属磁性の走磁性細菌の成長: MSR 1、AMB 1 MS 1 株

要約

成長媒体の 2 種類の磁性のいくつかの株の成長のための手順を紹介します。磁性 gryphiswaldense MSR 1 株で栽培されて液体と O₂濃度勾配半固体メディアM. 細菌系統 AMB 1 およびM. magnetotacticum系統 MS 1 を液体培地で育つ。

要約

走磁性細菌は、淡水と海洋の生息地におけるユビキタス グラム陰性、運動性、主に水生微生物です。彼らは biomineralize マグネトソーム磁気ナノ結晶マグネタイト (Fe₃O₄) または greigite (Fe₃S₄) の内脂質二重膜に囲まれたである彼らの能力によって特徴付けられる、細胞質。ほとんど知られている走磁性細菌の細胞質、細胞に永久磁気双極子モーメントを授与し、受動的外部磁気フィールドに合わせてそれらを引き起こしている中鎖マグネトソームをまとめます。走磁性細菌ではこれらの特定の機能のため商業・医療用大きな可能性があります。ただし、ほとんどの種は微好気、大腸菌など他の多くの細菌よりも日常的に成長するが難しくして特定の O₂濃度要件をあります。走磁性バクテリア属磁性に属するすべての最も広く研究の系統の 3 つを成長のための詳しいプロトコルをご紹介します。これらのメソッド、彼らは正常に成長し、合成マグネトソームを確保するために、細菌に可能 O₂濃度の正確な制御を可能にします。これらのプロシージャを使用して研究のための走磁性細菌の成長する微生物学の専門家である験者を必要はありません。この記事で紹介した一般的な方法も使えますを分離し、他の走磁性細菌文化成長媒体の化学組成を変更する必要がありそうだが。

概要

走磁性細菌 (MTB) は、グラム陰性菌原淡水と海洋の水生生息地¹のユビキタスの広い範囲を表します。これらの細菌は、マグネタイト (Fe₃O₄) ・ greigite (Fe₃S₄)、鎖の細胞の中に組み立てられるほとんどの場合は、磁気の結晶を生産する能力を共有します。この特定の構造モチーフは、機能を持ち、各結晶²を取り囲む脂質膜に細菌の細胞質にいくつかの特定の蛋白質の存在によるものです。それぞれの個々 の水晶とその周囲の膜小胞、磁性細菌と呼ばれる約 30 から 50 までサイズで及ぶ磁性種³nm。マグネトソームのチェーンの配置、ためこれらの細菌は、外部磁場と受動的に整列させる永久磁気双極子モーメントを所有しています。したがって、これらの細菌は、積極的に演技以上におそらく自走マイクロ コンパスは効果的に最も有利な条件を見つけて、磁力線に沿って泳ぐ (e.g。、O₂濃度) の成長のため。

MTB の興味深いプロパティ化学・磁性細菌結晶の結晶構造解析の両方を調節できることです。ほとんどの系統はいくつか磁鉄鉱の greigite、比較的高純度結晶を生成 biomineralize 鉱物⁴両。すべてのケースでは、細菌は単一磁結晶の形状とサイズを正確に制御することができます。これは MTB がこのバイオミネラリゼーション プロセスを実行する方法のよりよい理解を開発する研究の偉大な量を実施する理由について説明します。このプロセスを理解する多くの商業および医療アプリケーションの磁気ナノ結晶をオーダーメイドするため研究が可能です。

MTB の広範な研究に相当な障害物は、実験室でそれらの成長の難しさをされています。この作業で使用する系統を含む、ほとんどの種は、偏性微好気 O₂ターミナル電子受容体として成長してきたときです。これは、これらの細菌が好気、無酸素条件 (酸素-無酸素インターフェイス、OAI) 間の移行帯で最もよく見られる理由について説明します。これは明らかに MTB が明らかにこれらの有機体のための成長媒体を工夫を考慮する必要がある正確なの O₂濃度要件であることを示しています。また、MTB の優れた既存の多様性は、異なる系統が異なるタイプの化学勾配と最適な成長を達成するために栄養素を必要がありますを意味します。

この作品で最も広く研究の MTB の 3 つの成長のための方法を述べる: , 一般講演(AMB 1 株)、 m. magnetotacticum (MS-1)、 m. gryphiswaldense (MSR-1)。これらの種系統プロテオ バクテリア門でAlphaproteobacteriaクラスに属する形態でヘリカル、セルの各端の極鞭毛を持っています。液体の O₂濃度勾配半固体媒体、以前に発行された中レシピ^5,6に基づく MSR 1 株の成長のためのプロトコルを提供します。変更された磁気スピリルム成長媒体 (MGSM)⁷の AMB 1 および MS 1 系統を成長のための詳しいプロトコルを提案する.

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プロトコル

1. N₂局設置

注: は、最小リークでガソリン タンクに接続することができます、1 mL プラスチック注射器のシリンダーがこのチューブにしっかりと収まるように、チューブの内径を選択します。給油完了 N₂の図は、図 1で提供されます。

1. N₂駅 (約 50 cm の長さ) を設定する十分なスペースがベンチの近くに N₂ガスのタンクを安全にインストールします。
2. タンクに駅が建設される領域に到達する十分な長さにチューブの部分を接続します。必要に応じて、任意の漏れを避けるためにタンクの出力にテフロン テープを適用します。
3. 同時に駅中のバブルの 5 本の対応を構築するための長さ約 5 cm のチューブの 4 つの部分をカットします。
4. 3 3 ウェイ T 形プラスチック継手とラインのチューブの部分を組み立てます。余分な T 字継ぎ手を介して N₂タンクの出力でのチューブの部分にこの線の一方の端を接続します。もう一方の端で 90 ° エルボを追加します。
5. 構造を水平金属棒にアタッチする使用テープには、ベンチの上のおよそ 30 cm が配置されます。
6. 手順 1.4 のインストール付属品の無料出力するため (長さ約 20 cm) にチューブの 5 個を接続します。
7. 5 1.0 mL プラスチック注射器からピストンを外し、これらの注射器の大きい方の端をカット (すなわち。、反対側に針)、卒業の部分だけを維持します。余りに堅く、綿とこれらの注射器を入力します。
8. チューブの 20 cm の縦に長い部分に注射器を挿入し、石鹸水を使用して N₂を流れるときに漏れがないことを確認します。
9. 5 25 G 針 (0.5 mm × 25 mm) のキャップを取り外し、これらの針を細いチューブの 10 cm の部分に挿入します。針がしっかりとチューブに収まることを確認します。
   注意: この手順中に刺しの危険性があります。ゆっくりと慎重にそれを行います。
10. N₂駅の注射器に準備手順 1.9 で針を取り付けます。N₂は、すべて 5 つのラインを流れることを確認し、スタンドでのステーションを維持します。

2. 成長培地の準備

注: それは 2.1.2、2.2.2 と 2.3.8 の手順で説明したように、調製した培地の量を調整することが可能です。水や化学薬品の量は、比例して調整するだけのニーズを使用しました。すべての培地成分の役割は、補足表 1で説明されます。

1. MSR - 1 液体の成長媒体の作製
   1. ● クエン酸鉄の 0.245 g を 100 mL の脱イオン蒸留水に追加することによって 10 mM クエン酸第二鉄溶液を調製します。熱し、黄色のオレンジ色の明確な解が得られるまで溶解する攪拌します。オートクレーブの標準を使用して、ソリューション (121 ° C で少なくとも 15 分の露出) のサイクルし、暗闇の中で室温でこの原液を保存します。
      注: は、沈殿物が明らかになるとき鉄のクエン酸液を捨てください。
   2. ビーカーに攪拌しながら順に以下の追加脱イオン蒸留水 1 L を含む: 1.0 mL の微量ミネラルを補うソリューション、KH₂PO₄0.1 g、MgSO₄.7 H₂O の 0.15 g、HEPES、2.38 g ナノ₃ 0.34 g、0.1 グラム酵母抽出物、大豆豆ペプトン 3.0 g 4.35 mL 乳酸カリウム (60%/w 溶液) と 10 ミリメートル fe (iii) クエン酸原液 5 mL。
      注: 小さい成長培地量が必要な場合それに比例して量を調整します。このプロトコルの手順 1 でビルドされるなど、同時にバブル 5 本ことができる N₂駅の中の 300 mL を準備します。
      警告: トレース鉱物と fe (iii) クエン酸在庫ソリューションを滅菌しておく必要があります。汚染を避けるためには、それら (火炎瓶ブンゼン バーナーを使用してのオープン トップ) を使用する場合、標準的な滅菌方法を使用し、調剤の滅菌ピペット チップを使用します。4 ° C で冷蔵庫にミネラル溶液を保存します。
   3. すべての化学薬品の添加後、1 M NaOH 水溶液で 7.0 に pH を調整します。125 mL の血清ボトルに作りたての媒体を調剤します。各ボトルの中の 60 mL を注ぐ。
   4. バブル N₂溶存 O₂を削除する 30 分の中に、小さなチューブを使用して手順 1 で記載されている N₂駅に接続されています。各ボトルは、ボトルを終了する過剰なガスを許可するように小さな開口部を残して上にブチル ゴム栓を置きます。
      注意: N₂をバブリングしながら泡を形作るかもしれない。泡の生産を避けるためにガスの流れを調整します。
   5. 圧着シール準備ストッパーとアルミ シール各ボトルです。アルミのシールによりボトルがプロトコルの残りの間に密封されたまま。
   6. N₂駅から針と細いチューブを外し、清潔な針 (1 インチ、≤ 23 G) に置き換えます。ガスの穏やかな連続流れ終了 (約 50 mL/分) タンク N₂タンクのバルブを調整します。
      注意: 針 23 G より大きいストッパーの永久的な unsealable の穴になります。
   7. ゴム栓を介して、培地の瓶の中に N₂タンクに接続されている針のいずれかを挿入します。すぐに同じボトルに別のきれいな針を挿入します。その他のボトルにこの手順を繰り返し、N₂でボトル内の空気を交換する約 30 分の N₂を流します。
   8. 対応する針を削除することによって、N₂駅からボトル 1 本を外します。培地のボトル内の圧力が大気圧に減るまで、数秒間待つし、2 つ目の針を抜きます。すべての残りのボトルのためには、この手順を繰り返します。
      注意: O₂を防ぐため、2.1.4 のステップの後成長培地のボトルを再入力してから、立て続けに 2.1.8 2.1.4 - の手順に従います。すべてのボトルは、同時に N₂駅に接続することはできない場合、は、ボトルの最初のセットの手順 2.1.4-2.1.8 続行し、残りのボトルにこれらの手順を繰り返します。
   9. オートクレーブ ボトル。一晩室温にクールにさせて、その後室温で保管します。
2. AMB 1、MS 1 液体の成長媒体の作製
   1. 10 mM 鉄キナ酸溶液を調製します。最初脱イオン蒸留水 100 mL にキナ酸 0.19 g を溶解した FeCl₃.6H₂O. 攪拌溶解、暗い赤、明確な解決策が得られるまでに 0.27 g を追加します。オートクレーブ (121 ° C で少なくとも 15 分の露出) の標準的なサイクルを使用して、ソリューション。
      注: は、ストック溶液を滅菌として暗闇の中で部屋の温度を鉄系ソリューションを格納します。沈殿物が明らかになる場合は、ソリューションを破棄します。
   2. ビーカーに攪拌しながら順に以下の追加脱イオン蒸留水 1 L を含む: 10.0 mL のビタミン サプリメント溶液、トレース ミネラルのサプリメント溶液、KH₂PO₄、コハク酸ナトリウム二塩基の 0.848 g 0.68 g 5.0 mL六水和物、ナトリウム ・酒石酸二水和物、0.45 mL 0.1% の酢酸ナトリウム三水和物の 0.083 g の 0.575 g 0.17 g ナノ₃、0.04 g のアスコルビン酸、10 ミリメートル fe (iii) キナ酸原液の 3.0 mL の水溶液レサズリン。
      注: 小さい成長培地量が必要な場合それに比例して量を調整します。このプロトコルの手順 1 でビルドされるなど、同時にバブル 5 本ことができる N₂駅の中の 300 mL を準備します。
      注意: ビタミン、微量ミネラルとキナ酸鉄 (iii) 溶液は滅菌しておく必要があります。汚染を避けるためには、調剤するとき標準的な無菌手技と滅菌ピペット チップを使用します。4 ° C で冷蔵庫にミネラルとビタミンがソリューションを格納します。
   3. すべての化学薬品の付加の後で 6.75 1 M 水酸化ナトリウム溶液を使用するために pH を調整します。
   4. 手順 2.1.3-2.1.9 プロトコルの残りの部分を参照してください。
3. MSR 1 半固体成長培地の調製
   1. K₂HPO₄ 3.362 g と KH₂PO₄ 100 mL の脱イオン蒸留水で 4.178 g を溶解して 0.5 M のリン酸バッファー溶液 pH 7.0 を準備します。PH が 7.0 の場合をチェックし、KH₂PO₄または必要な場合は水酸化ナトリウムと pH を調整します。密封されたガラス瓶 (プラスチックの酸素交換を避けるためにすることが望ましい) でソリューションを保存します。
   2. 0.02 M 塩酸溶液 100 mL を準備します。このソリューションにした FeCl₂.4H₂O の 0.2 g を加え、10 mM 鉄塩化物溶液を得るために解散するかき混ぜます。密封されたガラス瓶の中の暗闇の中でソリューションを保存します。
   3. 0.8 M 重炭酸ナトリウム溶液を準備するには、100 mL の脱イオン蒸留水に NaHCO₃ 6.72 g 溶解します。密封ガラス瓶でソリューションを保存します。
   4. オートクレーブ ソリューション 2.2.1 - 2.2.3 標準サイクル (121 ° C で少なくとも 15 分の露出) を使用しての手順で準備します。暗闇の中で滅菌溶液を保存します。
   5. ビーカーに攪拌しながら順に以下の追加脱イオン蒸留水 1 L を含む: トレース ミネラルのサプリメント溶液、0.2 mL の 1% 水溶液レサズリン溶液、NH₄Cl、MgSO₄.7H_{2 0.1 g 0.3 g, 塩化ナトリウム 0.4 g 5 mL}O、CaCl₂.2H₂O、1 g ナトリウム、コハク酸、酢酸ナトリウム、酵母の 0.2 グラムの 0.5 g の抽出の 0.05 g、寒天の 1.6 g。
   6. アルミ箔とオートクレーブ 2.3.5 準備したソリューション ビーカーをカバーします。
   7. オートクレーブ サイクルの最後の直前に準備新鮮な 4% L cysteine·HCl·L cysteine· の 0.8 g を溶解することにより H₂O ソリューションHCl·H₂O 脱イオン蒸留水 20 mL に。5 M NaOH 溶液で Ph7.0 にソリューションを中和します。
      注意: システインの酸化を避けるためにシステイン溶液を調製して新鮮なことが重要です。4 ° C で冷蔵庫にミネラル溶液を保存します。
   8. オートクレーブ後、50-60 ° C まで中を冷ます、ブンゼン バーナーの炎の下でビーカーをもたらします。アルミ箔を削除し、すぐに軽く攪拌しながら順に次を追加: ビタミン溶液、滅菌リン酸バッファー原液、滅菌鉄塩化原液、重炭酸ナトリウム滅菌株式 1.8 mL 3 mL の 2.8 mL 0.5 mLソリューション、ろ過殺菌されたシステイン溶液 10 mL です。
      注: 小さい成長培地量が必要な場合それに比例して量を調整します。通常媒体の 120 mL のバッチを準備すると便利です。
      注意: すべてのソリューションに将来使用するため無菌のままする必要があります。手順 2.3.8 無菌手技と滅菌ピペットを使用して調剤するときのヒントします。
   9. すべての化学薬品の付加の後で 16 mL 滅菌スクリュー キャップ ハンゲイト チューブに温かい媒体を転送します。各チューブに媒体の 12 mL を転送し、チューブをシールします。
      注意: 汚染を防止するには、ブンゼン バーナーの炎の下で 2.3.9 ステップを実行します。媒体は 40 ° c 以上、寒天が固化する前にそれを実行します。
   10. チューブを寒天が固化なり、OAI 明らかに無色のインターフェイス、媒体の表面下約 1 〜 3 cm にピンクとして具体化するまで数時間行わないでください。
       メモ: 媒体はチューブで無色にはゆっくりと。この遷移に必要な時間の量は可変して O₂媒体に溶解した当初の量によって異なります。

3。 MTB の接種

注: AMB-1 MS 1 および MSR 1 系統の文化商業的入手できます (テーブルの材料)。

注意: は、ブンゼン バーナーの炎の下で無菌の状態ですべての次の手順を実行します。

1. 液体培地で MSR 1、AMB 1 MS 1 株の接種
   1. ブチル ゴム栓アルミシール圧着と空 125 mL 血清ボトルをシールします。ストッパーをボトルで 2 本の針を挿入し、それらの 1 つのステップ 1.7 のように注射器を接続します。O₂ N の₂駅の使用とチューブの同じタイプのシリンダーに注射器を接続します。
   2. O₂を通過、約 30 分のためのびんをさせて、O₂でボトル内の空気をすべてを置き換えることを確認します。ボトルとし、オートクレーブのわずかな重圧を可能にする両方の針を削除します。使用する前に室温に冷却するボトルを許可します。
      注: 時間を節約するには、媒体の準備・ オートクレーブ媒体または貯蔵液と一緒にボトル中 3.1.1 と 3.1.2 の手順に従います。
   3. それらの上に 70% エタノール溶液数滴を適用するブンゼン バーナーの炎の中を渡すことによって新鮮な中瓶・ O₂ボトル ストッパーのトップスを滅菌します。
   4. 滅菌注射器と針を使って、O₂ボトルから O₂の 1 mL を抽出し、新鮮な培地ボトルにそれを転送します。針緊密に収まること注射器このステップの中に注射器で空気を避けるためにしていることを確認します。
   5. ガラス瓶で育った別の文化から接種材料を使用している場合は、それらの上に 70% エタノール溶液数滴を適用するブンゼン バーナーの炎の中を渡すことによって新鮮な中瓶の古い文化のボトル ストッパーを滅菌します。冷凍文化のチューブから菌を使用している場合ちょうどブンゼン バーナーの炎の下で密封された管とそれを室温まで温を知らせてください。
   6. ガラス瓶で育った別の文化から接種材料を使用している場合は、新鮮な媒体に古い文化の 1 mL を接種します。冷凍ストックから inoculate を使用している場合は、希釈、グリセロールまたはジメチル ジメチルスルホキシド (DMSO) 凍結の過程で使用する唯一の 0.1 mL を接種します。どちらの場合も、滅菌注射器、滅菌針を使用します。
   7. 32 ° C で文化を孵化させなさい、それを 4 〜 7 日後新鮮な培地に接種します。
2. MSR 1 の O₂グラデーション半固形培地での接種
   1. 新鮮な媒体のチューブが無色のインターフェイスにピンクが具体化、明確に定義された OAI を表示されることを確認します。
   2. 場合接種は別の O₂濃度勾配半固体培養から来ている, 細菌によって形成されたバンドに配置滅菌ピペット チップ細菌の文化の 50 μ L 分注で収穫します。ゆっくりとインターフェイスの妨害を回避する新鮮な媒体 (ピンク/無色インターフェイス)、OAI でこれらの細菌を接種します。接種は、冷凍の文化から来ている場合、は、代わりに菌の 100 μ L と同じ方法で進みます。
   3. シール チューブと細菌は 25 ° C から 30 ° C 成長させバンド細菌の培地の表面に達する前に、同じ手順を使用して新鮮な媒体に転送します。

4. 細菌の観察

1. それの上に 70% エタノール溶液を適用するブンゼン バーナーの炎を通過して文化の瓶の栓を消毒します。半固形培、ブンゼン バーナーの炎の下で管を開いてください。滅菌注射器、滅菌針を使用して、細菌を抽出します。
2. 絞首刑の使用は、細菌が磁気と運動の両方であることを確認する方法⁸をドロップします。
   注: 位相差顕微鏡は、偉大な結果を与えるが、必須ではありません。倍率 10 X 60 X に至るまでが適しています。
3. 細胞の構造とで詳細⁸マグネトソームを観察するのに透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用します。

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結果

成長媒体の成功の準備は、次のとおり評価できます。プロセスの最後に、ソリューションをクリア (すなわち。 任意の沈殿物の無料) 取得する必要があります (これは液体メディアと O₂グラデーション半固体媒体の両方に当てはまります)。接種は図 2 aで見ることができる前に、MSR 1 液体培地の予想される側面を表示する画像。成?...

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ディスカッション

MTB 特有の O₂濃度要件はように実験室で成長する非自明です。液体培地用のプロトコルの重要なステップは、O₂、接種直前の明確なボリュームを追加して最終濃度を制御するために媒体からのすべての O₂の初期の除去です。MSR 1 がほぼ完全に好気性の条件の下で育つ、しかし、細胞の磁性を大幅に削減、それを示されています。同じ調査の結果を示した、AMB 1 系統と MS-...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AMB-1	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC	ATCC 31632
MSR-1	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)	DSM 6361
Ferric citrate	Sigma-Aldrich	F3388-250G
Trace mineral supplement	ATCC	MD-TMS
KH2PO4	EMD	PX1565-1
MgSO4.7 H2O	EMD	MX0070-1
HEPES	BioShop Canada Inc	HEP001.250
NaNO3	Sigma-Aldrich	S5506-250G
Yeast extract	Fischer scientific	DF210929
Peptone	Fischer scientific	DF0436-17-5
Potassium L-lactate solution (60%)	Sigma-Aldrich	60389-250ML-F
D-(-)-Quinic acid	Sigma-Aldrich	138622
FeCl3.6H2O	Fischer scientific	I88-100
Vitamin supplement	ATCC	MD-VS
Sodium succinate hexahydrate	Fischer scientific	S413-500
Sodium L-tartrate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	228729-100G
Sodium acetate trihydrate	EMD	SX0255-1
Resazurin	Difco	0704-13
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-25G
K2HPO4	Caledon	6620-1-65
FeCl2 .4H2O	Sigma-Aldrich	44939-250G
Sodium bicarbonate	EMD	SX0320-1
NaCl	Caledon	7560-1
NH4Cl	EMD	1011450500
CaCl2.2 H2O	EMD	1023820500
Agar A	Bio Basic Canada Inc	FB0010
L-cysteine.HCl.H2O	Sigma-Aldrich	C7880-100G
1.0 mL syringes	Fischer scientific	B309659
25G  x 1 needles	BD	305125
125 mL serum bottles	Wheaton	223748
20 mm aluminum seals	Wheaton	224223-01
20mm E-Z Crimper	Wheaton	W225303
Butyl-rubber stoppers	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
Hungate tubes	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
Septum stopper, 13mm, Hungate	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
Glass culture Tubes	Corning (VWR)	9826-16X
Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent	Sigma-Aldrich	H1758-100ML	11.6 - 12 N