JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Спектроскопия парамагнитного резонанса (EPR) является недвусмысленным метод измерения свободных радикалов. Использование селективного спин зондов позволяет для обнаружения свободных радикалов в различных клеточных отсеках. Мы представляем практический и эффективный метод для сбора биологических проб, которые облегчают обработки, хранения и передачи образцы для измерения ОРЭД.

Аннотация

Точным и конкретным обнаружение реактивнооксигенных видов (ров) в разных отсеках, клеточные и тканевые имеет важное значение для изучения редокс регулируемых сигнализации в биологических параметров. Спектроскопия парамагнитного резонанса (EPR) является единственным прямым методом однозначно оценить свободных радикалов. Его преимущество заключается в том, что он обнаруживает физиологических уровнях конкретных видов с высокой точностью, но он требует специализированной технологии, тщательно пробоподготовки и соответствующие элементы управления для обеспечения точной интерпретации данных. Циклические гидроксиламина спин зонды избирательно реагируют с супероксид или другие радикалы для генерации сигнала nitroxide, которые могут быть количественно методом ЭПР спектроскопии. Ячейки проницаемой спин зонды и спин датчики предназначены для накопления быстро в митохондриях позволяют для определения концентрации супероксид в различных клеточных отсеках.

В культивируемых клеток, использование клеток проницаемых 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) наряду с и без предварительной обработки клеток непроницаемый супероксид дисмутаза (SOD) или использование клеток проницаемой PEG-SOD, позволяет дифференциация внеклеточного от цитозольной супероксида. Митохондриальной 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium дихлорид (mito темп-H) позволяет для измерения митохондриальной Рось (преимущественно супероксиддисмутаза).

ЭПР спектроскопии и спин зонды также может применяться к моделям в естественных условиях . Супероксид могут быть обнаружены в внеклеточной жидкости, крови и альвеолярной жидкости, а также ткани, такие как легочной ткани. Несколько методов представлены для обработки и хранения тканей для измерений ОРЭД и доставки внутривенных 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) спина зонд в естественных условиях. Во время измерения могут быть выполнены при комнатной температуре, образцы, полученные in vitro и in vivo модели также могут быть хранятся при температуре-80 ° C и проанализированы по ОРЭД в 77 K. Образцы можно хранить в специализированных трубы стабильной температуре-80 ° C и работать на 77 K чтобы практическая, эффективную и воспроизводимый метод, который облегчает хранение и передача образцов.

Введение

Меры оксидативного стресса и реактивнооксигенных видов имеют важное значение для изучения различных заболеваний во всех органов и систем, обнаружение реактивнооксигенных видов (ров) является сложной задачей из-за короткий период полураспада и высокую реакционную способность. Электронного парамагнитного резонанса (EPR) техника является самым недвусмысленным метод для обнаружения свободных радикалов. Спин зонды имеют преимущества над более часто используемых флуоресцентных зондов. Хотя флуоресцентных зондов, относительно недорогой и простой в использовании и обеспечивают быстрый, чувствительность обнаружения ROS, они имеют серьезные ограничения, обусловленные артефакты сигналов, неспособность рассчитать концентрации рос и общее отсутствие конкретности1 .

Для облегчения использования ОРЭД для биологических исследований, различные датчики были синтезированы спина, что можно измерить широкий спектр видов биологически соответствующих свободных радикалов, а также ро2, pH и редокс государств2,3, 45,,6,7. Также были разработаны спин ловушки для захвата недолго радикалов и формы долгоживущие аддукты, который облегчает обнаружение по ОРЭД8. Оба класса (спин зондов и спин ловушки) имеют свои преимущества и ограничения. Один из часто используемых класс спин зонды являются циклических Гидроксиламины, которые НРА молчаливый и реагировать с недолгим радикалы для формирования стабильной nitroxide. Циклические Гидроксиламины реагируют с супероксид 100 раз быстрее, чем спин ловушки, что позволяет им конкурировать с сотовой антиоксидантов, но они неконкретны и требуют использования надлежащего контроля и ингибиторов для идентификации радикальной видов или источник ответственный за nitroxide сигнала. В то время как спина ловушки экспонат специфичности, с различных спектральных шаблонов в зависимости от захваченных видов, они имеют медленно кинетики супероксид спина треппинга и подвержен биодеградации радикала аддукты. Приложений для треппинга спин были хорошо документированы в биомедицинских исследований9,10,11,12,13.

Целью этого проекта является демонстрация практических методов ОРЭД для проектирования экспериментов и подготовка образцов для обнаружения супероксида с помощью спин зонды в различных клеточных отсеков в пробирке и в различные ткани отсеков в естественных условиях. Несколько рукописей были опубликованы протоколы соответствующих для этих целей, с использованием клеток проницаемой, клетки непроницаемый и митохондриальной целевых спин зонды для различных клеточных отсеков в пробирке и процесс ткани-мишени для анализа в модели мыши 14 , 15. Мы строим на этот орган литературы, проверяя подход к супероксиддисмутаза, используя 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine зонд спин (CMH) в различных клеточных отсеков в пробирке для обеспечения точного измерения измерения, подчеркнув потенциальные технические проблемы, которые могут исказить результаты. Мы также предоставляют методы для выполнения измерений ОРЭД в крови, Бронхоальвеолярный лаваж жидкости и легочной ткани с помощью зонда спин КМЗ. Эти исследования сравнить разные методы для обработки тканей, а также метод придать еще один спин зонд, CPH, мышей до уборки ткани. Наконец мы разрабатываем практический метод для хранения образцов труб из политетрафторэтилена (ПТФЭ) для хранения и передачи образцов до измерения ОРЭД в 77 K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все исследования на животных были утверждены в университете Колорадо Денвер институциональных животное уход и использование Комитета.

1. Подготовка реагентов

  1. Diethylenetriaminepentaacetic кислота (DTPA) фондовой (150 мм)
    1. Добавить 2,95 g DTPA (393.35 г/моль) до 10 мл обессоленной воды.
    2. Чтобы растворить дтпа, добавить 1 M NaOH каплям и довести до pH 7.0.
    3. Довести объем до 50 мл с водой для окончательного DTPA концентрации 150 мм и хранить при 4 ° C.
  2. Натрий-фосфатный буфер (PBS) (50 мм, рН 7,4)
    1. Подготовьте 5 M хлорида натрия (NaCl) (58.44 г/моль; 29.22 г/100 мл).
    2. Подготовка 1 М калия фосфат двухосновной HK2PO4 (174.18 г/моль; 17,42 г/100 мл)
    3. Подготовка 1 М калия фосфат монокальций KH2PO4 (136,1 г/моль; 13.61 г/100 мл). Смешайте 3 мл 5 М NaCl с 4.24 до 1 М калия фосфат двухосновной 0,760 мл 1 М калия монокальций фосфат. Проверьте рН.
    4. Довести объем до 100 мл деионизированной водой.
    5. Хранить при комнатной температуре (RT) для краткосрочного (дней) и на 4 ° C для хранения долгосрочных (недель).
  3. Кребс-Henseleit буфер (Хо), содержащий 100 мкм дтпа
    1. В 50 мл конические пластиковых пробирок мкл 33.3 150 мм DTPA Стоковый раствор.
    2. Довести объем 50 мл с буфером Кребса-Henseleit (Хо).
    3. Подготовьте свежие буфер с дтпа каждый день и держать его на RT.
  4. Буфер Tris-ЭДТА, содержащие сахарозы
    1. Подготовить 0,5 М трис складе: растворить 15.14 g Tris база (121.14 г/моль) в 150 мл деионизованной воды. С помощью HCl, скорректировать рН 7,8 и предавать конечный объем 250 мл.
    2. Распустить 21,4 г сахарозы (342.29 г/моль; конечная концентрация = 0,25 мм) в 150 мл деионизованной воды.
    3. Добавьте 5 мл трис акций сахарозы для достижения 10 mM концентрации выпускных трис.
    4. Добавьте 0,5 мл 0,5 М ЭДТА акций трис сахарозы для достижения 1 mM концентрации выпускных экзаменов.
    5. Проверьте pH и настроить его на 7,4.
    6. Привести в окончательный объем 250 мл деионизированной водой и хранить при 4 ° C.
  5. Говядину эритроцитов Cu/Zn супероксид дисмутаза (SOD) запасов (30 000 ед/мл)
    1. Воссоздания 30 000 U SOD в 1 мл PBS (примерно 5,7 мг, в зависимости от активности дерново лота).
    2. Перемешать, Алиготе и хранить при температуре-20 ° C для краткосрочного (6-12 месяцев) и при температуре-80 ° C для длительного хранения.
  6. SOD рабочего раствора (1000 ед/мл)
    1. Перевести 30 мкл Алиготе акций 30 000 ед/мл SOD в 870 мкл стерильных PBS.
    2. Держите решение на льду и использовать его свежим.
  7. Phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) фондовой (5 мм)
    1. Растворить 1 мг PMA (616.83 г/моль) в 325 мкл ДМСО (конечная концентрация = 5 мм).
    2. Алиготе раствором PMA 5 мм и хранить его при-20 ° C.
  8. PMA рабочего раствора (125 мкм)
    1. Развести 10 мкл Алиготе акций 5 мм PMA в 390 мкл стерильных PBS.
    2. Держите решение на льду и использовать его свежим.
    3. Для контроля транспортных средств на PMA используйте 10 мкл ДМСО в 390 мкл PBS.
  9. Хлорид Diphenyliodonium (DIP) (2,5 мм)
    1. Распустить 3,2 мг DIP (316.57 г/моль) в 4 мл получить запас 2,5 мм.
    2. Подготовить решение и использовать его свежим.
  10. Дефероксамин мезилат соль (ДФО) (20 мм)
    1. Распустить 4,5 мг ДФО (656.79 г / моль) в 340 мкл получить запас 20 мм.
    2. Подготовить решение и использовать его свежим.
  11. Подготовка antimycin (AA) запасов (5 мм)
    1. Распустить 5,4 мг АА (532 г/моль) в 2 мл этанола (конечная концентрация = 5 мм).
    2. Алиготе акций в стеклянных флаконах и хранить при температуре от-20 ° C.
  12. Подготовка спин зонды
    1. Пузырь 50 мм фосфатного буфера содержащих 100 мкм DTPA азотом для 30 мин для удаления растворенного кислорода из буфера.
    2. Удалить спина зонд из морозильной камеры-20 ° C и позволяют контейнеру прийти к RT (10-15 мин).
    3. Весят, 2,4 мг 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CMH) (237,8 г/моль)
    4. КМЗ растворяют в 1 мл венозная фосфатного буфера для конечной концентрации 10 мм.
    5. Весят из 5 мг 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium дихлорид (mito темп-H) (529.1 г/моль).
    6. Растворяются mito темп-H в 1 мл венозная фосфатного буфера для конечной концентрации 9,5 мм.
    7. Весят, 4,9 мг 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CPH) (223.7 г/моль).
    8. CPH растворяют в 1 мл венозная фосфатного буфера для конечной концентрации 22 мм.
    9. Алиготе и хранить при температуре-80 ° C (замораживания оттаивания не рекомендуется).

2. Обнаружение супероксид в пробирке

  1. Обнаружение всего, внеклеточная и внутриклеточных супероксидного в PMA-стимулирует RAW 264.7 клеток в РТ
    1. После правильной асептической техники растопить RAW 264.7 клетки и прохождения их в среде DMEM СМИ с 10% FBS (низкий эндотоксинов бесплатно) и 1% противогрибковое/ампициллин при 37 ° C в CO2 инкубатора.
    2. Семя RAW 264.7 клеток в 1 x 106 клеток/колодец в 6-ну плиты один день до начала лечения.
    3. Осторожно извлеките носитель и вымыть клетки один раз с 1 мл раствора Хо буфера.
    4. Добавить Хо, содержащие 100 мкм DTPA для каждой скважины и лечить в общем объеме 500 мкл следующим текстом:
    5. Для скважин, предварительно обработанных с SOD, добавьте 15 мкл/хорошо SOD рабочего раствора (1000 ед/мл; конечная концентрация SOD = 30 ед/мл) и инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C до того КМЗ и PMA.
    6. Добавить 12,5 мкл/хорошо КМЗ акций 10 мм (конечная концентрация = 0,25 мм).
    7. Добавить 40 мкл/скважины 125 мкм PMA рабочего раствора (конечная концентрация = 10 мкм) или 40 мкл транспортного средства (фондовая 10 мкл ДМСО в 390 мкл PBS).
    8. Инкубируйте 50 минут при 37 ° C в инкубатор CO2 .
    9. Удаление пластины из инкубатора и поместите их непосредственно на льду.
    10. Соберите буфера от каждой скважины в отдельных, 1,5 мл, помечены трубы. Держите на льду во всем.
    11. 100 мкл свежие Хо буфер, содержащий 100 мкм дтпа, осторожно очистите клетки и Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз несколько раз. Держите на льду всей ячейки ресуспендирования.
    12. Загрузка образца собраны в шаги 2.1.10 и 2.1.11 (50 мкл) в каждом из капиллярных трубок. Уплотнение обоих концах и запустите ОРЭД.
      Примечание: Всегда проверить трубку или хорошо (без клетки) содержащий зонд в буфере (же концентрация = 0,25 мм), обработанных на тех же условиях, как клетки (же время инкубации и температура) как элемент управления, так как интенсивность фона датчика температуры - и зависят от времени.
    13. Установите параметры приобретения ОРЭД на следующее: Микроволновая печь частота = 9,65 ГГц; центр поля = 3432 G; амплитуда модуляции = 2,0 Г; развертки ширина = 80 G; микроволновая мощность = 19,9 МВт; Общее количество сканов = 10; развертки время = 12,11 s; и постоянная времени = 20,48 МС.
  2. Обнаружение митохондриальной супероксидного в RAW 264.7 клетки
    1. Выполните шаги 2.1.1 и 2.1.2 семян RAW 264.7 клетки один день до эксперимента.
    2. Извлеките носитель и вымыть клетки один раз с 1 мл раствора Хо буфера.
    3. 200 мкл Хо, содержащие 100 мкм DTPA в каждой скважине.
    4. Добавить 5.3 мкл/хорошо акций mito темп-H 9,5 мм (конечная концентрация = 0,25 мм)
    5. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT.
    6. Добавить 1 мкл/хорошо antimycin (AA), 5 мм раствор в этаноле (конечная концентрация = 25 мкм).
    7. Инкубируйте 50 минут при 37 ° C в инкубатор CO2 .
    8. Удаление пластины из инкубатора и поместите их непосредственно на льду.
    9. Аккуратно очистите клетки и Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз. Держите на льду.
    10. Загрузите образец в капиллярной трубке. Уплотнение обоих концах.
    11. Предыдущем разделе для параметра ОРЭД.
  3. Обнаружение супероксидного в RAW 264.7 клеток на 77 K
    1. Место буфера, собранных на шаге 1.1.10 в заранее подготовленные PTFE 1-2 дюймов в длину (3/16" OD х 1/8" ID) труб. Убедитесь, что трубка PTFE прямо так он может быть легко вставляется и удалены из пальца Дьюара. Позволяет закрыть один конец трубки PTFE, Пипетка буфер или суспензию клеток (100-150 мкл) в трубопровод PTFE и герметизации труб с второй пробкой резиновой пробкой.
    2. Вспышки заморозить образца в жидком азоте. Образец может быть передана помечены криоконсервирования трубка для хранения при температуре-80 ° C или запустить немедленно.
    3. Заполните палец Дьюара с жидким азотом и вставить PTFE Шланги, содержащий образец в палец Дьюара. Убедитесь, что образец сосредоточена в активное пространство резонатора и запустить ОРЭД в 77 K.
      Примечание: Начало потока газа азота для вашего спектрометр 15-30 мин до измерения и продолжать этот поток на протяжении измерений для предотвращения конденсации воды в резонаторе.
    4. Задать параметры приобретения ОРЭД на следующее: Микроволновая печь частота = 9,65 ГГц; центр поля = 3438 G; амплитуда модуляции = 4.0 G; развертки ширина = 150 Г; микроволновая мощность = 0.316 МВт; Общее количество сканов = 10; развертки время = 60 s; и постоянная времени = 1.28 МС.

3. ОРЭД измерения в жидкостях

  1. Цельная кровь
    1. Лечить мышей (8-12 недель) с однократным введением трахею Блеомицин (Bleo; 100 мкл на 1 ед/мл), растворенных в PBS или PBS только как описано16,17.
    2. Усыпить мышей управляющими вдыхаемого изофлюрановая (1,5-4%), следуют обескровливания и шейки матки дислокации. Аспирационная крови через правый желудочек в шприц с гепарином (1000 USP/мл), содержащие 100 мкм DTPA и передачи в 1,5 мл трубку покрытием.
    3. В отдельном 1,5 мл трубку, мкл 15 PBS, содержащие 100 мкм DTPA и 3 мкл КМЗ (10 мм) до 132 мкл крови на общий объем 150 мкл и окончательный КМЗ концентрации 0,2 мм.
    4. Инкубируйте крови в течение 10 минут при 37 ° C на водяной бане.
    5. Удаление трубы из водяной бани.
    6. Возьмите Алиготе, загрузив крови в капиллярной трубке и запустить ОРЭД в RT с параметрами приобретение ОРЭД: Микроволновая печь частота = 9,65 ГГц; центр поля = 3432 G; амплитуда модуляции = 1,0 Г; развертки ширина = 80 G; микроволновая мощность = 19,9 МВт; Общее количество сканов = 3; развертки время = 12,11 s; и постоянная времени = 20,48 г-жа альтернативно, образцы могут быть вспышка замороженные как описано в шаге 2.3 для измерений на 77 K. EPR приобретения параметры являются следующие: Микроволновая печь частота = 9,65 ГГц; центр поля = 3438 G; амплитуда модуляции = 4.0 G; развертки ширина = 150 Г; микроволновая мощность = 0.316 МВт; Общее количество сканов = 2; развертки время = 60 s; и постоянная времени = 1.28 МС.
  2. Бронхоальвеолярный лаваж жидкость (BALF)
    1. После эвтаназии (см. шаг 3.1.2), собирать BALF, медленно воспитание и снятия 1 мл PBS, содержащие 100 мкм DTPA три раза в шприц через канюлю помещены в трахею.
    2. В 1,5 мл трубку лечить 200 мкл BALF с 4 мкл КМЗ (10 мм) для получения конечной концентрации 0,2 мм.
    3. Инкубируйте BALF 50 минут при 37 ° C на водяной бане.
    4. Возьмите трубы из водяной бани и поместите их на льду.
    5. Нагрузки BALF в капиллярную трубку и выполнения ОРЭД на RT с теми же настройками ОРЭД, используемый в шаг 1.1.13, или flash замораживание в жидком азоте, как описано в шаге 2.3.
  3. ЭПР измерения в крови и BALF на 77 K
    1. Следовать протоколу выше для сбора крови (шаги 3.1.1. чтобы 3.1.4) и BALF (шаги 3.2.1 для 3.2.4).
    2. Место 150 мкл лечение крови или BALF в ПТФЭ Шланг (1-2 дюйма). Используйте резиновую пробку, чтобы закрыть один конец трубки PTFE перед добавлением образца и другая пробка для герметизации труб.
    3. Вспышки заморозить образца в жидком азоте.
    4. В разделе 2.3 по ОРЭД в замороженных пробах в PTFE Шланги с помощью пальцев, Дьюар в 77 K. Run замороженные КМЗ относились проб крови с в неделю.

4. ОРЭД измерения на ткани легких

  1. Флэш замороженных легочной ткани
    1. После сбора BALF шаге 3.2.1, открыт груди и легких вспыхнул с 10 мл холодного PBS через правый желудочек для удаления крови. Вспышки заморозить легочной ткани в жидком азоте. Замороженные легочной ткани могут храниться при температуре-80 ° C до 6 месяцев до использования для измерения ОРЭД.
    2. Стабилизировать легочной ткани на сухой лед с помощью пинцета и вырезать несколько кусочков (5-15 мг) из легочной ткани с помощью одно край лезвия.
    3. Весят ткани в 1,5 мл, поместить трубку на шкале и Тара масштаб, затем добавить кусочки ткани и запишите вес.
    4. Ткани в 1,5 мл мкл 196 Хо, содержащих DTPA и 4 мкл КМЗ (0,2 мм) для достижения 200 мкл общий объем.
    5. Инкубируйте 1 час при 37 ° C на водяной бане.
    6. Спин вниз (в течение нескольких секунд) в microcentrifuge на 3 884 x g.
    7. Место на льду и Пипетка 150 мкл супернатант в трубопровод PTFE и заморозить для измерения 77 K, как описано в разделе 2.3.
      Примечание: Для этого метода, неоднородность травмы необходимо рассматривать. Для легких блеомицин индуцированного повреждения учитывая, что он является весьма неоднородной травмы, рекомендуется сократить несколько кусков ткани из разных частей легкого от каждой мыши. Кроме того больший кусок ткани может быть гомогенизированные в Хо буфер, содержащий 100 мкм DTPA в соотношении 1:6 вес объем (мг/мкл), как описано ниже.
  2. Свежий легочной ткани сохранились в буфере сахарозы
    1. Потолочные lavaged легких с холодной PBS для удаления крови, как это сделано в шаге 3.1.2.
    2. Однородный свежие легочной ткани в буфер Tris-ЭДТА, содержащий 0,25 М сахарозы с соотношением 1:6 легких/буфера (мг/мкл) с помощью мясорубки Dounce ткани с стекла или PTFE пестиком.
    3. Добавьте 50 мкл легких огневки 450 мкл Хо, содержащие 100 мкм DTPA.
    4. В 1,5 мл трубки (в общем объеме 100 мкл), 98 мкл легких огневки в Хо добавьте 2 мкл КМЗ акций 10 мм для получения конечной концентрации 0,2 мм.
    5. Проинкубируйте втечение 20 мин 37 ° C на водяной бане.
    6. Поместите образцы на льду и загрузить их в капиллярной трубке. Запустите ОРЭД на RT (параметры, используемые на шаге 2.1.13).
    7. Чтобы проверить вклада конкретных видов и источников с использованием разных ингибиторов, предварительно лечить 88 мкл легких огневки + / ингибитор, регулируя с Хо для достижения окончательный объем 98 мкл. В этом эксперименте, ингибиторы включены 10 мкл SOD (100 ед/мл), 4 мкл дефероксамин (DFO; конечная концентрация = 800 мкм), или 4 мкл diphenyliodonium хлорида (DIP; конечная концентрация = 100 мкм). Проинкубируйте втечение 20 мин при 37 ° C на водяной бане.
    8. 2 мкл КМЗ и инкубировать еще 20 минут при 37 ° C, следуют ОРЭД измерений, как описано выше. Включают единовременные соответствует пустой образец с CMH Хо, содержащие сахарозу буфера. Кроме того Храните аликвоты оставшихся легких гомогенатах (шаг 3.1.2) при температуре-80 ° C для будущих измерений.
      Примечание: Общий объем могут быть расширены при необходимости.
  3. ЭПР измерения на легочной ткани от мышей, вводится с спин зондов в естественных условиях (на RT с использованием клеток ткани)
    1. Подготовьте раствор CPH, растворяя CPH 4,9 мг в 1 мл раствора фосфатного буфера отфильтрованных и венозная 50 мм.
    2. 20-30 секунд, пока не реагирует на палец щепотку анестезировать мышей с вдыхаемого изофлюрановая (1,5-4%). Придать мышей через retroorbital маршрут с 100 мкл CPH спин зонда для веса тела мыши 25 g (окончательный доза = 20 мг/кг) и позволить зонд циркулировать по 1 ч. сразу же после инъекции retroorbital, добавить одну каплю proparacaine 0,5% HCl на область глаз в Преве NT глаз боль и сухости. Контролировать мышей для 1 h и приступить к уборке ткани.
    3. Урожай легочной ткани, как описано выше, и вспышки заморозить легких.
    4. Вырезать 20-30 мг замороженные ткани на сухой лед и запишите точный вес.
    5. Аккуратно протрите ткани с очищающие салфетки поглощать любые поверхностные воды.
    6. Место ткани внутри окна ткани клетки (аксессуар позволяет ОРЭД измерений для образцов ткани) и запустите ОРЭД для определения всего прокруток. Данные может быть выражен как общая спинов на мг ткани.

5. анализ данных

  1. Имитировать спектрам ЭПР, с помощью модуля SpinFit, включены в программное обеспечение ксенон-стендовые EMXnano ЭПР спектрометр. Определите концентрацию nitroxide модулем SpinCount. Кроме того градуировочному стабильной nitroxide например 4-гидрокси темп или TEMPOL могут быть сделаны, и концентрации могут быть получены путем сравнения интенсивности сигнала с образцом и стандарт.
  2. Для данных, собранных на 77 K используйте двойной интеграции, следуют SpinCount.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Супероксид обнаружения с помощью КМЗ была проверена с помощью X / XO супероксид генерации системы, позволяющие продемонстрировать, что сигнал nitroxide (см..) полностью тормозится SOD, в то время как каталазы имел никакого эффекта (рис. 1A). Всего, внеклеточ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Оценка производство свободных радикалов в биологических параметров имеет важное значение в понимании редокс регулируется сигнализации в здоровье и болезни, но мера этих видов является очень сложным из-за короткий период полураспада видов свободных радикалов и технического ограниче?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана университета Колорадо школы медицины Дин стратегической инфраструктуры исследований премии, R01 HL086680-09 и 1R35HL139726-01, E.N.G. и UCD CFReT стипендия, (он). Авторы благодарят д-р Сандра Eaton и доктор Гарет Eaton (Денверский университет), д-р Джеральд Розен и д-р Джозеф P. Као (Университет штата Мэриленд) и доктор Суджатха Венкатараман (Университет штата Колорадо Денвер) для полезной дискуссии и Джоан Maltzahn, Эшли Trumpie и Ivy Макдермотт (Университет штата Колорадо Денвер) для технической поддержки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTech10566-016cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific  BP358-212used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )Fisher Scientific  BP363-500used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
Krebs-Henseleit buffer (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)Sigma Aldrich S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma AldrichP1585-1MGDissolve in DMSO
Antimycin A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGDissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
Heparin Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride Sigma Aldrich43088
Deferoxamin mesylate saltSigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMarkSigma Aldrich708733Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16” OD x 1/8” ID		NORELL1598774ATeflon tubing 
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO TISSUE CELLBruker BioSpin GmbHE7004542

Ссылки

  1. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  2. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  3. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
  4. Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
  5. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  6. Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
  7. Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
  8. Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
  9. Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
  10. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
  11. Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
  12. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
  13. Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
  14. Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
  15. Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
  16. Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
  17. Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
  18. Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
  19. Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
  20. Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143CPHmito Hnitroxide

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены