JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים הליך לגידול זנים שונים של Magnetospirillum שני סוגים שונים של מדיה צמיחה. Magnetospirillum gryphiswaldense זן MSR-1 גדל נוזלי והן O2 ריכוז הדרגתי מדיה מוצק למחצה ואילו זן מ magneticum השגריר-1 וזן magnetotacticum מ MS-1 גדלים במדיום נוזלי.

Abstract

Magnetotactic חיידקים הם גראם שליליים, תאי, בעיקר הימית אאוקריוטים בכל מקום בבתי גידול מים מתוקים ומי ים. הם מאופיינים על ידי היכולת שלהם biomineralize magnetosomes, אשר מגנטי בגודל ננומטר גבישי מגנטיט (Fe3או4) או greigite (Fe3S4) מוקף קרום bilayer השומנים, בהישג שלהם הציטופלסמה. עבור רוב החיידקים magnetotactic הידוע, magnetosomes הם התאספו כבול בתוך הציטופלסמה, ובכך היוועצות עם מומנט דיפול מגנטי קבוע על התאים ולגרום להם ליישר פסיבי עם שדות מגנטיים חיצוניים. בגלל תכונות אלה ספציפיים, חיידקים magnetotactic יש פוטנציאל גדול עבור יישומים מסחריים וטיפול רפואי. עם זאת, רוב המינים הינם microaerophilic וכוללים O2 ריכוז דרישות ספציפיות, הפיכתם קשה יותר לגדול באופן שגרתי יותר חיידקים רבים אחרים כגון Escherichia coli. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורט לגידול שלושה זני חיידקים magnetotactic, שייכות הסוג Magnetospirillumלמדה נרחב ביותר. שיטות אלה מאפשרות שליטה מדויקת של2 O הריכוז נעשה זמין של חיידקים, על מנת להבטיח כי הם גדלים בדרך כלל, לסנתז magnetosomes. גידול חיידקים magnetotactic ללימודי באמצעות הליכים אלה אינו מחייב את experimentalist להיות מומחה במיקרוביולוגיה. שיטות כלליות שהוצגו במאמר זה עשוי לשמש גם כדי לבודד את התרבות חיידקים magnetotactic אחרים, אם כי סביר להניח כי ההרכב הכימי של מדיה צמיחה תצטרך להיות שונה.

Introduction

Magnetotactic חיידקים (MTB) מייצגים מגוון רחב של אאוקריוטים גראם שליליים בכל מקום גידול ימיים מים מתוקים ומי ים1. חיידקים אלה חולקים את היכולת לייצר מגנטי קריסטלים העשויים מגנטיט (Fe3או4) או greigite (Fe3S4), אשר ברוב המקרים לצרפן שרשראות בתוך התאים. זה מוטיב מבנית מסוימת היא בשל נוכחותם של מספר חלבונים ספציפיים מתנהג כאחד בציטופלסמה של החיידקים ועל הרקמות שמקיפות השומנים כל קריסטל2. כל קריסטל בודדים, שלה שלפוחית ממברנה שמסביב נקרא magnetosome, הוא החל בגודל של 30 עד 50 ננומטר מינים Magnetospirillum 3. בשל הסידור שרשרת של magnetosomes, חיידקים אלו בעלי רגע דיפול מגנטי קבוע שגורם להם ליישר פסיבי עם שדה מגנטי חיצוני. לכן, חיידקים אלו באופן פעיל לשחות לאורך קווי שדה מגנטי, מתנהג כמו מיקרו-מצפנים מרסיסים ככל הנראה כדי יותר לאתר ביעילות את התנאים הכי נוחים (למשל., ריכוז2 O) לצמיחה.

תכונה מעניינת של MTB היא יכולתם לווסת את הכימיה והן את קריסטלוגרפיה של גבישים magnetosome שלהם. רוב זני לייצר גבישים טוהר גבוהה יחסית של מגנטיט או greigite, למרות כמה biomineralize שני מינרלים4. בכל המקרים, החיידקים מסוגלים לשלוט במדויק הגודל והצורה של גבישים מחשבים בודדת מגנטי שלהם. זה מסביר מדוע כמות גדולה של מחקר שנערך לפתח הבנה טובה יותר של כיצד MTB לבצע תהליך זה ביומינרליזציה. הבנת תהליך זה עלול לאפשר את החוקרים חייט-לעשות nanocrystals מגנטי עבור יישומים רבים מסחרי ורפואי.

מכשול משמעותי מחקר מקיף על שחרור מהיר למוט אוכף כבר הקושי של גידול אותם במעבדה. רוב המינים, כולל הזנים להשתמש בעבודה זו, הן obligately microaerophilic כאשר גדל עם O2 כמו מקבל אלקטרון מסוף. זה מסביר מדוע חיידקים אלו מצויים לרוב באיזור המעבר בין תנאי oxic ואנאוקסיים (הממשק oxic-אנאוקסיים, OAI). זה מראה בבירור שיש MTB מדויק O2 ריכוז דרישות אשר מן הסתם צריך להילקח בחשבון כאשר להמציא צמיחה מדיה עבור אורגניזמים אלה. יתר על כן, קיים מגוון רחב של MTB מרמז כי זנים שונים צריך סוגים שונים של מעברי צבע כימיים וחומרים מזינים כדי להשיג גדילה אופטימלית.

בעבודה זו, אנו מתארים את שיטות הגוברת של MTB נרחב ביותר למד: Magnetospirillum magneticum (זן השגריר-1), מ magnetotacticum (MS-1) ו- gryphiswaldense מ' (MSR-1). המינים הללו phylogenetically שייך למחלקה Alphaproteobacteria ב שלקרוא פרוטאובקטריה , לוליינית ב מורפולוגיה הינם בעלי שוטון קוטבי בקצה אחד של התא. אנו מספקים את הפרוטוקולים לגידול זן MSR-1 נוזל והן O2 ריכוז הדרגתי מוצק למחצה מדיה, מבוסס על מתכונים שפורסמו בעבר בינוני5,6. אנו מציגים גם פרוטוקול מפורט לגידול זנים השגריר-1 ו- MS-1 במגנטי Spirillum צמיחה בינוני (MGSM) שונה7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. התקנה של התחנה2 N

הערה: לבחור הקוטר הפנימי של הצנרת כך הוא עשוי להיות מקושר למיכל הדלק בשכנוע המינימלי כך הצילינדר של מזרק פלסטיק 1 מ"ל בחוזקה מתאים לצנרת הזה. איור של N מלאה2 ההמתה תחנת מסופק באיור1.

  1. בבטחה להתקין מיכל גז N2 ליד ספסל שעליו יש מספיק מקום כדי להגדיר את התחנה2 N (באורך של 50 ס מ).
  2. להתחבר אל הטנק חתיכה של אבובים מספיק זמן כדי להגיע לאזור בה יבנו את התחנה. במידת הצורך, החל קלטות טפלון על הפלט של הטנק כדי למנוע דליפה כלשהי.
  3. כדי לבנות תחנת מסוגל מבעבע חמישה בקבוקים של מדיום בו זמנית, לחתוך ארבע חתיכות של צינורות של 5 ס מ אורך.
  4. להרכיב את החלקים של אבובים בקו עם 3 חלקים שלושה בצורת T אביזרי פלסטיק. חבר קצה אחד של קו זה היצירה של אבובים על הפלט של הטנקים2 N דרך הולם במיוחד בצורת T. להוסיף על המרפק 90° הולם בקצה השני.
  5. שימוש בקלטת כדי לצרף את המבנה מוט מתכת אופקי להציב כ 30 ס מ מעל הספסל.
  6. לחבר חמש חתיכות של אבובים (כ 20 ס מ אורך) כדי התוצרים חינם של ואביזרים המותקן 1.4 שלב.
  7. להסיר את בוכנות חמש מזרקים מפלסטיק 1.0 מ"ל. ולחתוך בסוף אלה מזרקים גדולים יותר (כלומר., אל מול צד המחט), לשמור רק את החלק בוגר. למלא מזרקים אלה עם כותנה, לא חזק מדי.
  8. הכנס המזרקים את החלקים האנכיים הארוכים 20 ס מ של אבובים ולהשתמש סבון ומים כדי להבטיח שיש זליגת כאשר N2 זורם.
  9. הסר את הפקקים של 25 גרם 5 מחטים (0.5 מ"מ x 25 מ"מ), להכניס מחטים אלה החלקים 10 ס"מ צינור דק. ודא כי המחטים בחוזקה להשתלב הצנרת.
    זהירות: יש סיכון של דקירה במהלך שלב זה. לעשות את זה לאט ובזהירות.
  10. לצרף את המחטים מוכנים ב 1.9 שלב? המזרקים של התחנה2 N. להבטיח כי N2 הוא זורם דרך כל חמש שורות ולשמור את התחנה על המתנה.

2. צמיחה הכנה בינונית

הערה: זה אפשרי להתאים את כמות בינונית מוכן, כמוסבר בשלבים 2.1.2, 2.2.2 ו 2.3.8. כמות מים וכימיקלים משמש רק צריך להיות מותאם באופן פרופורציונלי. התפקיד של כל הרכיבים בינונית המתואר משלים טבלה 1.

  1. הכנה של מדיום הגידול נוזלי MSR-1
    1. להכין פתרון ציטראט ferric 10 מ מ על-ידי הוספת 0.245 גר' ציטראט ferric 100 מ של מים מזוקקים יונים. מחממים ומערבבים עד התמוססות, עד צהוב לכתום בהיר מתקבל פתרון. אוטוקלב הפתרון באמצעות תקן מחזור (לפחות 15 דקות חשיפה ב 121 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן אחסן פתרון מניות זה בטמפרטורת החדר בחושך.
      הערה: לבטל את הפתרון ציטראט ferric כאשר התמיסה הופך להיות ברור.
    2. ב גביע המכיל 1 ליטר של מים מזוקקים יונים, להוסיף את הפעולות הבאות לפי הסדר תוך כדי ערבוב: 1.0 מ"ל של המינרל מעקב תוספת פתרון, 0.1 גר'2פו ח'4, 0.15 גרם MgSO4.7 H2O 2.38 גר' HEPES, g 0.34 של ננו3 , 0.1 גר' שמרים לחלץ, 3.0 גרם סויה שעועית peptone, mL 4.35 של אשלגן לקטאט (60% w/w פתרון), 5 מ ל 10 מ מ Fe(III) ציטראט פתרון מניות.
      הערה: להתאים את הכמויות באופן פרופורציונלי אם כמות קטנה יותר של מדיום הגידול יש צורך. עבור תחנה2 N מסוגל מבעבע חמישה בקבוקים באותו זמן, כמו האחד נבנה בשלב 1 של פרוטוקול זה, להכין 300 מ"ל של מדיום.
      התראה: לעקוב אחר מינרל, מניות ציטראט Fe(III) הפתרונות צריכים להישמר סטרילי. כדי למנוע זיהום, להשתמש סטרילי טכניקה סטנדרטית כאשר משתמשים בהם (להבה, פתוח צמרות של בקבוקי באמצעות מבער בונזן) ומשתמשים פיפטה סטרילי טיפים dispensing. חנות הפתרון מינרלים במקרר-4 מעלות צלזיוס.
    3. לאחר התוספת של כל הכימיקלים, להתאים את רמת ה-pH אל 7.0 עם פתרון NaOH 1 מ'. לוותר על המדיום המוכנים באופן טרי לתוך בקבוקים סרום 125 מ. יוצקים 60 מיליליטר במדיום כל בקבוק.
    4. הבועה N2 לתוך האמצעי למשך 30 דקות להסיר את O מומס2, באמצעות לאורך צינור קטן מחובר לתחנת2 N המתוארת בשלב 1. המקום פקק גומי בוטיל על כל בקבוק, משאיר פתח קטן כדי לאפשר את הגז עודף לצאת את הבקבוק.
      התראה: קצף שעלולים להיווצר תוך בעבוע עם N2. להתאים את זרימת הגז בהתאם כדי למנוע ייצור קצף.
    5. Crimp חותם כל בקבוק הודות את פקק מוכן של אלומיניום. החותם אלומיניום מבטיחה כי הבקבוק נשאר אטום בשאר בפרוטוקול.
    6. נתק את המחטים לאורך צינור דק מתחנת2 N ולהחליף אותם עם מחטים נקיות (1 אינטש, ≤ 23 גרם). להתאים את השסתומים של הטנקים2 N כך עדין זרימה רצופה של גז היציאות למיכל (כ- 50 מ לדקה).
      הערה: מחטים גדול יותר 23 גרם ניתן להשאיר חורים unsealable קבע הפקק.
    7. הכנס לאחת המחטים מחובר למיכל2 N לתוך בקבוק בינוני, דרך פקק הגומי. מיד להוסיף עוד מחט נקי לתוך הבקבוק זהה. חזור על שלב זה עבור הבקבוקים אחרים ולתת זרימה2 N במשך כ 30 דקות להחליף את האוויר הבקבוקים על ידי N2.
    8. נתק בקבוק אחד מתחנת2 N על-ידי הסרת את המחט המתאימים. לחכות כמה שניות עד הלחץ בבקבוק של מדיום מקטין הלחץ האטמוספרי, הסר את המחט השניה. חזור על שלב זה עבור כל הבקבוקים הנותרים.
      התראה: כדי למנוע להזין מחדש את הבקבוקים של מדיום הגידול לאחר שלב 2.1.4 O2 , בצע שלבים 2.1.4 - 2.1.8 תגובה על רצף מהיר. אם אין אפשרות לחבר כל הבקבוקים לתחנה2 N באותו זמן, להמשיך עם צעדים 2.1.4-2.1.8 על הסט הראשון של בקבוקים, לאחר מכן חזור על שלבים אלה עבור הבקבוקים הנותרים.
    9. אוטוקלב הבקבוקים. . תן להם מגניב עד בטמפרטורת החדר למשך הלילה ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר לאחר מכן.
  2. הכנה של מדיום הגידול נוזלי השגריר-1 ו- MS-1
    1. להכין פתרון quinate ferric 10 מ מ. תחילה להמיס g 0.19 חומצה הקואינית 100 מ של מים מזוקקים יונים ולאחר מכן להוסיף 0.27 g של FeCl3.6H2O. מערבבים כדי להמיס, עד מתקבל פתרון וברור, אדום כהה. אוטוקלב הפתרון באמצעות מחזור רגיל (לפחות 15 דקות חשיפה ב 121 מעלות צלזיוס).
      הערה: אחסן את הפתרון quinate ferric בטמפרטורת החדר בחושך כפתרון מניות סטרילי. למחוק את הפתרון כאשר התמיסה הופך להיות ברור.
    2. ב גביע המכיל 1 ליטר של מים מזוקקים יונים, להוסיף את הפעולות הבאות לפי הסדר תוך כדי ערבוב: מל 10.0 של הפתרון תוספת ויטמין, mL 5.0 של הפתרון תוספת מינרלים מעקב, 0.68 גר'2פו ח'4, 0.848 גר' נתרן succinate dibasic hexahydrate, 0.575 גר' נתרן di tartrate וגופרית והרכבו 0.083g של סודיום אצטט trihydrate, mL 0.45 של 0.1% Resazurin מימית, g 0.17 של ננו3, 0.04 גרם של חומצה אסקורבית ו- 3.0 מ ל 10 מ מ פתרון מניות quinate Fe(III).
      הערה: להתאים את הכמויות באופן פרופורציונלי אם כמות קטנה יותר של מדיום הגידול יש צורך. עבור תחנה2 N מסוגל מבעבע חמישה בקבוקים באותו זמן, כמו האחד נבנה בשלב 1 של פרוטוקול זה, להכין 300 מ"ל של מדיום.
      התראה: ויטמין, מינרל מעקב ופתרונות Fe(III) quinate מניות צריך להישמר סטרילי. כדי למנוע זיהום, השתמש סטנדרטי סטרילי טכניקה ועצות פיפטה סטרילי כאשר מחלק. לאחסן את הפתרונות מינרלים וויטמינים במקרר-4 מעלות צלזיוס.
    3. לאחר התוספת של כל הכימיקלים, להתאים את רמת ה-pH ל 6.75 באמצעות פתרון NaOH 1 מ'.
    4. עיין 2.1.3-2.1.9 צעדים למשך שארית בפרוטוקול.
  3. הכנה של מדיום הגידול מוצק למחצה MSR-1
    1. להכין pH פתרון 7.0 מאגר פוספט 0.5 M על ידי המסת g 3.362 של K-2-HPO-4 ו- g 4.178 של ח'2PO4 ב 100 מ של מים מזוקקים יונים. לבדוק אם ה-pH 7.0 ולהתאים את ה-pH מעט עם ח'2PO4 או NaOH במידת הצורך. אחסן את הפתרון בבקבוק זכוכית אטום (עדיף מפלסטיק כדי למנוע חילופי חמצן).
    2. הכן 100 מ של פתרון הידרוכלורית מ' 0.02 נקודות. הוספת 0.2 גר' FeCl2.4H2O הפתרון ומערבבים כדי להמיס על מנת לקבל פתרון כלוריד ברזל 10 מ מ. אחסן את הפתרון בחושך בבקבוק זכוכית אטום.
    3. להכין פתרון סודיום ביקרבונט 0.8 מ' על ידי המסת 6.72 גר' NaHCO3 ב- 100 מ של מים מזוקקים יונים. אחסן את הפתרון בבקבוק זכוכית אטום.
    4. אוטוקלב הפתרונות שהוכנו בשלבים 2.2.1 - 2.2.3 באמצעות מחזור רגיל (לפחות 15 דקות חשיפה ב 121 מעלות צלזיוס). לאחסן אותם פתרונות מניות סטרילי בחושך.
    5. ב גביע המכיל 1 ליטר של מים מזוקקים יונים, להוסיף את הפעולות הבאות לפי הסדר תוך כדי ערבוב: 5 מ של הפתרון תוספת מינרלים מעקב, 0.2 מ"ל של 1% פתרון resazurin מימית, 0.4 g של NaCl, 0.3 g של NH4קלרנית, 0.1 גר' MgSO4.7H2 O, 0.05 גרם CaCl2.2H2O, 1 g של נתרן succinate, 0.5 g של סודיום אצטט, 0.2 גר' שמרים לחלץ ו- 1.6 גר' אגר.
    6. מכסים את. הספל עם רדיד אלומיניום ו אוטוקלב הפתרון המוכן בשלב 2.3.5.
    7. לפני הסיום של מחזור החיטוי, להכין טרי a 4% L-cysteine· HCl· H2O הפתרון על ידי המסת 0.8 גר' L-cysteine· HCl· H2O ב- 20 מ ל מים מזוקקים יונים. לנטרל את פתרון ה-pH 7.0 עם פתרון NaOH 5 מ'.
      שים לב: חשוב כי הפתרון ציסטאין מוכן טרי כדי למנוע חמצון של ציסטאין. חנות הפתרון מינרלים במקרר-4 מעלות צלזיוס.
    8. לאחר autoclaving, ומצננים בינונית עד 50 – 60 מעלות צלזיוס, להביא את. הספל תחת להבת מבער בונזן. להסיר את רדיד האלומיניום, להוסיף במהירות את הפעולות הבאות לפי סדר תוך ערבוב בעדינות: 0.5 מ של הפתרון ויטמין, 2.8 מ"ל של פוספט סטרילי מאגר מניות הפתרון, 3 מ"ל של פתרון מניות סטרילי ברזל כלוריד, mL 1.8 של המניה סטרילי סודיום ביקרבונט פתרון ו- 10 מ"ל של ציסטאין מחוטא-מסנן פתרון.
      הערה: להתאים את הכמויות באופן פרופורציונלי אם כמות קטנה יותר של מדיום הגידול יש צורך. זה בדרך כלל נוח להכין מנה של 120 מ של מדיום.
      שים לב: כל הפתרונות חייבת להישאר סטרילי לשימוש עתידי. בצע את שלב 2.3.8 סטרילי טכניקה סטנדרטית באמצעות פיפטה סטרילי טיפים כאשר מחלק.
    9. לאחר התוספת של כל הכימיקלים, להעביר המדיום חמים לתוך 16 mL בורג סטרילי-קאפ הנגייט צינורות. להעביר 12 מ של המדיום לתוך כל שפופרת ויסגור את הצינורות.
      התראה: כדי למנוע זיהום, בצע את שלב 2.3.9 תחת להבת מבער בונזן. לבצע אותו לפני אגר מתמצק, אמנם המדיום ב 40 מעלות צלזיוס ומעלה.
    10. יוצאים הצינורות ללא הפרעה במשך כמה שעות עד אגר עפור והופך OAI לכאורה, להתממש כמו ורוד לממשק השקופה, כ 1 עד 3 ס מ מתחת לפני השטח של המדיום.
      הערה: צריך המדיום לאט לפנות השקופה בצינור. כמות הזמן הנדרשת עבור המעבר הזה הוא משתנה ותלוי כמות O2 בתחילה מומס המדיום.

3. חיסון של MTB

הערה: התרבויות של זנים השגריר-1, MS-1 ו- MSR-1 ניתן להשיג מסחרית (טבלה של חומרים).

שים לב: בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים, תחת להבת מבער בונזן.

  1. חיסון של זנים MSR-1, השגריר-1 ו- MS-1 בינוני נוזלי
    1. חותם בקבוק הסרום ריק 125 מ עם פקק גומי בוטיל וסיל crimp אלומיניום. להוסיף שתי מחטים דרך הפקק הבקבוק, וחבר מזרק מוכן כמו שלב 1.7 לאחד מהם. לחבר את המזרק גליל של O2 באמצעות אותו סוג של צינורות כמו זו ששימשה תחנת2 N.
    2. תנו O2 לזרום דרך הבקבוק למשך כ- 30 דקות, על מנת להבטיח כי כל האוויר בבקבוק מוחלף על ידי O2. הסר את שני מחטים, המאפשרות הלחץ קלה הבקבוק ולאחר מכן אוטוקלב. לאפשר את הבקבוק להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
      הערה: כדי לחסוך זמן, יש לבצע שלבים 3.1.1 ו- 3.1.2 תוך כדי הכנה בינונית אוטוקלב הבקבוק יחד עם המדיום או הפתרונות מניות.
    3. לעקר את החלק העליון של פקקים של הבקבוק בינוני טריים וגם את הבקבוק2 O על ידי החלת כמה טיפות של 70% אתנול פתרון מעליהם הכנסתם להבת מבער בונזן.
    4. באמצעות מחט סטרילית מחט, לחלץ 1 מ"ל של O2 מהבקבוק2 O ולהעביר אותו לתוך הבקבוק בינוני טריים. ודא כי המחט בחוזקה מתאים על המזרק במהלך שלב זה כדי למנוע אוויר במזרק.
    5. אם משתמש את inoculum מתרבות אחרת גדל בבקבוק זכוכית, לעקר את פקקים של הבקבוק בינוני טריים וגם את הבקבוק תרבות מבוגר על-ידי החלת כמה טיפות של 70% אתנול פתרון מעליהם הכנסתם להבת מבער בונזן. אם משתמש את inoculum של שפופרת של תרבות קפוא, עזוב את זה חם תלוי בטמפרטורת החדר עם הצינור אטום תחת להבת מבער בונזן.
    6. אם משתמש את inoculum מתרבות אחרת גדל בבקבוק זכוכית, לחסן 1 מ"ל של תרבות מבוגר אל המדיום טריים. אם משתמש את inoculate של מניה קפוא, לחסן רק 0.1 מ"ל כדי לדלל את גליצרול או דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) המשמשים בתהליך ההקפאה. בשני המקרים, השתמש מחט סטרילית ומזרק סטרילי.
    7. דגירה התרבות ב 32 ° C, לחסן אותו לתוך בינוני טריים לאחר 4-7 ימים.
  2. חיסון של MSR-1 בינוני הדרגתיות מוצק למחצה של2 O
    1. ודא כי הצינור של מדיום חדש מציג OAI מוגדרים היטב, ותתבטא מאת ורוד לממשק השקופה.
    2. Inoculum בא מתרבות אחרת O2 ריכוז הדרגתי מוצק למחצה, לקצור את החיידקים מאת pipetting 50 µL של התרבות עם טיפ פיפטה סטרילי המוטלות על הלהקה שהוקמה על ידי החיידקים. לאט לאט לחסן חיידקים אלו-OAI במדיום טריים (ממשק חסר צבע/ורוד), הימנעות מטריד את הממשק. Inoculum בא מתרבות קפוא, המשך באותו אופן עם 100 µL של inoculum במקום.
    3. לאטום את צינור ולתת שהחיידקים לגדול בין 25 ° C 30 ° C. העברת לתוך בינוני טריים באמצעות ההליך אותו לפני הלהקה של חיידקים מגיע לפני השטח של המדיום.

4. תצפית של חיידקים

  1. לחטא את הפקק של הבקבוק תרבות על-ידי החלת הפתרון אתנול 70% מעליו והעברתה דרך להבת מבער בונזן. בינוני מוצק למחצה, לפתוח את הצינור מתחת להבת מבער בונזן. להשתמש מחט סטרילית ומזרק סטרילי כדי לחלץ את החיידקים.
  2. שימוש התליה ירידה שיטה8 כדי להבטיח כי החיידקים מגנטי וגם תאי.
    הערה: שלב ניגודיות מיקרוסקופ נותן תוצאות מעולות אך אינה חובה. הגדלה ועד 10 X 60 X מתאימים.
  3. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) כדי לבחון את מבנה התא, magnetosomes את פירוט8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הכנה מוצלחת של התקשורת גדילה יכול להידרש כדלקמן. בסופו של התהליך, נקה פתרונות (כלומר., ללא כל המשקע) צריכה להתקבל (זה נכון גם לגבי התקשורת נוזלי וגם O2 הדרגתי מוצק למחצה המדיום). תמונה הצגת ההיבט הצפוי של MSR-1 בינוני נוזלי לפני חיסון ניתן לראות באיור 2a

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

O2 ריכוז דרישות ספציפיות של MTB להפוך אותם לא טריוויאלי לגדול במעבדה. צעד. מפתח של הפרוטוקול עבור המדיום הנוזלי היא הסרת הראשונית של כל O2 של המדיום כדי לשלוט הריכוז הסופי על-ידי הוספת אמצעי מובהק של O2, ממש לפני חיסון. הוכח כי MSR-1 גדל בתנאים כמעט במלואה אירובי, עם זאת, המגנטיות ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ריצ'רד ב' פרנקל לעזרתו עם שחרור מהיר למוט אוכף תרבויות, אדם עמ' היצ'קוק, ז'ו Xiaohui על תמיכתם תוך הגדרת התרבויות MTB באוניברסיטת מקמסטר, וריד מרשה הכשרה וגישה אל המתקן מיקרוסקופ אלקטרונים (אוניברסיטת מקמסטר, הפקולטה למדעי הבריאות). עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC), בנו הקרן הלאומית למדע.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AMB-1American Type Culture Collection (ATCC)ATCC 700264
MS-1ATCCATCC 31632 
MSR-1Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)DSM 6361
Ferric citrateSigma-AldrichF3388-250G
Trace mineral supplementATCCMD-TMS
KH2PO4EMDPX1565-1
MgSO4.7 H2OEMDMX0070-1
HEPESBioShop Canada IncHEP001.250
NaNO3Sigma-AldrichS5506-250G
Yeast extractFischer scientificDF210929
PeptoneFischer scientificDF0436-17-5
Potassium L-lactate solution (60%)Sigma-Aldrich60389-250ML-F
D-(-)-Quinic acidSigma-Aldrich138622
FeCl3.6H2OFischer scientificI88-100
Vitamin supplementATCCMD-VS
Sodium succinate hexahydrateFischer scientificS413-500
Sodium L-tartrate dibasic dihydrateSigma-Aldrich228729-100G
Sodium acetate trihydrateEMDSX0255-1
ResazurinDifco0704-13
Ascorbic acidSigma-AldrichA4544-25G
K2HPO4Caledon6620-1-65
FeCl2 .4H2OSigma-Aldrich44939-250G
Sodium bicarbonateEMDSX0320-1
NaClCaledon7560-1
NH4ClEMD1011450500
CaCl2.2 H2OEMD1023820500
Agar ABio Basic Canada IncFB0010
L-cysteine.HCl.H2OSigma-AldrichC7880-100G
1.0 mL syringesFischer scientificB309659
25G  x 1 needlesBD305125
125 mL serum bottlesWheaton223748
20 mm aluminum sealsWheaton224223-01
20mm E-Z CrimperWheatonW225303
Butyl-rubber stoppersBellco Glass, Inc.2048-11800
Hungate tubesChemglass (VWR)CLS-4208-01
Septum stopper, 13mm, HungateBellco Glass, Inc.2047-11600
Glass culture TubesCorning (VWR)9826-16X
Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagentSigma-AldrichH1758-100ML11.6 - 12 N

References

  1. Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
  2. Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621(2016).
  3. Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
  4. Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
  5. Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
  6. Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
  7. Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
  8. Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  9. Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344(2013).
  10. Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
  11. Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
  12. Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064(2013).
  13. Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203(2016).
  14. Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
  15. Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110(2006).
  16. Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
  17. Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
  18. Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193(2014).
  19. Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
  20. Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440(2012).
  21. Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
  22. Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140MagnetotacticmagnetotaxisMagnetospirillum1MS 1MSR 1MagnetosomesOxic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved