JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Elektron paramagnetic rezonans (EPR) spektroskopisi serbest radikallerin ölçmek için kesin bir yöntemdir. Farklı hücresel kompartmanlarda serbest radikallerin algılanması için seçici spin sonda kullanımı sağlar. Biz tedavi, depolama ve örnekleri EPR ölçümler için aktarma kolaylaştırmak biyolojik örnekler toplamak için pratik ve verimli bir yöntem mevcut.

Özet

Reaktif oksijen türleri (ROS) farklı cep ve doku bölmeleri içinde doğru ve belirli algılama redoks düzenlenir sinyal biyolojik ayarlarında çalışması esastır. Elektron paramagnetic rezonans sprektroskopisidir (EPR) serbest radikallerin belirsizliğe yer bırakmadan değerlendirmek için yalnızca doğrudan yöntemidir. Onun avantajı yüksek özgüllük ile belirli türlerin fizyolojik düzeyleri algılar, ama özel teknolojisi, dikkatli numune hazırlama ve uygun denetimleri doğru verilerin yorumlanması sağlamak için gerektirir. Çevrimsel hydroxylamine spin probları seçerek süperoksit veya EPR spektroskopisi tarafından sayısal bir nitroxide sinyal oluşturmak için diğer radikalleri ile tepki. Hücre geçirgen spin probları ve spin probları hızla mitokondri içinde birikir için tasarlanmış farklı hücresel kompartmanlarda süperoksit konsantrasyon belirlenmesi için izin verir.

Kültürlü hücreleri, hücre geçirgen 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) ile birlikte ve hücre geçirimsiz süperoksit dismutaz (SOD) Önarıtma olmadan kullanımı veya hücre geçirgen PEG-SOD kullanımı, sağlar ekstrasellüler sitozolik süperoksit üzerinden farklılaşma. Mitokondriyal 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium ve (mito-TEMPO-H) için ölçüm sağlar Mitokondrial ROS (ağırlıklı olarak süperoksit).

Spin sonda ve EPR spektroskopisi vivo içinde modelleri için de uygulayabilirsiniz. Süperoksit ekstraselüler sıvı kan ve alveoler sıvı gibi yanı sıra doku akciğer dokusu gibi algılanabilir. Birkaç yöntem işlemek ve doku EPR ölçümler için depolamak ve intravenöz 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin sonda içinde vivoteslim için sunulmaktadır. Ölçümler-ebilmek var olmak kılınmak oda sıcaklığında iken, vitro ve in vivo modellerden alınan örnekleri de-80 ° C'de saklanabilir ve 77 K. EPR tarafından analiz Örnekleri özel boru istikrarlı-80 ° C'de depolanan ve bir pratik, verimli, etkinleştirmek için 77 K ve depolama ve aktarma örnekleri kolaylaştırır tekrarlanabilir yöntemini çalıştırın.

Giriş

Oksidatif stres ve reaktif oksijen türlerine tüm organ sistemleri arasında çeşitli hastalıkları çalışma için önemli olmakla birlikte, reaktif oksijen türleri (ROS) tespiti kısa yarılanma ömrü ve yüksek reaktivite nedeniyle zordur. Serbest radikallerin algılamak için en belirgin yöntemi bir elektron paramagnetic rezonans (EPR) tekniğidir. Spin probları daha yaygın olarak kullanılan floresan problar üstünlükleri vardır. Floresan problar nispeten ucuz ve kullanımı kolay ve hızlı, hassas ROS tespiti sağlamak olsa da, onlar manipülasyonun sinyalleri, ROS konsantrasyonları ve özgüllük1 Genel eksikliği hesaplamak için bir yetersizlik nedeniyle ciddi sınırlamalar var mı .

Biyolojik araştırmalar EPR kullanımını kolaylaştırmak için çeşitli biyolojik ilgili serbest radikal türlerin yanı sıra pO2, pH ve redoks ölçebilirsiniz probları sentezlenmiş spin çeşitli devletler2,3, 4,5,6,7. Spin tuzakları da kısa ömürlü radikaller yakalamak için geliştirilmiştir ve form uzun yaşam adducts, hangi EPR8tarafından algılama kolaylaştırır. Her iki sınıfları (spin probları ve spin tuzakları) avantajları ve sınırlamalar vardır. Bir sık kullanılan spin probları sınıfıdır EPR-sessiz ve kararlı bir nitroxide oluşturmak için kısa ömürlü radikaller ile tepki çevrimsel hydroxylamines. Çevrimsel hydroxylamines süperoksit ile 100 kez spin tuzakları, olanaklı kılmak onları hücresel antioksidanlar ile rekabet edebilmek daha hızlı tepki ancak özgüllüğü eksikliği ve uygun denetimleri ve radikal türler veya kaynak tanımlamak için inhibitörleri kullanılmasını sağlayın nitroxide sinyal için sorumludur. Spin sergi özgüllük yakalar süre ile farklı spektral süperoksit bindirme spin için radikal biyolojik yatkındır için desen kapana kısılmış türler üzerinde bağlı olarak, onlar yavaş kinetik var ve adducts. Uygulamalar için spin bindirme Biyomedikal araştırma9,10,11,12,13' te iyi belgelenmiş oldu.

Bu projenin amacı ve deneyler tasarlamaya yönelik pratik EPR yöntemleri göstermektedir için spin kullanarak süperoksit algılamak için örnek hazırlanması farklı hücresel kompartmanlarda içinde vitro ve farklı doku bölmeleri içinde vivoprobları. Birkaç el yazmaları protokolleri analiz fare modelleri için hedef farklı hücresel kompartmanlarda vitro ve işlem doku hücre geçirgen, hücre geçirimsiz ve mitokondrial hedeflenen spin probları kullanarak bu gol ile ilgili yayınlanan 14 , 15. biz kurmak bu beden edebiyat doğru emin olmak için farklı hücresel kompartmanlarda vitro içinde bir 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spin sonda kullanarak süperoksit ölçmek için bir yaklaşım doğrulayarak ölçümler, sonuçları çarpık olası teknik sorunları vurgulayarak. Ayrıca kan, bronchoalveolar lavaj sıvı ve akciğer doku CMH spin sonda kullanarak EPR ölçümleri gerçekleştirmek için yöntemleri sağlar. Bu çalışmalar doku işlemek gibi başka bir spin robot, CPH, doku hasat önce fareler içine enjekte etmek için bir yöntem sunmak için farklı yöntemler karşılaştırın. Son olarak, politetrafloroetilin (PTFE) boru muhafazası ve transferi önce 77 K. ölçülerde EPR örnekleri için izin vermek için örnekleri depolamak için pratik bir yöntem geliştirmek

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları University of Colorado Denver kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. hazırlanması reaktifler

  1. Diethylenetriaminepentaacetic asit (DTPA) hisse senedi (150 mM)
    1. DTPA 2.95 g ekleyin (393.35 g/mol) 10 mL deiyonize su için.
    2. DTPA çözülmeye, 1 M NaOH dropwise ekleyin ve 7.0 bir pH getirmek.
    3. 50 mL su için 150 mM son DTPA konsantrasyon ile ses getirmek ve 4 ° C'de depolayın
  2. Fosfat tampon serum (PBS) (50 mM, pH 7,4)
    1. 5 M sodyum klorür (NaCl) (58.44 g/mol; 29.22 g/100 mL) hazırlayın.
    2. Potasyum fosfat dibasic HK2PO4 (174.18 g/mol; 17.42 g/100 mL) 1 M hazırlamak
    3. Potasyum fosfat Yem mono KH2PO4 (136.1 g/mol; 13.61 g/100 mL) 1 M hazırlamak. 5 M NaCl 3 mL 1 M potasyum fosfat dibasic 4.24 mL ve 0,760 mL 1 M potasyum fosfat Yem mono karıştırın. PH kontrol edin.
    4. 100 mL deiyonize su ile ses getirmek.
    5. Kısa süreli (gün) (RT) Oda sıcaklığında ve uzun vadeli (hafta) depolama için 4 ° C'de depolayın.
  3. 100 µM DTPA içeren Krebs-Henseleit arabellek (KHB)
    1. 50 mL konik santrifüj tüpü 150 mM DTPA hisse senedi çözüm 33,3 µL ekleyin.
    2. Krebs-Henseleit arabellek (KHB) 50 mL birimle getirmek.
    3. Her gün taze DTPA önbellekle hazırlamak ve RT. tutmak
  4. Sükroz içeren Tris-EDTA arabellek
    1. 0, 5 M Tris hisse senedi hazırlamak: 15.14 g 150 ml deiyonize su (121.14 g/mol) Tris tabanının geçiyoruz. HCl kullanarak, pH 7.8 için ayarlamak ve 250 mL nihai bir birime getir.
    2. 21.4 g sükroz dağıtılması (342.29 g/mol; son konsantrasyonu = 0,25 mM) 150 mL deiyonize su içinde.
    3. Tris stokunun 5 mL sukroz için 10 mM son Tris konsantrasyonu elde etmek için ekleyin.
    4. 0.5 mL 0.5 M EDTA stokunun Tris-sükroz için 1 mM son konsantrasyonu elde etmek için ekleyin.
    5. PH kontrol edin ve 7.4 için ayarlayın.
    6. 250 mL deiyonize su ile son hacmi getirmek ve 4 ° C'de depolayın
  5. Sığır eritrosit Cu/Zn süperoksit dismutaz (SOD) hisse senedi (30.000 U/mL)
    1. PBS (yaklaşık 5.7 mg, etkinlik SOD çok bağlı olarak) 1 mL 30.000 SOD U sulandırmak.
    2. Aliquot karıştırın ve kısa süreli (6-12 ay)-20 ° C'de ve uzun süreli depolama için-80 ° C'de depolayın.
  6. SOD çalışma çözüm (1000 U/mL)
    1. 30.000 U/mL SOD stokunun 30 µL aliquot steril PBS bir 870 µL aktarın.
    2. Çözüm buz üzerinde tutmak ve taze kullanabilirsiniz.
  7. Phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) hisse senedi (5 mM)
    1. PMA 1 mg dağıtılması (616.83 g/mol) 325 µL DMSO içinde (son konsantrasyonu 5 mM =).
    2. Aliquot 5 mM PMA çözüm ve -20 ° C'de saklayın
  8. PMA çalışma çözüm (125 µM)
    1. 5 mM PMA stokunun 10 µL aliquot steril PBS 390 µL sulandırmak.
    2. Çözüm buz üzerinde tutmak ve taze kullanabilirsiniz.
    3. PMA için araç kontrol için DMSO 10 µL PBS 390 µL içinde kullanın.
  9. Diphenyliodonium klorür (DIP) (2.5 mM)
    1. 3.2 mg dağıtılması (316.57 g/mol) 4 mL 2.5 mM hisse senedi almak için daldırma.
    2. Çözüm hazırlamak ve taze kullanabilirsiniz.
  10. Deferoxamine mesylate tuz (DFO) (20 mM)
    1. DFO 4.5 mg dağıtılması (656.79 g / mol) 20 mM hisse senedi almak için 340 µL içinde.
    2. Çözüm hazırlamak ve taze kullanabilirsiniz.
  11. Antimycin A (AA) hisse senedi (5 mM) hazırlanması
    1. Aa 5.4 mg dağıtılması (532 g/mol) 2 ml etanol (son konsantrasyonu 5 mM =).
    2. Aliquot cam şişeleri ve mağaza-20 ° C'de stokta
  12. Spin probları hazırlanması
    1. Çözünmüş oksijen bellekten kaldırmak için 50 mM fosfat tampon içeren 100 µM DTPA 30 dk için azot ile kabarcık.
    2. -20 ° C dondurucudan spin sonda kaldırmak ve RT (10-15 dk) gelmek kapsayıcı sağlar.
    3. 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· 2.4 mg tartmak HCl (CMH) (237.8 g/mol)
    4. 10 mM son bir konsantrasyon için deoxygenated fosfat tampon 1 mL içine CMH geçiyoruz.
    5. 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium ve (mito-TEMPO-H) (529.1 g/mol) 5 mg tartın.
    6. Mito-TEMPO-H 9,5 mM son bir konsantrasyon için deoxygenated fosfat tampon 1 mL içine geçiyoruz.
    7. 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· 4.9 mg tartmak HCl (CPH) (223.7 g/mol).
    8. CPH için 22 mM son bir konsantrasyon deoxygenated fosfat tampon 1 mL içine geçiyoruz.
    9. Aliquot ve mağaza-80 ° c (donma-çözülme tavsiye edilmez).

2. süperoksit içinde vitro tespiti

  1. Toplam, hücre ve hücre içi süperoksit RT, ham 264.7 PMA uyarılmış hücrelerdeki tespiti
    1. Aşağıdaki uygun aseptik teknik, ham 264.7 hücreleri çözülme ve onları DMEM medya ile %10 FBS (düşük endotoksin ücretsiz) ve % 1'antimycotic / ampisilin CO2 kuluçka 37 ° C'de takıma geçiş.
    2. 1 x 106 tohum ham 264.7 hücreler hücreleri/6-şey kalıplara tedavi öncesinde bir gün iyi.
    3. Yavaşça medyayı çıkarın ve 1 mL KHB arabelleği bir kez hücrelerle yıkayın.
    4. Her şey için 100 µM DTPA içeren KHB ekleyin ve aşağıdaki ile 500 µL toplam hacmi içinde tedavi:
    5. SOD ile ön işleme wells eklemek için 15 µL/iyi SOD çalışma çözüm (1000 U/mL; SOD son konsantrasyonu 30 U/mL =) ve 10 min için önce ek 37 ° C'de CMH ve PMA kuluçkaya.
    6. 12.5 µL/iyi 10 mM CMH stokunun ekleyin (son konsantrasyonu = 0,25 mM).
    7. 40 µL/iyi 125 µM PMA çalışma çözüm ekleyin (son konsantrasyonu 10 µM =) ya da 40 µL araç (DMSO hisse senedi 10 µL PBS 390 µL içinde).
    8. CO2 kuluçka 37 ° C'de 50 dk için kuluçkaya.
    9. Tabakları da kuluçka kaldır ve hemen buza koyun.
    10. Arabellek ayrı, 1,5 mL tüpler etiketli, her kuyuya toplamak. Buzda tut.
    11. Taze KHB arabelleği 100 µM DTPA içeren 100 µL eklemek, yavaşça hücreleri scrape ve yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından resuspend. Hücre resuspension boyunca buzda tut.
    12. Yük örnek adım 2.1.10 ve 2.1.11 (50 µL) her kılcal tüpler içinde toplanır. Her iki ucu mühür ve EPR çalıştırın.
      Not: Her zaman bir tüp test veya arabellek soruşturma de olmayan (hücreler) içeren (aynı konsantrasyonu = 0,25 mM), sonda yoğunluğunu arka plan olduğundan sıcaklık - bir denetim olarak (aynı kuluçka zaman ve sıcaklık) hücreler olarak aynı koşullarda tedavi ve saat-bağımlı.
    13. EPR satın alma parametrelerini ayarlamak için aşağıdaki: Mikrodalga frekansı 9.65 GHz; = Orta sahaya 3432 G; = Modülasyon genlik = 2.0 G; Süpürme genişliği = 80 G; Mikrodalga güç 19,9 = mW; Toplam Tarama sayısı = 10; süpürme zaman 12.11 = s; ve zaman sabit 20.48 ms =.
  2. HAM 264.7 hücrelerde mitokondrial süperoksit tespiti
    1. 2.1.1 ve 2.1.2 tohum ham 264.7 hücrelere bir gün önce deneme adımları.
    2. Medyayı çıkarın ve 1 mL KHB arabelleği bir kez hücrelerle yıkayın.
    3. Her şey için 100 µM DTPA içeren KHB 200 µL ekleyin.
    4. 5.3 µL/iyi 9,5 mM mito-TEMPO-H stokunun ekleyin (son konsantrasyonu = 0,25 mM)
    5. 10 dakika dik, kuluçkaya
    6. 1 µL/iyi antimycin A (AA), 5 mM etanol hisse senedi çözümde eklemek (son toplama 25 µM =).
    7. CO2 kuluçka 37 ° C'de 50 dk için kuluçkaya.
    8. Tabakları da kuluçka kaldır ve hemen buza koyun.
    9. Yavaşça hücreleri scrape ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Buz üstünde tutun.
    10. Örnek bir kılcal tüp yükleyin. Her iki ucu kapatın.
    11. EPR ayarı için önceki bölüme bakın.
  3. Süperoksit 77 k ham 264.7 hücrelerdeki tespiti
    1. Adım 1.1.10 önceden hazırlanmış PTFE 1-2 inç içinde uzunluk (3/16" x 1/8" kimliği OD) boru'de toplanan arabelleği yerleştirin. Böylece bunu kolaylıkla eklenen ve parmak kaldırıldı PTFE boru düz olduğundan emin olun dewar. Kauçuk tıpa PTFE boru bir ucunu kapatın, arabellek veya hücre süspansiyon (100-150 µL) PTFE boru içine pipette ve ikinci bir tıpa ile tüp mühür kullanmak.
    2. Flaş donma örnek sıvı azot. Örnek bir etiketli dondurma tüp-80 ° C'de depolama için transfer veya hemen çalıştırın.
    3. Parmak doldurmak dewar sıvı azot ve INSERT parmak örnek içeren PTFE boru ile dewar. Emin olun örnek rezonatör etkin uzayda merkezli ve 77 K. EPR çalıştırın
      Not: Azot Gaz akışı, spektrometre için başlatma 15-30 dk önce ölçümleri ve su yoğunlaşma rezonatör içinde önlemek için ölçümleri boyunca bu akışı devam.
    4. Set EPR edinme parametreler şu şekilde: Mikrodalga frekansı 9.65 GHz; = Orta sahaya 3438 G; = Modülasyon genlik = 4.0 G; Süpürme genişliği = 150 G; Mikrodalga güç 0.316 = mW; Toplam Tarama sayısı = 10; süpürme saat = 60 s; ve zaman sabit 1.28 ms =.

3. EPR ölçümlerde sıvıları

  1. Tam kan
    1. Fareler (8-12 hafta yaşlı) PBS veya PBS yukarıda açıklanan16,17olarak yalnız çözünmüş boğaza bleomycin (Bleo; 1 U/mL, 100 µL) tek bir doz ile tedavi.
    2. Fareler inhale isoflurane (1.5-%4) ardından kan kaybı ve servikal çıkığı yönetmek olarak ötenazi. Kan yoluyla sağ ventrikül içine 100 µM DTPA ve 1,5 mL tüp transferi içeren heparin (1000 USP/mL) ile kaplı bir şırınga Aspire edin.
    3. Bir ayrı 1,5 mL tüp 100 µM DTPA içeren PBS 15 µL ekleyin ve CMH (10 mM) 3 µL kan 150 µL toplam hacmi ve 0.2 mM son CMH konsantrasyon için 132 µL için.
    4. Kan bir su banyosu içinde 37 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya.
    5. Borular su banyosundan kaldırın.
    6. Bir aliquot kan kılcal tüp içinde yükleyerek alıp EPR RT aşağıdaki EPR edinme parametrelerle: Mikrodalga frekansı 9.65 GHz; = Orta sahaya 3432 G; = Modülasyon genlik = 1.0 G; Süpürme genişliği = 80 G; Mikrodalga güç 19,9 = mW; Toplam Tarama sayısı = 3; süpürme zaman 12.11 = s; ve zaman sabit için 77 K. EPR edinme parametreleri ölçülerde aşağıdaki örnekleri olmak flash başlığı altında açıklandığı adım 2.3 olarak donmuş 20.48 Bayan alternatif olarak, =: Mikrodalga frekansı 9.65 GHz; = Orta sahaya 3438 G; = Modülasyon genlik = 4.0 G; Süpürme genişliği = 150 G; Mikrodalga güç 0.316 = mW; Toplam Tarama sayısı = 2; süpürme saat = 60 s; ve zaman sabit 1.28 ms =.
  2. Bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF)
    1. Ötenazi sonra (bkz. Adım 3.1.2), yavaş yavaş instilling ve 1 mL 100 µM DTPA borusunda yerleştirilen bir kanül üç kez bir şırınga ile içinde içeren PBS çekilmesi tarafından BALF toplamak.
    2. Bir 1,5 mL tüp BALF 200 µL 4 µL 0.2 mM son bir konsantrasyon elde etmek için CMH (10 mM) ile tedavi.
    3. BALF su banyosu içinde 37 ° C'de 50 dk için kuluçkaya.
    4. Borular su banyosu dışarı almak ve buza koyun.
    5. Yük BALF bir kılcal tüp ve RT, çalışma EPR aynı EPR ayarları ile kullanılan gibi adım 1.1.13 veya flaş dondurma sıvı azot 2.3 adımda anlatıldığı gibi.
  3. Kan ve BALF EPR ölçümlerde 77 k
    1. Kan toplamak için yukarıdaki protokolü takip (3.1.1 adımlar. 3.1.4 için) ve BALF (adım 3.2.1 3.2.4).
    2. Tedavi kan veya BALF PTFE (1-2 inç) boru içinde yer 150 µL. Kauçuk tıpa örnek ve tüp mühürlemek için başka bir tıpa eklemeden önce PTFE boru bir ucunu kapatmak için kullanın.
    3. Flaş donma örnek sıvı azot.
    4. Ayrıntılar için bölümüne 2.3 EPR dewar 77 K. Çalıştır dondurulmuş CMH, kan örnekleri ile bir haftada tedavi parmak kullanarak PTFE boru içinde donmuş numuneler üzerinde çalışıyor bakın.

4. EPR ölçümleri akciğer dokusu üzerinde

  1. Donmuş akciğer doku flash
    1. 3.2.1. adımda BALF toplama sonra göğüs açılır ve akciğerler 10 mL ile soğuk PBS üzerinden kan kaldırmak için sağ ventrikül temizlendi. Flaş donma sıvı azot akciğer dokusunda. Donmuş akciğer doku-80 ° C'de EPR ölçümleri için 6 ay kullanım kadar depolanabilir.
    2. Akciğer dokusu Kuru buz üzerinde cımbız ile stabilize ve birden çok küçük parçalar (5-15 mg) tek-kenar bıçak kullanarak akciğer dokusunun kesin.
    3. Doku tartmak bir 1,5 mL Tüp, tüp ölçek üzerinde yer ve ölçeğin, Dara sonra doku parçaları ekleyin ve ağırlığı kaydetmek.
    4. 1.5 mL tüp dokusunda için 200 µL toplam hacmi elde etmek için DTPA ve 4 µL CMH (0.2 mM) içeren KHB 196 µL ekleyin.
    5. Bir su banyosu içinde 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya.
    6. Aşağı bir microcentrifuge 3,884 x g de (birkaç saniye) spin.
    7. Buza koyun ve süpernatant ile 150 µL PTFE boru içine pipet ve 77 K ölçülerini 2.3 bölümünde açıklandığı gibi dondurma.
      Not: Bu yöntem için yaralanma heterojen dikkate alınması gerekiyor. Son derece heterojen bir yaralanma, verilen bu bleomycin kaynaklı akciğer yaralanma için her fareden farklı yerlerinden akciğer birkaç doku parçaları kesmek için önerilir. Alternatif olarak, doku daha büyük bir parça KHB arabelleği 100 µM DTPA 1:6 kilo hacim oranı (mg/µL), aşağıda açıklandığı gibi içeren homojen.
  2. Sükroz arabellekte korunmuş taze akciğer dokusu
    1. Adım 3.1.2 yapılır gibi kan kaldırmak için soğuk PBS ile lavaged akciğer Temizleme.
    2. Dounce doku değirmeni bir cam veya PTFE havaneli ile kullanarak 1:6 akciğer/arabellek (mg/µL) oranı ile 0.25 M Sükroz içeren Tris-EDTA arabellek taze akciğer dokusunda lunaparkçı.
    3. Akciğer homogenate 50 µL 100 µM DTPA içeren KHB 450 µL için ekleyin.
    4. Bir 1,5 mL tüp içinde (bir toplam hacmi 100 µL), 98 µL KHB akciğer homogenate için 10 mM stokunun CMH-0.2 mM son bir konsantrasyon elde etmek için 2 µL ekleyin.
    5. 20 dk 37 ° C'de bir su banyosu için kuluçkaya.
    6. Örnekleri buza koyun ve kapiller tüpünde yükleyin. EPR RT (2.1.13 adımda kullanılan ayarları) çalıştırın.
    7. Belirli tür ve farklı inhibitörleri kullanarak kaynakları katkısını sınamak için akciğer homogenate inhibitörü KHB ile 98 µL son hacmi elde etmek için ayarlama, +/-88 µL önceden tedavi. Bu deneyde, SOD 10 µL inhibitörleri dahil (100 U/mL), Deferoksamin 4 µL (DFO; son konsantrasyonu = 800 µM), veya diphenyliodonium klorür 4 µL (DIP; son toplama 100 µM =). Bir su banyosu içinde 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya.
    8. CMH 2 µL ekleyin ve yukarıda açıklandığı gibi EPR ölçümleri tarafından takip 37 ° C'de başka bir 20 dk için kuluçkaya. Bir kerelik eşleşen boş örnek CMH sükroz arabellek içeren KHB ile içerir. Alternatif olarak, gelecekte ölçümler için-80 ° C'de kalan akciğer homogenates (adım 3.1.2) aliquots saklayın.
      Not: Toplam hacim gerektiği şekilde ölçeklenebilir.
  3. Akciğer doku spin probları vivo içinde (RT doku hücre kullanarak) adlı enjekte fareler üzerinde EPR ölçümler
    1. CPH hisse senedi çözüm CPH 4.9 mg 50 mM filtre uygulanmış ve deoxygenated fosfat tampon 1 ml çözülerek hazırlayın.
    2. Fareler inhale isoflurane (% 1.5-4) ile 20-30 saniye boyunca yanıt vermiyor kadar çimdik tırnağa anestezi. Fare ile retroorbital yol CPH spin inceleyebilirsek 25 g fare vücut ağırlığı için 100 µL ile enjekte (son dozu 20 mg/kg =) ve sonda 1 h. için hemen retroorbital enjeksiyon sonra dolaşımda, % 0.5 proparacaine HCl bir damla göz çevresi için preve eklemek izin NT göz ağrısı ve kuruluk. Fareler için 1 h izlemek ve doku hasat için devam edin.
    3. Akciğer dokusu yukarıda açıklandığı gibi hasat ve flaş dondurma akciğerler.
    4. 20-30 mg donmuş doku kuru buza kesti ve tam ağırlık kaydedin.
    5. Doku temizlik bezleri herhangi bir yüzey su emme ile yavaşça silin.
    6. Doku (suç ortağı doku örnekleri EPR ölçülerini sağlar) doku hücre penceresi içinde yerleştirin ve EPR toplam spin belirlemek için çalıştırın. Verileri doku mg başına toplam spin olarak ifade edilebilir.

5. veri analizi

  1. Tezgah üstü EMXnano EPR Spektrometre Xenon yazılım verilen SpinFit modülü kullanılarak EPR spectra simülasyonu. SpinCount modülü tarafından nitroxide konsantrasyonu belirlemek. Alternatif olarak, istikrarlı bir nitroxide 4-hidroksi-TEMPO veya TEMPOL gibi bir kalibrasyon eğrisi yapılabilir ve konsantrasyonu örnek ve standart ile sinyal yoğunluğu karşılaştırarak elde edilebilir.
  2. 77 K toplanan veriler için çift entegrasyon tarafından SpinCount ardından kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

CMH süperoksit algılama doğrulanmış X kullanarak / XO süperoksit üreten katalaz (Şekil 1A) etkisi varken nitroxide (CM.) sinyal SOD tarafından inhibe tam olarak göstermek için sistem. Toplam, hücre dışı süperoksit, hücre geçirgen CMH spin sonda SOD Önarıtma +/-ile sonra çiğ 264.7 hücreleri kuluçka hücreleri tarafından değerlendirilmiştir. Nitroxide konsantrasyonu hücre süspansiyon ve iki örnek türü değerleri benzer...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Düzenlenmiş anlayış redoks sağlık ve hastalık sinyal biyolojik ayarları üretimde serbest radikal değerlendirilmesi önemlidir ama bu tür son derece serbest radikal türlerin kısa yarılanma nedeniyle zorlu ve teknik ölçüsüdür Genel olarak kullanılan sınırlamalarla. EPR redoks biyoloji, değerli ve güçlü bir araç olduğu serbest radikallerin algılamak için sadece belirli bir yöntemdir. Bu projede, biz tasarlama deneyler ve spin kullanarak ROS probları farklı hücresel kompartmanlarda vitro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser tıp Dekan'ın Stratejik Araştırma altyapı Ödülü, R01 HL086680-09 ve 1R35HL139726-01, E.N.G. ve UCD CFReT Dostluk Ödülü (o) Colorado Üniversitesi Okulu tarafından desteklenmiştir. Dr Sandra Eaton ve Dr. Gareth Eaton (Denver Üniversitesi), Dr. Gerald Rosen ve Dr. Joseph P. Kao (İstanbul Üniversitesi) ve Dr Sujatha Venkataraman (Colorado Üniversitesi, Denver) için yararlı tartışmalar ve Joanne Maltzahn, Ashley yazarlar teşekkür Trumpie ve teknik destek için Ivy McDermott (Colorado Üniversitesi, Denver).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTech10566-016cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific  BP358-212used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )Fisher Scientific  BP363-500used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
Krebs-Henseleit buffer (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)Sigma Aldrich S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma AldrichP1585-1MGDissolve in DMSO
Antimycin A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGDissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
Heparin Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride Sigma Aldrich43088
Deferoxamin mesylate saltSigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMarkSigma Aldrich708733Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16” OD x 1/8” ID		NORELL1598774ATeflon tubing 
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO TISSUE CELLBruker BioSpin GmbHE7004542

Referanslar

  1. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  2. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  3. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
  4. Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
  5. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  6. Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
  7. Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
  8. Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
  9. Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
  10. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
  11. Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
  12. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
  13. Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
  14. Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
  15. Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
  16. Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
  17. Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
  18. Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
  19. Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
  20. Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 143elektron paramagnetic rezonansspin problarCMHCPHmito TEMPO Hs peroksitreaktif oksijen t rlerinitroxides peroksit dismutazpolitetrafloroetilin boru

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır