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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Spektroskopie ist eine eindeutige Methode, freie Radikale zu messen. Die Verwendung von selektive Spin Sonden kann für die Erkennung von freien Radikalen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Wir präsentieren Ihnen eine praktische und effiziente Methode zur biologische Proben zu sammeln, die zu erleichtern, Behandlung, Speicherung und Übertragung von Proben für EPR-Messungen.

Zusammenfassung

Die genaue und spezifische Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in verschiedenen Mobilfunk- und Gewebe Kompartimenten ist wichtig für die Untersuchung von Redox-regulierten Signalisierung in biologischen Einstellungen. Elektron-paramagnetische Resonanz-Spektroskopie (EPR) ist die einzige direkte Methode, um freie Radikale eindeutig zu beurteilen. Sein Vorteil ist, dass physiologische Ebenen von bestimmten Arten mit hoher Spezifität erkennt, aber es erfordert spezialisierte Technologie, sorgfältige Probenvorbereitung und entsprechende Kontrollen, um genaue Interpretation der Daten zu gewährleisten. Zyklische Hydroxylamin Spin Sonden reagieren selektiv mit Superoxid oder andere radikale ein Nitroxid-Signal generieren, die von EPR-Spektroskopie quantifiziert werden können. Zelle durchlässig Spin Sonden und Spin Sonden entwickelt, um schnell in den Mitochondrien sammeln ermöglichen die Bestimmung der Superoxid-Konzentration in verschiedenen zellulären Kompartimenten.

In kultivierten Zellen, die Verwendung der Zelle durchlässig 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) zusammen mit und ohne Handy-undurchlässig Superoxid Dismutase (SOD) Vorbehandlung oder Verwendung der Zelle durchlässig PEG-SOD, ermöglicht die Differenzierung der extrazellulären aus cytosolischen Superoxid. Die mitochondriale 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] Piperidinium Paraquatdichlorid (Mito-TEMPO-H) ermöglicht die Messung von mitochondrialen ROS (überwiegend Superoxid).

Spin-Sonden und EPR-Spektroskopie können auch auf in Vivo Modelle angewendet werden. Superoxid kann in extrazellulären Flüssigkeiten wie Blut und alveoläre Flüssigkeit sowie Gewebe wie Lungengewebe erkannt werden. Verschiedene Methoden werden vorgestellt, um zu verarbeiten und speichern Gewebe für EPR-Messungen und intravenöse 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) Spin Sonde in Vivozu liefern. Während Messungen bei Raumtemperatur durchgeführt werden können, können durch EPR bei 77 K. Proben aus in Vitro und in Vivo Modellen auch bei-80 ° C gelagert und analysiert werden Die Proben können in spezialisierten Schläuche stabil bei-80 ° C gelagert und laufen bei 77 K ermöglichen eine praktische, effiziente und reproduzierbare Methode, das erleichtert die Speicherung und Übertragung von Proben.

Einleitung

Maßnahmen der oxidativen Stress und reaktive Sauerstoffspezies sind, zwar wichtig für die Untersuchung von verschiedenen Krankheiten auf alle Organsysteme ist die Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch eine kurze Halbwertszeit und hohe Reaktivität anspruchsvoll. Eine Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Technik ist die am meisten eindeutige Methode zur Erkennung von freien Radikalen. Spin-Sonden haben Vorteile gegenüber den häufig verwendeten fluoreszierenden Sonden. Obwohl fluoreszierende Sonden sind relativ preiswert und einfach zu bedienen und ermöglichen eine schnelle, empfindliche Erkennung von ROS, haben sie gravierende Einschränkungen aufgrund Serums Signale, die Unfähigkeit, ROS Konzentration und einen allgemeinen Mangel an Spezifität1 berechnen .

Für eine einfache Handhabung des EPR für biologische Studien besagt eine Vielzahl von Spin Sonden synthetisiert worden, die eine Reihe von biologisch relevante radikalische Spezies sowie pO-2, pH und Redox messen können2,3, 4,5,6,7. Spin fallen auch entwickelt wurden, um kurzlebige radikale einzufangen und Form langlebige Addukte, die Erkennung von EPR8erleichtert. Beide Klassen (Spin-Sonden und Spin Traps) haben Vorteile und Einschränkungen. Eine häufig verwendete Klasse von Spin-Sonden sind zyklische Hydroxylamines, die EPR-Silent und reagieren mit kurzlebigen radikalen eine stabile Nitroxid bilden. Zyklische Hydroxylamines mit Superoxid 100 Mal schneller reagieren als Spin fallen, damit zu konkurrieren mit zellulären Antioxidantien, aber es fehlt Ihnen Spezifität und erfordern den Einsatz von geeigneten Kontrollen und Inhibitoren, die radikale Art oder Quelle zu identifizieren verantwortlich für das Nitroxid-Signal. Während Spin Ausstellung Spezifität Traps, Addukte mit unterschiedlichen spektralen Mustern je nach Gattung gefangen, sie haben langsame Kinetik für Superoxid spin überfüllen und sind anfällig für biologischen Abbau der radikalen. Anwendungen für Spin Überfüllung wurden gut dokumentiert in der biomedizinischen Forschung9,10,11,12,13.

Das Ziel dieses Projektes ist es, praktische EPR-Methoden für die Gestaltung von Experimenten zeigen und Probenvorbereitung, Superoxid mit Spin zu erkennen-Sonden in verschiedenen zellulären Kompartimenten in Vitro und in verschiedene Gewebe Fächer in Vivo. Mehrere Handschriften wurden Protokolle für diese Ziele mit Zelle durchlässig, Zelle-undurchlässig und mitochondriale gezielte Spin Sonden zu verschiedenen zellulären Kompartimenten in Vitro und Prozess Zielgewebe zur Analyse in Mausmodellen veröffentlicht. 14 , 15. Wir bauen auf diesem Körper der Literatur durch die Überprüfung eines Ansatzes zur Messung der Superoxid mittels 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) Spin Sonde in verschiedenen zellulären Kompartimenten in-vitro- um genau zu gewährleisten Messungen, Hervorhebung mögliche technische Probleme, die die Ergebnisse verzerren können. Wir bieten auch Methoden zum Ausführen von EPR-Messungen im Blut, alvéolaire Lavage Fluid und Lungengewebe mit der CMH-Spin-Sonde. Diese Studien vergleichen verschiedene Methoden, um Gewebe zu verarbeiten sowie eine Methode, um ein weiteres Spin-Sonde, CPH, in Mäuse vor der Ernte Gewebe injizieren zu präsentieren. Schließlich entwickeln wir eine praktische Methode zum Speichern von Proben in Polytetrafluorethylen (PTFE) Schlauch ermöglicht die Speicherung und Übermittlung von Proben vor dem EPR-Messungen bei 77 K.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der University of Colorado Denver institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Diethylenetriaminepentaacetic Säure (DTPA) Lager (150 mM)
    1. Fügen Sie 2,95 g DTPA (393.35 g/Mol) auf 10 mL entionisiertem Wasser.
    2. Auflösen von DTPA, 1 M NaOH tropfenweise hinzufügen und bringen einem pH-Wert von 7,0.
    3. Bringen Sie die Lautstärke auf 50 mL mit Wasser für eine Endkonzentration von DTPA von 150 mM und bei 4 ° c lagern
  2. Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) (50 mM, pH 7.4)
    1. 5 M von Natriumchlorid (NaCl) (58.44 g/Mol; 29,22 g/100 mL) vorzubereiten.
    2. Bereiten Sie 1 M von Kalium Phosphat Diabas-HK2PO4 (174.18 g/Mol; 17,42 g/100 mL)
    3. Bereiten Sie 1 M von Kalium Phosphat monobasic KH2PO4 (136.1 g/Mol; 13,61 g/100 mL). Mischen Sie 3 mL 5 M NaCl mit 4,24 mL 1 M Kalium Phosphat Diabas- und 0,760 mL 1 M Kalium Phosphat monobasic. Überprüfen Sie den pH-Wert.
    4. Bringen Sie die Lautstärke auf 100 mL mit entionisiertem Wasser.
    5. Bei Raumtemperatur (RT) für kurzfristige (Tage) und bei 4 ° C für langfristige (Wochen) Speicher speichern.
  3. Krebs-Henseleit-Puffer (KHB), enthält 100 µM DTPA
    1. Fügen Sie in 50 mL konische Zentrifugenröhrchen 33,3 µL der Stammlösung 150 mM DTPA.
    2. Eine 50 mL Volumen mit Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) bringen.
    3. Bereiten Sie frische Puffer mit DTPA jeden Tag und halten Sie es bei RT
  4. Tris-EDTA Puffer mit Saccharose
    1. 0,5 M Tris Lager vorbereiten: 15,14 g Tris-Base (121.14 g/Mol) in 150 mL entionisiertem Wasser auflösen. Mit HCl, stellen Sie den pH-Wert auf 7,8 und bringen Sie zu einem Endvolumen von 250 mL.
    2. Auflösen von 21,4 g Saccharose (342.29 g/Mol; Endkonzentration = 0,25 mM) in 150 mL entionisiertem Wasser.
    3. Saccharose, 10 mM Tris Endkonzentration zu erreichen fügen Sie 5 mL Tris Bestand hinzu.
    4. Fügen Sie 0,5 mL 0,5 M EDTA bestand Tris-Saccharose, eine Endkonzentration von 1 mM zu erreichen hinzu.
    5. Überprüfen Sie den pH-Wert und auf 7,4 einstellen.
    6. Bringen Sie zu einem Endvolumen von 250 mL mit entionisiertem Wasser und Lagerung bei 4 ° C.
  5. Bovine Erythrozyten Cu/Zn-Superoxid-Dismutase (SOD) Lager (30.000 U/mL)
    1. Bereiten Sie 30.000 U SOD in 1 mL PBS (ca. 5,7 mg, je nach Aktivität des SOD-Menge).
    2. Vermischen Sie, aliquoten und bei-20 ° C für kurzfristige (6-12 Monate) und bei-80 ° C für die Langzeitspeicherung zu speichern.
  6. SOD funktionierende Lösung (1000 U/mL)
    1. Übertragen Sie ein 30 µL aliquoten von 30.000 U/mL SOD-Lager in ein 870 µL steriler PBS.
    2. Halten Sie die Lösung auf dem Eis und verwenden Sie frisch.
  7. Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) Lager (5 mM)
    1. Auflösen von 1 mg PMA (616.83 g/Mol) in 325 µL DMSO (Endkonzentration = 5 mM).
    2. Aliquoten eine 5 mM-PMA-Lösung und bei-20 ° c lagern
  8. PMA funktionierende Lösung (125 µM)
    1. Verdünnen Sie eine aliquote 10 µL 5 mM PMA bestand in 390 µL steriler PBS.
    2. Halten Sie die Lösung auf dem Eis und verwenden Sie frisch.
    3. Verwenden Sie für eine Fahrzeugkontrolle für PMA 10 µL des DMSO in 390 µL PBS.
  9. Diphenyliodonium-Chlorid (DIP) (2,5 mM)
    1. Auflösen von 3,2 mg Tauchen (316.57 g/Mol) in 4 mL, ein 2,5 mM-Lager zu erhalten.
    2. Bereiten Sie die Lösung und verwenden Sie frisch.
  10. Deferoxamin Mesylate Salz (DFO) (20 mM)
    1. Auflösen von 4,5 mg DFO (656,79 g / Mol) in 340 µL eine 20 mM-Aktie zu erhalten.
    2. Bereiten Sie die Lösung und verwenden Sie frisch.
  11. Vorbereitung der Antimycin A (AA) Lager (5 mM)
    1. Auflösen von 5,4 mg von AA (532 g/Mol) in 2 mL Ethanol (Endkonzentration = 5 mM).
    2. Aliquoten Lager in Glasfläschchen und Speicher bei-20 ° C.
  12. Vorbereitung von Spin-Sonden
    1. Blase 50 mM Phosphat-Puffer mit 100 µM DTPA mit Stickstoff für 30 min, gelösten Sauerstoff aus dem Puffer zu entfernen.
    2. Die Spin-Sonde aus dem Tiefkühler-20 ° C und des Containers zu RT (10-15 min) kommen.
    3. Wiegen Sie 2,4 mg 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CMH) (237,8 g/Mol)
    4. CMH in 1 mL des Puffers sauerstoffarmes Phosphat für eine Endkonzentration von 10 mM auflösen.
    5. 5 mg 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium Paraquatdichlorid (Mito-TEMPO-H) (529.1 g/Mol) wiegen.
    6. Mito-TEMPO-H in 1 mL des Puffers sauerstoffarmes Phosphat für eine Endkonzentration von 9,5 mM auflösen.
    7. Wiegen Sie 4,9 mg 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CPH) (223.7 g/Mol).
    8. CPH in 1 mL des Puffers sauerstoffarmes Phosphat für eine Endkonzentration von 22 mM auflösen.
    9. Aliquoten und Store bei-80 ° C (Frost-Tau-Wechseln wird nicht empfohlen).

2. Nachweis von Superoxid in vitro

  1. Erkennung von insgesamt extrazellulären und intrazellulären Superoxid in RAW 264,7 PMA-stimulierten Zellen bei RT
    1. Folgende korrekte aseptische Technik, RAW 264,7 Zellen auftauen lassen und sie in DMEM Medien mit 10 % FBS (niedrig Endotoxin-frei) und 1 % antimykotische/Ampicillin bei 37 ° C in CO2 Inkubator ergänzt die passage.
    2. RAW 264,7 Samenzellen bei 1 x 106 Zellen/weit ins 6-Well Platten einen Tag vor der Behandlung.
    3. Sanft entfernen Sie Medien zu und waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL der KHB Puffer.
    4. KHB, enthält 100 µM DTPA in jede Vertiefung hinzufügen, und behandeln in einem Gesamtvolumen von 500 µL mit folgendem:
    5. Für Brunnen vorbehandelt mit SOD, fügen Sie 15 µL/Well der Arbeitslösung SOD (1000 U/mL; Endkonzentration von SOD = 30 U/mL) und inkubieren Sie für 10 min bei 37 ° C vor der Zugabe von CMH und PMA.
    6. Fügen Sie 12,5 µL/Well von 10 mM CMH Lager (Endkonzentration = 0,25 mM).
    7. Hinzufügen von 125 µM PMA Arbeitslösung 40 µL/Well (Endkonzentration = 10 µM) oder 40 µL Fahrzeug (Lager 10 µL des DMSO in 390 µL PBS).
    8. 50 min bei 37 ° C in einem CO2 Inkubator inkubieren.
    9. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sofort auf Eis legen.
    10. Sammeln Sie Puffer aus jedem Brunnen in separaten, 1,5 mL Röhrchen beschriftet. Halten Sie auf dem Eis im ganzen.
    11. Hinzufügen 100 µL frische KHB-Puffer mit 100 µM DTPA, sanft kratzen die Zellen und Aufschwemmen von oben und unten mehrmals pipettieren. Halten Sie auf dem Eis in der gesamten Zelle Wiederfreisetzung.
    12. Belastung der Probe gesammelt in den Schritten 2.1.10 und 2.1.11 (50 µL) in jedem der Kapillaren. Versiegeln Sie beiden Enden und führen Sie den EPR.
      Hinweis: Immer ein Rohr zu testen oder auch (ohne Zellen) enthält die Sonde im Puffer (gleiche Konzentration = 0,25 mM), unter den gleichen Bedingungen wie die Zellen (gleiche Inkubationszeit und Temperatur) als Kontrolle, da Hintergrundintensität der Sonde Temperatur - wird behandelt und zeitabhängig.
    13. Festlegen der EPR Aufnahmeparameter an folgende: Mikrowellen-Frequenz = 9,65 GHz; Feld = 3432 G; Amplitude Modulation = 2,0 G; Breite zu fegen = 80 G; Mikrowellen-Leistung = 19,9 mW; Gesamtanzahl der Scans = 10; Sweep-Zeit = 12.11 s; und Zeitkonstante = 20,48 ms.
  2. Erkennung von mitochondrialen Superoxid in RAW 264,7 Zellen
    1. Führen Sie Schritte 2.1.1 und 2.1.2 zu RAW 264,7 Samenzellen einen Tag vor dem Experiment.
    2. Entfernen Sie Medien zu und waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL der KHB Puffer.
    3. Fügen Sie 200 µL der KHB mit 100 µM DTPA in jede Vertiefung.
    4. 5.3 µL/Well von 9,5 mM Mito-TEMPO-H Aktien hinzufügen (Endkonzentration = 0,25 mM)
    5. 10 min bei RT inkubieren
    6. Fügen Sie 1 µL/Well von Antimycin A (AA), 5 mM-Stammlösung in Ethanol (Endkonzentration = 25 µM).
    7. 50 min bei 37 ° C in einem CO2 Inkubator inkubieren.
    8. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sofort auf Eis legen.
    9. Sanft die Zellen zu kratzen und Aufschwemmen durch Pipettieren rauf und runter. Halten Sie auf dem Eis.
    10. Laden Sie die Probe in einem Kapillarröhrchen. Versiegeln Sie beiden Enden.
    11. Finden Sie im vorherigen Abschnitt für EPR-Einstellung.
  3. Erkennung von Superoxid in RAW 264,7 Zellen bei 77 K
    1. Legen Sie den Puffer in Schritt 1.1.10 in vorbereiteten PTFE Schlauch 1 2 Zoll in der Länge (3/16" x 1/8" ID OD) gesammelt. Stellen Sie sicher, dass der PTFE-Schlauch ist gerade, so kann es leicht eingefügt und vom Finger entfernt Dewar. Verwenden Sie einen Gummistopfen schließen Sie ein Ende des PTFE-Schläuche, pipette Puffer oder Zellsuspension (100 bis 150 µL) in die PTFE-Schläuche und den Schlauch mit einem zweiten Stopfen verschließen.
    2. Flash-Einfrieren der Probe in flüssigem Stickstoff. Die Probe kann auf einem beschrifteten Kryokonservierung Rohr für die Lagerung bei-80 ° C übertragen oder sofort ausführen.
    3. Füllen Sie den Finger Dewar mit flüssigem Stickstoff und Einsatz der PTFE-Schlauch mit der Probe in die Finger Dewar. Stellen Sie sicher, die Probe ist in den aktiven Raum des Resonators zentriert und EPR bei 77 K.
      Hinweis: Starten Sie den Stickstoff Gasdurchfluss zu Ihrem Spektrometer 15-30 min vor den Messungen und weiter dieser Fluss durch die Messungen um Kondenswasser im Resonator zu verhindern.
    4. EPR Aufnahmeparameter an folgende stellen: Mikrowellen-Frequenz = 9,65 GHz; Feld = 3438 G; Amplitude Modulation = 4,0 G; Sweep Breite = 150 G; Mikrowellen-Leistung = 0.316 mW; Gesamtanzahl der Scans = 10; Sweep-Zeit = 60 s; und Zeitkonstante = 1,28 ms.

(3) EPR-Messungen in Flüssigkeiten

  1. Vollblut
    1. Mäuse (8-12 Wochen alt) mit einer Einzeldosis von intratrachealen Bleomycin (Bleo; 100 µL bei 1 U/mL) aufgelöst in PBS oder PBS allein als zuvor beschriebenen16,17zu behandeln.
    2. Einschläfern Sie Mäuse durch die Gabe von inhalativen Isofluran (1.5-4 %), gefolgt von Entbluten und zervikale Dislokation. Aspirieren Sie Blut durch den rechten Ventrikel in eine Spritze mit Heparin (1000 USP/mL) mit 100 µM DTPA und Übertragung auf einen 1,5 mL-Tube beschichtet.
    3. Fügen Sie in einem separaten 1,5 mL Röhrchen 15 µL PBS mit 100 µM DTPA und 3 µL CMH (10 mM), 132 µL Blut für ein Gesamtvolumen von 150 µL und CMH Endkonzentration von 0,2 mM.
    4. Inkubieren Sie Blut für 10 min bei 37 ° C im Wasserbad.
    5. Nehmen Sie die Rohre aus Wasserbad.
    6. Eine aliquote durch das Blut in einem Kapillarröhrchen laden und ausführen EPR bei RT mit den folgenden Parametern der EPR-Übernahme: Mikrowellen-Frequenz = 9,65 GHz; Feld = 3432 G; Amplitude Modulation = 1,0 G; Breite zu fegen = 80 G; Mikrowellen-Leistung = 19,9 mW; Gesamtanzahl der Scans = 3; Sweep-Zeit = 12.11 s; und Zeitkonstante = 20.48 Frau alternativ Proben kann gefroren wie in beschrieben Schritt 2.3 Flashen für Messungen bei 77 K. EPR Aufnahmeparameter die folgenden sind: Mikrowellen-Frequenz = 9,65 GHz; Feld = 3438 G; Amplitude Modulation = 4,0 G; Sweep Breite = 150 G; Mikrowellen-Leistung = 0.316 mW; Gesamtanzahl der Scans = 2; Sweep-Zeit = 60 s; und Zeitkonstante = 1,28 ms.
  2. Alvéolaire Lavage-Flüssigkeit (BALF)
    1. Nach der Euthanasie (siehe Punkt 3.1.2), BALF sammeln, indem Sie langsam Einträufeln und abheben von 1 mL PBS mit 100 µM DTPA dreimal in eine Spritze mit eine Kanüle in der Luftröhre platziert.
    2. In einer 1,5 mL Tube behandeln Sie 200 µL BALF mit 4 µL CMH (10 mM), eine Endkonzentration von 0,2 mM zu erhalten.
    3. 50 min bei 37 ° C in einem Wasserbad inkubieren Sie BALF.
    4. Rohre aus dem Wasserbad nehmen und auf Eis legen.
    5. Last BALF in einem Kapillarrohr und laufen EPR bei RT mit den gleichen EPR-Einstellungen wie in Schritt 1.1.13 oder Blitz Einfrieren in flüssigem Stickstoff, wie unter Punkt 2.3 beschrieben.
  3. EPR-Messungen im Blut und BALF bei 77 K
    1. Folgen Sie das Protokoll oben, um Blut zu sammeln (Schritte 3.1.1. zu 3.1.4) und BALF (Schritte 3.2.1 bis 3.2.4).
    2. Platz 150 µL des behandelten Blut oder BALF in PTFE Schläuche (1-2 Zoll). Verwenden Sie einen Gummistopfen, schließen Sie ein Ende des PTFE Schläuche vor dem Hinzufügen der Probe und eine weitere Stopper um den Schlauch zu versiegeln.
    3. Flash-Einfrieren der Probe in flüssigem Stickstoff.
    4. Siehe Abschnitt 2.3 Einzelheiten zum Ausführen von EPR in gefrorenen Proben in PTFE-Schlauch mit dem Finger, den Dewar bei 77 K. Run Frozen CMH Blutproben mit in einer Woche behandelt.

(4) EPR-Messungen am Lungengewebe

  1. Flash-gefrorene Lungengewebe
    1. Nach dem Sammeln der BALF in Schritt 3.2.1, die Truhe geöffnet und Lunge gespült mit 10 mL kaltem PBS über den rechten Ventrikel um Blut zu entfernen. Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff des Lungengewebes. Gefrorene Lungengewebe kann bis zu 6 Monate bis zur Verwendung für EPR-Messungen bei-80 ° C aufbewahrt werden.
    2. Stabilisieren Sie das Lungengewebe auf Trockeneis mit Pinzette und schneiden Sie mehrere kleine Stücke (5-15 mg) von Lungengewebe mit einer Single-Kante-Klinge.
    3. Wiegen Sie das Gewebe in einem 1,5 mL Röhrchen, legen Sie das Rohr auf die Waage und tarieren Sie die Waage dann fügen Sie die Gewebe-Stücke und nehmen Sie das Gewicht.
    4. Das Gewebe in der 1,5 mL Tube fügen Sie 196 µL der KHB mit DTPA und 4 µL CMH (0,2 mM) um 200 µL Gesamtvolumen zu erreichen hinzu.
    5. 1 h bei 37 ° C im Wasserbad inkubieren.
    6. Spin-down (für ein paar Sekunden) in einem Microcentrifuge 3.884 x g.
    7. Auf Eis legen und pipette 150 µL des Überstands in der PTFE-Schläuche und frieren für die 77 K-Messungen, wie in Abschnitt 2.3 beschrieben.
      Hinweis: Für diese Methode, die Heterogenität der Verletzung muss berücksichtigt werden. Für Bleomycin-induzierte Lungenschädigung angesichts der Tatsache, dass es ein sehr heterogen Schädigung, empfiehlt es sich, mehrere Gewebe Stücke aus verschiedenen Teilen der Lunge aus jeder Maus zu schneiden. Alternativ kann ein größeres Stück des Gewebes im KHB Puffer mit 100 µM DTPA in einem 1:6-Gewicht-Volumen-Verhältnis (mg/µL), wie unten beschrieben homogenisiert werden.
  2. Frische Lungengewebe in Saccharose Puffer erhalten
    1. Spülen Sie die lavaged Lungen mit kaltem PBS, Blut zu entfernen, wie in Schritt 3.1.2 getan.
    2. Die frischen Lungengewebe in Tris-EDTA Puffer mit 0,25 M Saccharose mit einem 1:6 Lunge/Puffer (mg/µL) Verhältnis mit Dounce-Gewebe-Schleifer mit einem Glas oder PTFE Stößel zu homogenisieren.
    3. KHB, enthält 100 µM DTPA 450 µL fügen Sie 50 µL der Lunge Homogenat hinzu.
    4. Fügen Sie in einem 1,5 mL Rohr (in einem Gesamtvolumen von 100 µL), 98 µL der Lunge Homogenat in KHB 2 µL CMH 10 mM Lager, eine Endkonzentration von 0,2 mM zu erhalten.
    5. 20 min 37 ° C im Wasserbad inkubieren.
    6. Legen Sie die Proben auf Eis und laden Sie sie in ein Kapillarröhrchen. Laufen Sie EPR bei RT (Einstellungen in Schritt 2.1.13 verwendet).
    7. Um den Beitrag der spezifischen Arten und Quellen mit verschiedenen Inhibitoren zu testen, behandeln Sie 88 µL der Lunge Homogenat + /-Inhibitor, Anpassung mit KHB zu einem Endvolumen von 98 µL zu erreichen vor. In diesem Experiment die Inhibitoren enthalten 10 µL der SOD (100 U/mL), 4 µL Deferoxamin (DFO; Endkonzentration = 800 µM), oder 4 µL Diphenyliodonium Chlorid (DIP; Endkonzentration = 100 µM). 20 min bei 37 ° C im Wasserbad inkubieren.
    8. Fügen Sie 2 µL CMH und inkubieren Sie für weitere 20 Minuten bei 37 ° C, gefolgt von EPR-Messungen, wie oben beschrieben. Beinhalten Sie eine einmalige abgestimmte leere Probe mit CMH KHB mit Saccharose-Puffer. Alternativ speichern Sie Aliquote der verbleibenden Lunge Homogenates (Schritt 3.1.2) bei-80 ° C für zukünftige Messungen.
      Hinweis: Das Gesamtvolumen kann je nach Bedarf skaliert werden.
  3. EPR-Messungen am Lungengewebe von Mäusen injiziert mit Spin Sonden in Vivo (bei RT mit Gewebe Zelle)
    1. Bereiten Sie CPH-Stammlösung durch Auflösen von 4,9 mg CPH in 1 mL der gefilterten und sauerstoffarmes 50 mM Phosphatpuffer vor.
    2. Mäuse mit inhalativen Isofluran (1.5-4 %) für 20-30 Sekunden, bis nicht mehr reagiert, bis zu den Zehen Prise zu betäuben. Mit 100 µL der CPH-Spin-Sonde für ein Körpergewicht von 25 g Maus Mäuse über Retroorbital Route zu injizieren (letzte Dosis = 20 mg/kg), und lassen Sie die Sonde zu zirkulieren für 1 h unmittelbar nach Retroorbital Injektion, geben Sie einen Tropfen von 0,5 % Proparacaine HCl, hinaus auf die Augenpartie NT Augenschmerzen und Trockenheit. Überwachen Sie Mäuse für 1 h zu und fahren Sie bis zur Ernte Gewebe.
    3. Das Lungengewebe zu ernten, wie oben beschrieben und Blitz Einfrieren der Lunge.
    4. Schneiden Sie 20-30 mg von tiefgefrorenem Gewebe auf Trockeneis und notieren Sie das exakte Gewicht.
    5. Wischen Sie das Gewebe mit Reinigungstücher, Oberflächenwasser zu absorbieren.
    6. Legen Sie das Gewebe innerhalb des Fensters der Gewebe Zelle (Zubehör erlaubt EPR-Messungen für Gewebeproben) und führen Sie EPR um insgesamt dreht zu bestimmen. Die Daten können als total Spins pro mg Gewebe ausgedrückt werden.

(5) Datenanalyse

  1. Die EPR-Spektren mit SpinFit Modul integriert in die Xenon-Software die Bankoberseite EMXnano EPR-Spektrometers zu simulieren. Bestimmen Sie die Nitroxid-Konzentration durch das SpinCount-Modul. Alternativ eine Kalibrierkurve des eine stabile Nitroxid wie 4-hydroxy-TEMPO oder TEMPOL erfolgen kann, und die Konzentration erhalten Sie durch den Vergleich der Intensität des Signals mit der Probe und Standard.
  2. Verwenden Sie für die bei 77 K gesammelten Daten doppelte Integration gefolgt von SpinCount.

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Ergebnisse

Superoxid-Erkennung mit CMH validiert wurde, mit dem X / XO Superoxid generieren System nachweisen können, dass das Nitroxid (CM.) Signal voll von SOD, gehemmt wurde, während die Katalase keinen Effekt (Abbildung 1A hatte). Total, extrazelluläre Superoxid wurde dann im RAW 264,7 Zellen durch Inkubation der Zellen mit der Zelle durchlässig CMH-Spin-Sonde + / SOD Vorbehandlung bewertet. Die Nitroxid-Konzentration wurde gemessen, in der Zellsuspen...

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Diskussion

Die Bewertung der Produktion freier Radikale in den biologischen Einstellungen ist wichtig im Verständnis Redox geregelt Signalisierung in Gesundheit und Krankheit, aber das Maß dieser Arten ist sehr schwierig wegen der kurzen Halbwertszeit von freien Radikalen Arten und technische Einschränkungen mit häufig verwendeten Methoden. EPR ist eine wertvolle und mächtige Werkzeug in der Redox-Biologie, wie es die einzige eindeutige Methode zur Erkennung von freien Radikalen. In diesem Projekt zeigen wir praktische EPR Met...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der University of Colorado School of Medicine Dean strategische Forschungsinfrastruktur Award, R01 HL086680-09 und 1R35HL139726-01, zu eng und UCD CFReT Fellowship Award (er) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Sandra Eaton und Dr. Gareth Eaton (University of Denver), Dr. Gerald Rosen und Dr. Joseph P. Kao (University of Maryland), und Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) für hilfreiche Diskussionen und Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie und Ivy McDermott (University of Colorado Denver) für den technischen Support.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTech10566-016cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific  BP358-212used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )Fisher Scientific  BP363-500used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
Krebs-Henseleit buffer (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)Sigma Aldrich S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma AldrichP1585-1MGDissolve in DMSO
Antimycin A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGDissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
Heparin Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride Sigma Aldrich43088
Deferoxamin mesylate saltSigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMarkSigma Aldrich708733Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16” OD x 1/8” ID		NORELL1598774ATeflon tubing 
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO TISSUE CELLBruker BioSpin GmbHE7004542

Referenzen

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