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Résumé

Par spectroscopie de résonance paramagnétique (EPR) est une méthode non équivoque pour mesurer des radicaux libres. L’utilisation de sondes de spin sélectif permet une détection des radicaux libres dans les différents compartiments cellulaires. Nous présentons une méthode pratique et efficace pour collecter des échantillons biologiques qui facilitent le traitement, stockage et transfert des échantillons pour des mesures de l’EPR.

Résumé

La détection précise et spécifique des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les différents compartiments cellulaires et tissulaires est essentielle à l’étude de l’oxydo-réduction réglementées de signalisation dans les milieux biologiques. Spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) est la méthode directe d’évaluer sans ambiguïté les radicaux libres. Son avantage est qu’il détecte des niveaux physiologiques des espèces spécifiques avec une grande spécificité, mais elle requiert la technologie spécialisée, préparation minutieuse et des contrôles appropriés afin d’assurer une interprétation précise des données. Sondes de spin hydroxylamine cyclique réagissent sélectivement avec superoxyde ou autres radicaux pour générer un signal nitroxyde pouvant être quantifiées par spectroscopie RPE. Sondes de spin perméable à la cellule et sondes de spin conçus pour accumuler rapidement dans les mitochondries permettent la détermination de la concentration de superoxyde dans les différents compartiments cellulaires.

Dans les cellules cultivées, l’utilisation de 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine cellulaires perméables (CMH) avec et sans prétraitement de cellule-imperméable superoxyde dismutase (SOD) ou de cellules perméables PEG-SOD, permet la différenciation des extracellulaire de superoxyde cytosolique. Le 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitochondrial] pipéridinium dichlorure (mito-TEMPO-H) permet de mesurer des ROS mitochondriale (principalement le superoxyde).

Sondes de spin et spectroscopie RPE peuvent également être appliquées en vivo modèles. Superoxyde peut être détectée en fluides extracellulaires comme le sang et le liquide alvéolaire, ainsi que les tissus tels que les tissus pulmonaires. Plusieurs méthodes sont présentées pour traiter et stocker les tissus pour les mesures de l’EPR et livrer de sonde 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine en intraveineuse (CPH) spin in vivo. Tandis que les mesures peuvent être réalisées à température ambiante, échantillons obtenus à partir des modèles in vitro et in vivo peuvent également être stockées à-80 ° C et analysés par EPR à 77 K. Les échantillons peuvent être stockés dans l’écurie de tubes spécialisés à-80 ° C et exécutées à 77 K pour permettre une pratique, efficace et une méthode reproductible qui facilite le stockage et transfert des échantillons.

Introduction

Alors que les mesures du stress oxydatif et les espèces réactives de l’oxygène sont importants pour l’étude de diverses maladies à travers tous les systèmes organiques, la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est difficile en raison d’une courte demi-vie et forte réactivité. Une technique de résonance paramagnétique (RPE) des électrons est la méthode la plus claire pour la détection des radicaux libres. Sondes de spin ont des avantages sur des sondes fluorescentes plus couramment utilisés. Bien que des sondes fluorescentes sont relativement peu coûteux et facile à utiliser et offrant une détection rapide et sensible de ROS, ils ont de sérieuses limites à cause des signaux artéfactuelle, une incapacité à calculer les concentrations de ROS et un manque général de spécificité1 .

Pour faciliter l’utilisation de l’EPR pour des études biologiques, une variété de spin sondes ont été synthétisés qui permet de mesurer une gamme d’espèces radicalaires biologiquement pertinente ainsi que pO2, pH et redox indique2,3, 4,5,6,7. Pièges à spin ont également été développés pour capter les radicaux éphémères et forme longue durée de vie des adduits, qui facilite la détection par RPE8. Les deux classes (sondes de spin et pièges à spin) ont des avantages et des limites. Une classe couramment utilisée des sondes de spin sont des hydroxylamines cycliques, qui sont des EPR en silence et réagissent avec des radicaux pour former un nitroxyde stable de courte durée. Hydroxylamines cycliques réagissent avec le superoxyde 100 fois plus vite que les pièges à spin, ce qui leur permet de rivaliser avec les antioxydants cellulaires, mais ils manquent de spécificité et nécessitent l’utilisation de contrôles appropriés et les inhibiteurs d’identifier les espèces radicalaires ou source responsable pour le signal nitroxyde. Tandis que spin intercepte la spécificité de la pièce, avec distinctes spectrale que modèles selon l’espèce pris au piège, ils ont cinétique lente pour superoxyde spin piégeage et sont sujette à la biodégradation du radical adduits. Demandes de piégeage de spin ont été bien étudiées dans la recherche biomédicale9,10,11,12,13.

L’objectif de ce projet est de démontrer les méthodes pratiques d’EPR pour concevoir des expériences et préparation des échantillons pour détecter des superoxyde à l’aide de spin des sondes dans les différents compartiments cellulaires in vitro et dans des tissus différents compartiments in vivo. Plusieurs manuscrits ont publié les protocoles pertinents à atteindre ces objectifs, en utilisant des sondes de spin ciblées perméable à la cellule et cellule-imperméable mitochondriale au tissu de cible différents compartiments cellulaires in vitro et processus pour analyse dans des modèles murins 14 , 15. nous inspirer de ce corpus de textes en validant une approche pour mesurer la superoxyde en utilisant une sonde de spin (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine dans différents compartiments cellulaires in vitro afin d’assurer la précision mesures, mettant en évidence les éventuels problèmes techniques qui peuvent biaiser les résultats. Nous fournissons également des méthodes permettant d’effectuer des mesures de l’EPR dans le sang, le liquide de lavage broncho-alvéolaire et du tissu pulmonaire à l’aide de la sonde de spin CMH. Ces études comparent différentes méthodes pour traiter les tissus ainsi que pour présenter une méthode pour injecter une autre sonde de spin, CPH, à des souris avant la récolte de tissus. Enfin, nous développons une méthode pratique pour stocker les échantillons dans un tube de polytétrafluoroéthylène (PTFE) pour permettre le stockage et le transfert des échantillons avant mesures EPR à 77 K.

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Protocole

Toutes les études animales ont été approuvés par l’Université du Colorado Denver institutionnels et animalier Comité d’urbanisme.

1. préparation des réactifs

  1. Stock d’acide (DTPA) Diéthylènetriaminepentaacétique (150 mM)
    1. Ajouter 2,95 g de DTPA (393.35 g/mol) à 10 mL d’eau désionisée.
    2. Pour dissoudre le DTPA, 1 NaOH M, ajouter quelques gouttes et porter à un pH de 7.0.
    3. Porter le volume à 50 mL avec de l’eau pour une concentration finale de DTPA de 150 mM et conserver à 4 ° C.
  2. Saline de tampon phosphate (PBS) (50 mM, pH 7,4)
    1. Préparer 5 M de chlorure de sodium (NaCl) (58.44 g/mol ; 29,22 g/100 mL).
    2. Préparer 1 M de potassium phosphate dibasique HK2PO4 (174.18 g/mol ; 17,42 g/100 mL)
    3. Préparer 1 M de potassium phosphate monobasique KH2PO4 (136,1 g/mol ; 13,61 g/100 mL). Mélanger 3 mL de 5 M de NaCl avec 4,24 de 1 M de phosphate de potassium dibasique et 0,760 mL de 1 M potassium phosphate monobasique. Vérifier le pH.
    4. Porter le volume à 100 mL avec de l’eau désionisée.
    5. Stocker à température ambiante (RT) de courte durée (jours) et à 4 ° C pour le stockage à long terme (semaines).
  3. Tampon de Krebs-Henseleit (KHB) contenant 100 µM DTPA
    1. Dans le tube à centrifuger conique 50 mL, ajouter 33,3 µL de solution mère de DTPA 150 mM.
    2. Porter à un volume de 50 mL avec un tampon Krebs-Henseleit (KHB).
    3. Préparation du tampon frais de DTPA chaque jour et gardez-le à température ambiante.
  4. Tampon tris-EDTA contenant du saccharose
    1. Préparation 0,5 M Tris stock : dissoudre 15,14 g de base Tris (121,14 g/mol) dans 150 mL d’eau désionisée. À l’aide de HCl, ajuster le pH à 7,8 et porter à un volume de 250 mL.
    2. Dissoudre 21,4 g de saccharose (342.29 g/mol ; concentration finale = 0,25 mM) dans 150 mL d’eau désionisée.
    3. Ajouter 5 mL de Tris stock de saccharose pour obtenir une concentration finale de Tris 10 mM.
    4. Ajouter 0,5 mL de stock EDTA 0,5 M à Tris-saccharose pour obtenir une concentration finale de 1 mM.
    5. Vérifier le pH et l’ajuster à 7,4.
    6. Porter à un volume de 250 mL avec de l’eau désionisée et conserver à 4 ° C.
  5. Érythrocytaires bovines stock de Cu/Zn superoxyde dismutase (SOD) (30 000 U/mL)
    1. Reconstituer les 30 000 U de SOD dans 1 mL de PBS (environ 5,7 mg, selon l’activité de beaucoup de gazon).
    2. Bien mélanger, partie aliquote et conserver à-20 ° C à court terme (6 à 12 mois) et à-80 ° C pour le stockage à long terme.
  6. Solution de travail SOD (1000 U/mL)
    1. Transférer une quantité de 30 µL de 30 000 actions SOD U/mL dans un 870 µL de PBS stérile.
    2. Conserver la solution sur la glace et l’utiliser fraîche.
  7. Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) stock (5 mM)
    1. Dissoudre 1 mg de PMA (616.83 g/mol) à 325 µL de DMSO (concentration finale = 5 mM).
    2. Aliquote une solution PMA de 5 mM et conserver à-20 ° C.
  8. Solution de travail de PMA (125 µM)
    1. Diluer une aliquote de 10 µL de stock PMA 5 mM en 390 µL de PBS stérile.
    2. Conserver la solution sur la glace et l’utiliser fraîche.
    3. Pour un contrôle de véhicule pour la PMA, utiliser 10 µL de DMSO pour 390 µL de PBS.
  9. Chlorure de Diphényliodonium (DIP) (2,5 mM)
    1. Dissoudre 3,2 mg de plonger (316.57 g/mol) dans 4 mL pour obtenir un stock de 2,5 mM.
    2. Préparer la solution et l’utiliser fraîche.
  10. Déféroxamine mésylate sel (MPO) (20 mM)
    1. Dissoudre 4,5 mg du MPO (656,79 g / mol) à 340 µL d’obtenir un stock de 20 mM.
    2. Préparer la solution et l’utiliser fraîche.
  11. Préparation de l’antimycine stock A (AA) (5 mM)
    1. Dissoudre 5,4 mg de AA (532 g/mol) dans 2 mL d’éthanol (concentration finale = 5 mM).
    2. Aliquote du stock en flacons en verre et conserver à-20 ° C.
  12. Préparation des sondes de spin
    1. Tampon de phosphate 50 mM bulle contenant 100 µM DTPA avec de l’azote pendant 30 min enlever l’oxygène dissous dans la zone tampon.
    2. Retirer la sonde de spin du congélateur-20 ° C et laisser le conteneur à venir jusqu'à la RT (10-15 min).
    3. Peser à 2,4 mg de 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CMH) (237,8 g/mol)
    4. Dissoudre le CMH dans 1 mL de tampon phosphate désoxygéné pour une concentration finale de 10 mM.
    5. Peser 5 mg de dichlorure de 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium (mito-TEMPO-H) (529.1 g/mol).
    6. Dissoudre le mito-TEMPO-H dans 1 mL de tampon phosphate désoxygéné pour une concentration finale de 9,5 mM.
    7. Peser de 4,9 mg de 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine· HCl (CPH) (223,7 g/mol).
    8. Dissoudre le CPH dans 1 mL de tampon phosphate désoxygéné pour une concentration finale de 22 mM.
    9. Aliquote et conserver à-80 ° C (gel-dégel n’est pas recommandé).

2. détection de superoxyde in vitro

  1. Détection du superoxyde total extracellulaire et intracellulaire en stimulée par la PMA 264.7 cellules crues à ta
    1. Suivant une technique aseptique appropriée, décongeler 264.7 cellules crues et leur passage dans le milieu DMEM avec 10 % BF (basse exempte d’endotoxine) et 1 % antimycosiques/ampicilline à 37 ° C dans un incubateur de CO2 .
    2. Semences 264.7 cellules crues à 1 x 106 cellules/puits dans les plaques 6 puits un jour avant le traitement.
    3. Retirez média doucement et laver les cellules une fois avec 1 mL de tampon KHB.
    4. Ajouter KHB contenant 100 µM DTPA à chaque puits et traiter un volume total de 500 µL par ce qui suit :
    5. Pour les puits prétraités avec SOD, ajouter 15 µL/puits de la solution de travail SOD (1000 U/mL ; concentration finale de SOD = 30 U/mL) et incuber pendant 10 min à 37 ° C avant l’addition du CMH et PMA.
    6. Ajouter 12,5 µL/puits de stock CMH 10 mM (concentration finale = 0,25 mM).
    7. Ajouter 40 µL/puits de la solution de travail de PMA 125 µM (concentration finale = 10 µM) ou 40 µL véhicule (stock de 10 µL de DMSO pour 390 µL de PBS).
    8. Incuber pendant 50 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 .
    9. Enlever les plaques de l’incubateur et placez-les immédiatement sur la glace.
    10. Recueillir des tampon de chaque puits en séparé, 1,5 mL étiqueté tubes. Rester sur la glace tout au long.
    11. Ajouter 100 µL de tampon KHB frais contenant 100 µM DTPA, délicatement racler les cellules et remettre en suspension en pipettant également monter et descendre plusieurs fois. Rester sur la glace tout au long de la remise en suspension cellulaire.
    12. Charge l’échantillon collectées lors des étapes 2.1.10 et 2.1.11 (50 µL) dans chacun des tubes capillaires. Sceller les extrémités, puis exécutez l’EPR.
      NOTE : Toujours un tube d’essai ou bien (sans cellules) contenant la sonde dans un tampon (même concentration = 0,25 mM), traités dans les mêmes conditions que les cellules (même temps de l’incubation et la température) comme témoin, puisque l’intensité du fond de la sonde est température - et dépendant du temps.
    13. Définir les paramètres d’acquisition EPR à ce qui suit : micro-ondes fréquence = 9,65 GHz ; champ centre = 3432 G ; modulation d’amplitude = 2,0 G ; largeur de balayage = 80 G ; four à micro-ondes puissance = 19,9 mW ; nombre total d’analyses = 10 ; temps de balayage = 12.11 s ; et la constante de temps = 20,48 ms.
  2. Détection du superoxyde mitochondriale dans les 264.7 cellules crues
    1. Suivez les étapes 2.1.1 et 2.1.2 pour semences 264.7 cellules crues un jour avant l’expérience.
    2. Retirer et laver les cellules une fois avec 1 mL de tampon KHB.
    3. Ajouter 200 µL de KHB contenant 100 µM DTPA à chaque puits.
    4. Ajouter 5,3 µL/puits de stock mito-TEMPO-H 9,5 mM (concentration finale = 0,25 mM)
    5. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
    6. Ajouter 1 µL/puits de l’antimycine A (AA), la solution mère de 5 mM dans l’éthanol (concentration finale = 25 µM).
    7. Incuber pendant 50 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 .
    8. Enlever les plaques de l’incubateur et placez-les immédiatement sur la glace.
    9. Doucement, gratter les cellules et remettre en suspension par pipetage de haut en bas. Rester sur la glace.
    10. Charger l’échantillon dans un tube capillaire. Sceller les extrémités.
    11. Consultez la section précédente pour REGL.
  3. Détection de superoxyde dans les 264.7 cellules crues à 77 K
    1. Placer le tampon recueilli à l’étape 1.1.10 en PTFE préparé à l’avance 1-2 pouces de longueur (3/16" OD x 1/8" ID) de tubes. Assurez-vous que le tube PTFE est droit, donc il peut être facilement inséré et retiré du doigt dewar. Utilisez un bouchon en caoutchouc pour fermer une des extrémités du tube PTFE, pipeter le tampon ou la suspension de cellules (100 à 150 µL) dans le tube PTFE et scelle le tube avec un bouchon en deuxième.
    2. Flash gel l’échantillon dans l’azote liquide. L’échantillon peut être transférée dans un tube marqué cryoconservation pour stockage à-80 ° C ou exécuter immédiatement.
    3. Remplir le doigt dewar azote liquide et insérez le tube PTFE contenant l’échantillon dans le doigt dewar. Assurez-vous que l’échantillon est centré dans l’espace actif du résonateur et exécutez EPR à 77 K.
      NOTE : Démarrer le flux de gaz d’azote à votre spectromètre de 15-30 min avant les mesures et continuer ce flux ensemble des mesures pour empêcher la condensation d’eau dans la caisse de résonance.
    4. Définir les paramètres d’acquisition EPR à ce qui suit : micro-ondes fréquence = 9,65 GHz ; champ centre = 3438 G ; modulation d’amplitude = 4,0 G ; largeur de balayage = 150 G ; four à micro-ondes puissance = 0,316 mW ; nombre total d’analyses = 10 ; temps de balayage = 60 s ; et la constante de temps = 1,28 ms.

3. EPR mesures dans les fluides

  1. Sang total
    1. Traiter des souris (âgés de 8 à 12 semaines) avec une dose unique de bléomycine intratrachéale (Bleo ; 100 µL à 1 U/mL) dissoute dans PBS ou PBS seul comme précédemment décrit16,17.
    2. Euthanasier souris par l’administration par inhalation isoflurane (1,5 à 4 %) suivi d’une exsanguination et dislocation cervicale. Aspirer une seringue enduite avec de l’héparine (1000 USP/mL) contenant 100 µM DTPA et transférez dans un tube de 1,5 mL de sang dans le ventricule droit.
    3. Dans un tube séparé de 1,5 mL, ajouter 15 µL de PBS contenant 100 µM DTPA et 3 µL du CMH (10 mM) à 132 µL de sang pour un volume total de 150 µL et concentration finale de CMH de 0,2 mM.
    4. Incuber le sang pendant 10 min à 37 ° C dans un bain d’eau.
    5. Retirer les tubes du bain-marie.
    6. Prélever une partie aliquote de sang dans un tube capillaire de chargement et d’exécuter des EPR à RT avec les paramètres d’acquisition EPR suivants : fréquence de micro-onde = 9,65 GHz ; champ centre = 3432 G ; modulation d’amplitude = 1,0 G ; largeur de balayage = 80 G ; four à micro-ondes puissance = 19,9 mW ; nombre total d’analyses = 3 ; temps de balayage = 12.11 s ; et la constante de temps = Mme 20,48 alternativement, les échantillons peuvent être flash congelés comme décrit dans étape 2.3 aux mensurations à 77 paramètres d’acquisition de K. EPR sont les suivantes : fréquence de micro-onde = 9,65 GHz ; champ centre = 3438 G ; modulation d’amplitude = 4,0 G ; largeur de balayage = 150 G ; four à micro-ondes puissance = 0,316 mW ; nombre total d’analyses = 2 ; temps de balayage = 60 s ; et la constante de temps = 1,28 ms.
  2. Lavage bronchoalvéolaire (LBA)
    1. Après l’euthanasie (voir étape 3.1.2), recueillir BALF par instiller lentement et le retrait de 1 mL de PBS contenant 100 µM DTPA trois fois dans une seringue via une canule placée dans la trachée.
    2. Dans un tube de 1,5 mL, traiter 200 µL de BALF 4 µl de CMH (10 mM) pour obtenir une concentration finale de 0,2 mM.
    3. Incuber BALF pendant 50 min à 37 ° C dans un bain d’eau.
    4. Prenez les tubes hors de l’eau du bain et placez-les sur la glace.
    5. Charge BALF dans un tube capillaire et exécution EPR à RT avec les mêmes paramètres EPR tel qu’utilisé dans l’étape 1.1.13 ou flash congélation dans l’azote liquide comme indiqué au point 2.3.
  3. Mesures de l’EPR dans le sang et BALF à 77 K
    1. Suivre le protocole ci-dessus pour recueillir le sang (étapes 3.1.1. à 3.1.4) et BALF (étapes 3.2.1 à 3.2.4).
    2. Place 150 µL de sang traité ou BALF en PTFE, tube (1 à 2 po). Utilisez un bouchon en caoutchouc pour fermer une extrémité du tube PTFE avant d’ajouter l’échantillon et un autre bouchon pour sceller le tuyau.
    3. Flash gel l’échantillon dans l’azote liquide.
    4. Voir la section 2.3 pour plus d’informations sur l’exécution des EPR dans les échantillons congelés en tuyau de PTFE à l’aide du doigt que Dewar à 77 K. exécuter surgelés CMH traités avec des échantillons de sang dans une semaine.

4. EPR mesures sur des tissus pulmonaires

  1. Flash du tissu pulmonaire congelés
    1. Après avoir recueilli la BALF dans étape 3.2.1, le coffre est ouvert et poumons rincée avec 10 mL de PBS froid via le ventricule droit pour enlever le sang. Flash gel le tissu pulmonaire dans l’azote liquide. Les tissus pulmonaires congelés peuvent être stockées à-80 ° C pendant 6 mois jusqu'à l’utilisation pour les mesures de l’EPR.
    2. Stabiliser le tissu pulmonaire sur la glace sèche avec des pincettes et couper de multiples petits morceaux (5-15 mg) du tissu pulmonaire à l’aide d’une lame simple.
    3. Peser le tissu dans un tube de 1,5 mL, placer le tube sur la balance et tarer la balance, puis ajoutez les morceaux de tissu et enregistrer le poids.
    4. Dans le tissu dans le tube de 1,5 mL, ajouter 196 µL de KHB contenant DTPA et 4 µL de CMH (0,2 mM) pour obtenir un volume total de 200 µL.
    5. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans un bain d’eau.
    6. Tournez vers le bas (pendant quelques secondes) dans une micro-centrifugeuse à 3 884 x g.
    7. Placer sur la glace et distribuer 150 µL de surnageant dans le tube PTFE et congeler pour les mesures de 77 K, tel que décrit à la section 2.3.
      Remarque : Pour cette méthode, l’hétérogénéité de la lésion doit être examinée. Pour une lésion pulmonaire induite par la bléomycine, étant donné que c’est une blessure très hétérogène, il est recommandé de couper plusieurs morceaux de tissus de différentes parties du poumon de chacune des souris. Sinon, un gros morceau de tissu peut être homogénéisé dans un tampon KHB contenant 100 µM DTPA à un rapport de poids-volume 1:6 (mg/µL), tel que décrit ci-dessous.
  2. Tissu de poumon frais conservé dans un tampon saccharose
    1. Rincez les poumons lavés avec du PBS froid pour enlever le sang fait à l’étape 3.1.2.
    2. Homogénéiser le tissu de poumon frais dans un tampon Tris-EDTA contenant 0,25 M de saccharose avec un ratio de poumon/tampon (mg/µL) de 1:6 en utilisant Dounce meuleuse de tissu avec un verre ou un pilon PTFE.
    3. Ajouter 50 µL de l’homogénat de poumon à 450 µL de KHB contenant 100 µM DTPA.
    4. Dans un tube de 1,5 mL (dans un volume total de 100 µL), à 98 µL d’homogénat de poumon dans KHB, ajoutez 2 µL de CMH du stock de 10 mM pour obtenir une concentration finale de 0,2 mM.
    5. Incuber pendant 20 min 37 ° C dans un bain d’eau.
    6. Placer les échantillons sur la glace et de les charger dans un tube capillaire. Exécution d’EPR à ta (paramètres utilisés à l’étape 2.1.13).
    7. Pour tester la contribution des espèces spécifiques et sources à l’aide de différents inhibiteurs, pré-traiter µL 88 d’homogénat de poumon +/-inhibiteur, ajustant avec KHB afin d’obtenir un volume final de 98 µL. Dans cette expérience, les inhibiteurs étaient 10 µL de SOD (100 U/mL), 4 µL de déféroxamine (MPO ; concentration finale = 800 µM), ou 4 µL du chlorure de diphényliodonium (DIP ; concentration finale = 100 µM). Incuber pendant 20 min à 37 ° C dans un bain d’eau.
    8. Ajouter 2 µL de CMH et incuber pendant 20 min à 37 ° C, suivie par des mesures de l’EPR comme décrit ci-dessus. Inclure un échantillon témoin apparié ponctuel avec CMH KHB contenant un tampon saccharose. Vous pouvez également stocker aliquotes des homogénats poumon restant (étape 3.1.2) à-80 ° C pour les mesures futures.
      Remarque : Le volume total peut être adapté selon les besoins.
  3. Mesures de l’EPR sur les tissus pulmonaires chez des souris injectées avec spin sondes in vivo (à la droite à l’aide de tissus de cellules)
    1. Préparer la solution mère de CPH en dissolvant 4,9 mg de CPH dans 1 mL de tampon phosphate filtré et désoxygéné 50 mM.
    2. Anesthésier souris avec inhalation isoflurane (1,5 à 4 %) pendant 20-30 secondes jusqu'à ce qu’il ne répond pas à l’orteil pincée. Injecter 100 µL de sonde essorage CPH pour un poids de 25 g souris souris via retroorbital route (dernière dose = 20 mg/kg) et permettre à la sonde faire circuler pendant 1 h. immédiatement après l’injection de retroorbital, ajouter une goutte de proparacaïne 0,5 % HCl sur le contour des yeux à la preve douleur oculaire NT et la sécheresse. Contrôler la souris pendant 1 h et procéder à la récolte de tissus.
    3. Récolter le tissu pulmonaire comme décrit ci-dessus et flash geler les poumons.
    4. Couper 20-30 mg de tissus congelés sur la glace sèche et consignez le poids exact.
    5. Essuyez délicatement le tissu avec lingettes pour absorber toute l’eau de surface de nettoyage.
    6. Placez le tissu intérieur de la fenêtre de la cellule de tissu (un accessoire permet des mesures d’EPR pour des échantillons de tissu) et exécutez EPR pour déterminer le total tourne. Les données peuvent être exprimées comme totales tours par mg de tissu.

5. analyse

  1. Simuler les spectres RPE à l’aide du module SpinFit intégré dans le logiciel de xénon du spectromètre EMXnano EPR-paillasse. Déterminer la concentration de nitroxyde par le module SpinCount. Sinon, on peut faire une courbe d’étalonnage d’un nitroxyde stable comme le 4-hydroxy-TEMPO ou TEMPOL, et la concentration peut être obtenue en comparant l’intensité du signal avec l’échantillon et de la norme.
  2. Pour les données collectées à 77 K, utiliser l’intégration double suivie de SpinCount.

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Résultats

Détection de superoxyde par CMH a été validée à l’aide de le X / superoxyde XO centrale système de démontrer que le signal nitroxyde (CM.) est totalement inhibé par SOD, tandis que catalase n’a eu aucun effet (Figure 1 a). Le superoxyde total, extracellulaire était alors évaluée en 264.7 cellules crues par incubation des cellules avec la sonde de spin CMH perméable à la cellule +/-un prétraitement SOD. La concentration de nitroxyd...

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Discussion

L’évaluation de la production de radicaux libres dans les milieux biologiques est importante redox compréhension réglementés de signalisation de santé et la maladie, mais la mesure de ces espèces est très difficile en raison de la courte demi-vie des radicaux libres et technique limites avec les méthodes couramment utilisées. RPE est un outil précieux et puissant en biologie de l’oxydo-réduction, comme c’est la méthode seulement sans ambiguïté pour la détection des radicaux libres. Dans ce projet, no...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la faculté de l’Université du Colorado de médecine Dean award de l’Infrastructure de recherche stratégique, R01 HL086680-09 et 1R35HL139726-01, à la bourse E.N.G. et UCD CFReT (HE). Les auteurs remercient Dr Sandra Eaton et Dr. Gareth Eaton (Université de Denver), Dr Gerald Rosen et Dr. Joseph P. Kao (Université du Maryland) et Dr Sujatha Venkataraman (Université du Colorado, Denver) pour des discussions utiles et Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie et Ivy McDermott (Université du Colorado, Denver) pour le support technique.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLifeTech10566-016cell culture media
Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)Sigma AldrichD6518-5G
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific  BP358-212used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate dibasic (HK2PO4 )Fisher Scientific  BP363-500used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
potassium phosphate monobasic (KH2PO4 )Sigma AldrichP-5379used to prepare 50 mM phosphate saline buffer  according to Sigma aldrish  
Krebs-Henseleit buffer (KHB) (Alfa Aesar, Hill)J67820
Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD)Sigma Aldrich S7571-30KU
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma AldrichP1585-1MGDissolve in DMSO
Antimycin A (AA)Sigma AldrichA8674-25MGDissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots)
1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH)Enzo Life SciencesALX-430-117-M050
1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH)Enzo Life SciencesALX-430-078-M250
1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H)Enzo Life SciencesALX-430-171-M005
1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H)Enzo Life SciencesALX-430-131-M250
Heparin Sagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10
Diphenyliodonium chloride Sigma Aldrich43088
Deferoxamin mesylate saltSigma AldrichD9533-1G
CritosealLeica39215003
BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMarkSigma Aldrich708733Capillaries
PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING
3/16” OD x 1/8” ID		NORELL1598774ATeflon tubing 
SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES  FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SRNORELL94987
EMXnano Bench-Top EPR spectrometer Bruker BioSpin GmbHE7004002
EMX NANO TISSUE CELLBruker BioSpin GmbHE7004542

Références

  1. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  2. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  3. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
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  6. Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
  7. Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. Biochemistry. 54 (47), 6973-6982 (2015).
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  10. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
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