1. להמיס 5.4 מ ג של. אלכוהוליסטים אנונימיים (g 532/mol) ב 2 מ"ל אתנול (ריכוז סופי = 5 מ מ).
    2. Aliquot המניות של צלוחיות זכוכית וחנות ב-20 ° C.
  12. הכנה של הגששים ספין
    1. בועה 50 מ מ פוספט מאגר המכיל 100 מיקרומטר DTPA עם חנקן למשך 30 דקות כדי להסיר חמצן מומס מתוך המאגר.
    2. להסיר את המכשיר ספין מהמקפיא-20 ° C ולאפשר את המיכל לבוא RT (10-15 דקות).
    3. שוקלים לצאת 2.4 מ ג של 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CMH) (237.8 g/mol)
    4. יתמוסס CMH 1 מ"ל המאגר פוספט רווית ריכוז סופי של 10 מ מ.
    5. שוקלים לצאת 5 מ"ג של 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride (mito-טמפו-H) (529.1 g/mol).
    6. יתמוסס mito-טמפו-H 1 מ"ל המאגר פוספט רווית ריכוז סופי של 9.5 מ מ.
    7. שוקלים לצאת 4.9 מ ג של 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CPH) (223.7 g/mol).
    8. יתמוסס CPH 1 מ"ל המאגר פוספט רווית ריכוז סופי של 22 מ מ.
    9. Aliquot וחנות ב-80 מעלות צלזיוס (הפשרת ההקפאה לא מומלץ).

2. זיהוי של סופראוקסיד חוץ גופית בתוך

  1. זיהוי של סופראוקסיד הכולל, חוץ-תאית, תאיים בתאים מגורה-PMA 264.7 RAW ב- RT
    1. בעקבות טכניקה נכונה aseptic, להפשיר תאים RAW 264.7, מעבר להם בתקשורת DMEM בתוספת 10% FBS (נמוך ללא אנדוטוקסין) ו 1% antimycotic/אמפיצילין-37 מעלות צלזיוס ב CO2 מיכלים.
    2. זרע תאים RAW 264.7-עונה 1 פרק 106 תאים/היטב לתוך צלחות 6-ובכן יום אחד לפני הטיפול.
    3. בעדינות להסיר מדיה ולשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל KHB המאגר.
    4. להוסיף KHB המכיל 100 מיקרומטר DTPA כדי מכל קידוח, ולטיפול ב הנפח הכולל של 500 µL בפריטים הבאים:
    5. עבור בארות pretreated עם מפגר, להוסיף 15 µL/טוב של הפתרון עובד SOD (1000 U/mL; הריכוז הסופי של SOD = 30 U/mL) דגירה 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני תוספת של CMH, ובחום.
    6. להוסיף µL 12.5/טוב של מניות CMH 10 מ מ (ריכוז סופי = 0.25 מ מ).
    7. להוסיף µL 40/טוב של הפתרון עובד PMA 125 µM (ריכוז סופי = 10 מיקרומטר) או µL 40 רכב (המניות 10 µL של דימתיל סולפוקסיד ב 390 µL ל- PBS).
    8. תקופת דגירה של 50 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO.
    9. הסר את הצלחות של החממה ולמקם אותם מיד על קרח.
    10. לאסוף מאגר מכל קידוח ב mL 1.5 נפרדים, שכותרתו צינורות. לשמור על הקרח ברחבי.
    11. להוסיף 100 µL טריים KHB מאגר המכיל 100 מיקרומטר DTPA, בעדינות לגרד את התאים, resuspend על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. לשמור על הקרח ברחבי תא resuspension.
    12. טען הדגימה אסף בשלבים 2.1.10 ו 2.1.11 (50 µL) בכל אחד צינורות קפילר. חותם בשני הקצוות ולהפעיל את EPR.
      הערה: תמיד לבדוק את צינור או טוב (ללא תאים) המכיל את החללית במאגר (ריכוז זהה = 0.25 מ מ), התייחס תחת באותם התנאים כמו התאים (באותו זמן דגירה וטמפרטורה) כפקד, מאז רקע בעוצמה של המכשיר הוא חום - תלויי-זמן.
    13. קבע את הפרמטרים רכישה EPR לגורמים הבאים: מיקרוגל תדירות = 9.65 ג'יגה-הרץ; מרכז השדה = 3432 G; אפנון משרעת = 2.0 G; לטאטא רוחב = 80 גר'; מיקרוגל כוח = 19.9 mW; המספר הכולל של סריקות = 10; טאטא זמן = 12.11 s; זמן מתמדת = 20.48 ms.
  2. זיהוי של סופראוקסיד מיטוכונדריאלי בתאים 264.7 גולמי
    1. בצע שלבים 2.1.1 ו 2.1.2 לתאי הזרע 264.7 גלם יום אחד לפני הניסוי.
    2. להסיר מדיה ולשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל KHB המאגר.
    3. להוסיף 200 µL של KHB המכיל 100 מיקרומטר DTPA כדי מכל קידוח.
    4. להוסיף 5.3 µL טוב של מניות mito-טמפו-ה 9.5 מ מ (ריכוז סופי = 0.25 מ מ)
    5. תקופת דגירה של 10 דקות ב- RT.
    6. להוסיף 1 µL/טוב של antimycin A (AA), 5 מ מ פתרון מניות אתנול (ריכוז סופי = מיקרומטר 25).
    7. תקופת דגירה של 50 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO.
    8. הסר את הצלחות של החממה ולמקם אותם מיד על קרח.
    9. בעדינות לגרד את התאים, resuspend על ידי pipetting למעלה ולמטה. לשמור על הקרח.
    10. לטעון את הדגימה צינור קפילרי. חותם בשני הקצוות.
    11. עיין בסעיף הקודם עבור EPR הגדרה.
  3. זיהוי של סופראוקסיד בתאים RAW 264.7 ב- 77 K
    1. מקום המאגר שנאספו בשלב 1.1.10 ב PTFE מוכן מראש צינורות 1-2 ס מ אורך (3 / "16" OD x 1/8 פלייר מזהה). ודא כי הצנרת PTFE הוא ישר אז זה יכול להיות בקלות להוסיף, להסיר את האצבע דיואר. השתמש פקק גומי כדי לסגור את קצה אחד של הצנרת PTFE, pipette את המאגר או תא ההשעיה (100 עד 150 µL) אל הצנרת PTFE, לאטום את הצנרור עם פקק השני.
    2. פלאש להקפיא את הדגימה של חנקן נוזלי. המדגם יכולים להעביר צינור הקפאה קריוגנית שכותרתו לאחסון ב-80 מעלות צלזיוס או להפעיל באופן מיידי.
    3. למלא את האצבע דיואר עם חנקן נוזלי, הוסף הצנרור PTFE המכיל את הדגימה לאצבע דיואר. ודא המדגם הוא ממורכז במרחב פעיל של מהוד ולהפעיל EPR-77 K...
      הערה: להתחיל את זרימת גז חנקן ספקטרומטר שלך 15-30 דקות לפני המדידות, ולהמשיך לזרימה לאורך כל המדידות כדי למנוע עיבוי מים ב מהוד.
    4. הגדרת פרמטרים לרכישת EPR לגורמים הבאים: מיקרוגל תדירות = 9.65 ג'יגה-הרץ; מרכז השדה = 3438 G; אפנון משרעת = 4.0 G; לטאטא רוחב = 150 גרם; מיקרוגל כוח = 0.316 mW; המספר הכולל של סריקות = 10; טאטא זמן = 60 s; זמן מתמדת = 1.28 ms.

3. EPR מידות נוזלים

  1. דם מלא
    1. פנקו עכברים (בת 8-12 שבועות) עם מנה אחת של bleomycin intratracheal (Bleo; µL 100-1 U/mL) מומס PBS או PBS לבד כמו שתואר לעיל16,17.
    2. המתת חסד עכברים על ידי מתן בשאיפה איזופלוריין (1.5-4%) ואחריו דימום למוות, נקע בצוואר הרחם. האחות דם דרך החדר הימני לתוך מזרק מצופה עם הפרין (1000 USP/mL) המכילה 100 מיקרומטר DTPA, העברת צינור 1.5 מ.
    3. בשפופרת mL 1.5 נפרדים, להוסיף µL 15 ל- PBS המכיל 100 מיקרומטר DTPA, µL 3 של CMH (10 מ מ) כדי µL 132 דם עבור הנפח הכולל של 150 µL וריכוז CMH הסופי של 0.2 מ מ.
    4. דגירה דם למשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
    5. הסר את הצינורות המים הרותחים.
    6. לקחת את aliquot על-ידי טעינת דם צינור קפילרי ולהפעיל EPR ב RT עם הפרמטרים הבאים של רכישת EPR: מיקרוגל תדירות = 9.65 ג'יגה-הרץ; מרכז השדה = 3432 G; אפנון משרעת = 1.0 G; לטאטא רוחב = 80 גר'; מיקרוגל כוח = 19.9 mW; המספר הכולל של סריקות = 3; טאטא זמן = 12.11 s; זמן מתמדת = גב' 20.48. לחלופין, דגימות יכול להיות הוקפא במהירות כשלב שמתואר 2.3 עבור מדידות-77 ק' EPR רכישה הפרמטרים הם הבאים: מיקרוגל תדירות = 9.65 ג'יגה-הרץ; מרכז השדה = 3438 G; אפנון משרעת = 4.0 G; לטאטא רוחב = 150 גרם; מיקרוגל כוח = 0.316 mW; המספר הכולל של סריקות = 2; טאטא זמן = 60 s; זמן מתמדת = 1.28 ms.
  2. נוזל שטיפה Bronchoalveolar (BALF)
    1. לאחר המתת חסד (ראה שלב 3.1.2), לאסוף BALF על ידי לאט הקניית פורש 1 מ"ל של PBS המכיל 100 מיקרומטר DTPA שלוש פעמים ב מזרק דרך בצינורית להציב קנה הנשימה.
    2. צינור 1.5 mL, לפנק µL 200 של BALF עם 4 µL של CMH (10 מ מ) בריכוז הסופי של 0.2 מ מ.
    3. תקופת דגירה BALF של 50 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
    4. לקחת את צינורות מהאמבטיה מים ומניחים אותם על קרח.
    5. עומס BALF צינור קפילרי ו EPR לרוץ ב RT עם EPR באותן ההגדרות כמו בשימוש צעד 1.1.13, או פלאש להקפיא במצב חנקן נוזלי כפי שמתואר בשלב 2.3.
  3. מידות EPR דם, BALF-77 K
    1. לפי התקנון הנ ל כדי לאסוף דם (צעדים 3.1.1. כדי 3.1.4) ו BALF (שלבים 3.2.1 כדי 3.2.4).
    2. במקום 150 µL של דם המטופל או BALF ב PTFE אבובים (ב 1-2). השתמש פקק גומי לסגירת קצה אחד של הצנרת PTFE לפני הוספת המדגם ו עוד פקק כדי לאטום את הצנרור.
    3. פלאש להקפיא את הדגימה של חנקן נוזלי.
    4. עיין בסעיף 2.3 בהרצה EPR בדגימות קפוא באבובים PTFE באמצעות האצבע שדיואר-ק' 77 בניהול קפוא CMH מטופלים דגימות דם עם תוך שבוע.

4. EPR המידות רקמת הריאה

  1. פלאש רקמת הריאה קפוא
    1. לאחר איסוף של BALF בשלב 3.2.1, פתיחת בית החזה, הריאות סמוקות עם 10 מ"ל של קר PBS דרך החדר הימני כדי להסיר דם. פלאש הקפאת רקמת הריאה בחנקן נוזלי. ניתן לאחסן רקמת הריאה קפוא ב-80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים עד השימוש EPR מעבדתיים.
    2. לייצב את רקמת הריאה בקרח יבש עם פינצטה וחותכים מספר חתיכות קטנות (5-15 מ ג) של רקמת הריאה באמצעות סכין קצה חד.
    3. שוקל את רקמת צינור 1.5 mL, למקם את הצינורית על הסולם להקרע הסקאלה, ולאחר מכן להוסיף את חתיכות רקמה, רושמות את המשקל.
    4. לרקמת בצינור 1.5 mL, להוסיף µL 196 של KHB המכילה DTPA, µL 4 של CMH (0.2 מ מ) כדי להשיג את הנפח הכולל 200 µL.
    5. תקופת דגירה של h 1 ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
    6. ספין למטה (למשך כמה שניות) ב- microcentrifuge ב 3,884 x g.
    7. מניחים על הקרח פיפטה µL 150 של תגובת שיקוע לתוך הצנרת PTFE, ומקפיאים המידות 77 K כמתואר בסעיף 2.3.
      הערה: עבור שיטה זו, הטרוגניות של הפגיעה צריך להיחשב. עבור פגיעת ריאות הנגרמת bleomycin, בהתחשב בעובדה שעברו פציעה הטרוגנית מאוד, מומלץ לחתוך כמה חתיכות רקמה מחלקים שונים של הריאות של כל עכבר. לחלופין, חתיכה גדולה של רקמות יכול להיות הומוגני KHB מאגר המכיל 100 מיקרומטר DTPA-יחס משקל-כדי-כרך 1:6 (מ ג/µL) כפי שמתואר להלן.
  2. רקמת הריאה טריים נשמר במאגר סוכרוז
    1. ריקון הריאות lavaged עם PBS קר ולהסיר את הדם כפי שנעשה צעד 3.1.2.
    2. Homogenize רקמת הריאה טריים טריס-EDTA מאגר המכיל 0.25 M סוכרוז עם יחס 1:6 מאגר/ריאות (mg/µL) באמצעות דאונס רקמות מטחנה עם זכוכית או PTFE המרוסקים.
    3. להוסיף 50 µL של homogenate הריאה µL 450 של KHB המכיל 100 מיקרומטר DTPA.
    4. ב- 1.5 mL צינור (הנפח הכולל של 100 µL), כדי µL 98 של homogenate ריאות ב- KHB, להוסיף 2 µL של CMH של 10 מ מ מניות הסופי בריכוז של 0.2 מ מ.
    5. תקופת דגירה של 20 דקות 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
    6. למקם את הדגימות הקרח ולהעמיס על צינור קפילרי. הפעל EPR ב RT (הגדרות בשימוש בשלב 2.1.13).
    7. כדי לבדוק את התרומה של מינים ספציפיים ומקורות בעזרת מעכבי שונים, מראש לטיפול µL 88 של הריאות homogenate + /-מעכב, התאמה באמצעות KHB כדי להשיג נפח סופי של 98 µL. בניסוי זה, כללו מעכבי µL 10 מקומות (100 U/mL), 4 µL של דפרוקסמין (DFO; הריכוז הסופי = 800 מיקרומטר), או µL 4 של diphenyliodonium כלוריד (DIP; הריכוז הסופי = 100 מיקרומטר). תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
    8. להוסיף 2 µL של CMH, תקופת דגירה של עוד 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ואחריו EPR מדידות כמתואר לעיל. כוללים מדגם ריק בהתאמה חד פעמי עם KHB CMH המכיל מאגר סוכרוז. לחלופין, חנות aliquots של homogenates הריאה הנותרת (שלב 3.1.2) ב-80 מעלות צלזיוס למדידות בעתיד.
      הערה: הנפח הכולל וניתן לשנותם לפי הצורך.
  3. המידות EPR רקמת הריאה של עכברים מוזרק עם ספין הגששים ויוו (ב RT באמצעות רקמות תאים)
    1. להכין פתרון מניות CPH על ידי המסת 4.9 מ ג של CPH ב 1 מ"ל מאגר פוספט מסוננות ולא רווית 50 מ מ.
    2. עזים ומתנגד עכברים עם בשאיפה איזופלוריין (1.5-4%) למשך 20-30 שניות עד להגיב טו צביטה. מזריקים עכברים דרך כביש retroorbital 100 µL של רגש ספין CPH משקל הגוף העכבר 25 גרם (מנה הסופי = 20 מ"ג/ק"ג), ולאפשר החללית הפיצו עבור ה 1 מיד לאחר הזרקת retroorbital, להוסיף טיפה אחת של 0.5% proparacaine HCl על אזור העין למנוע nt העין כאבים ויובש. לפקח על עכברים עבור 1 h והמשך קצירת רקמות.
    3. הקציר רקמת הריאה, כמתואר לעיל, פלאש להקפיא את הריאות.
    4. 20-30 מ"ג של רקמות קפוא בקרח יבש גזורה רושמות את משקל מדויק.
    5. נגב בעדינות את הרקמה עם ניקוי מגבונים לספוג מים עיליים.
    6. מקם את הרקמה בתוך החלון של התא רקמות (אביזר מאפשר EPR מידות עבור דגימות רקמה) ולהפעיל EPR כדי לקבוע את סך ספינים. הנתונים ניתן לבטא ספינים הכולל לכל מ"ג של רקמות.

5. ניתוח נתונים

  1. לדמות ספקטרום EPR שימוש במודול SpinFit שולבו התוכנה קסנון של ספקטרומטר EMXnano EPR הספסל-העליון. לקבוע את הריכוז nitroxide על ידי מודול SpinCount. לחלופין, עקומת כיול של nitroxide יציב כגון 4-הידרוקסי-טמפו או TEMPOL יכול להתבצע, הריכוז יכולה להיות מושגת על-ידי השוואת את עוצמת האות עם דוגמה, תקן.
  2. לשימוש הנתונים שנאספו ב 77 K, שילוב זוגי ואחריו SpinCount.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איתור סופראוקסיד CMH אומתה באמצעות ה-X / הקמב ץ סופראוקסיד יצירת מערכת כדי להדגים כי האות nitroxide (ס. מ..) היה מלא מעוכבים על ידי SOD, בעוד קטלאז היו אין השפעה (איור 1 א'). סופראוקסיד סה כ, חוץ-תאית הוערך אז בתאים 264.7 גלם על ידי תאים ומוכנסות עם החללית ספין CMH תא חד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הערכת ייצור רדיקלים חופשיים בהגדרות ביולוגי חשוב להבין חמצון-חיזור מוסדר איתות על בריאות ומחלה, אבל המדד של המינים הללו הוא מאוד מאתגר בשל זמן מחצית החיים הקצר של רדיקלים חופשיים מינים וטכני מגבלות עם השיטות הנפוצות. EPR הוא כלי חשוב ורב עוצמה בביולוגיה חמצון-חיזור, כמו גם את שיטת ברורה וחד ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר באוניברסיטת קולורדו של רפואה דין פרס תשתיות מחקר אסטרטגי, R01 HL086680-09, 1R35HL139726-01, כדי E.N.G. ו- UCD CFReT מלגת פרס (הוא). המחברים תודה ד ר סנדרה איטון, ד ר גארת איטון (באוניברסיטת דנבר), ד ר ג'רלד רוזן, ד ר יוסף עמ' קאו (אוניברסיטת מרילנד), ד ר תהיה ונקאטרמאן (אוניברסיטת קולורדו בדנוור) דיונים מועילים ואני ג'ואן Maltzahn, אשלי Trumpie, אייבי מקדרמוט (אוניברסיטת קולורדו בדנוור) לקבלת תמיכה טכנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTech10566-016cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific  BP358-212used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )Fisher Scientific  BP363-500used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
Krebs-Henseleit buffer (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)Sigma Aldrich S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma AldrichP1585-1MGDissolve in DMSO
Antimycin A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGDissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
Heparin Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride Sigma Aldrich43088
Deferoxamin mesylate saltSigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMarkSigma Aldrich708733Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16” OD x 1/8” ID		NORELL1598774ATeflon tubing 
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO TISSUE CELLBruker BioSpin GmbHE7004542

References

  1. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  2. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  3. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
  4. Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
  5. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  6. Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
  7. Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
  8. Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
  9. Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
  10. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
  11. Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
  12. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
  13. Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
  14. Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
  15. Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
  16. Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
  17. Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
  18. Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
  19. Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
  20. Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143CMHCPHmito Hnitroxide

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved