Crescita di batteri magnetotattici del genere Magnetospirillum: ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1

Riepilogo

Presentiamo una procedura per la coltivazione di diversi ceppi di Magnetospirillum in due diversi tipi di crescita media. Ceppo di Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 viene coltivato in sia liquido e gradiente di concentrazione di O₂ terreni semi-solidi mentre M. magneticum ceppo AMB-1 e M. magnetotacticum ceppo MS-1 sono coltivate in terreno liquido.

Abstract

I batteri magnetotattici sono Gram-negativi, mobili, prevalentemente acquatiche procarioti onnipresente in habitat d'acqua dolce e marini. Sono caratterizzati dalla loro capacità di magnetosomes di biomineralize, che sono magnetici dimensioni nanometriche cristalli di magnetite (Fe₃O₄) o di grigite (Fe₃S₄) circondati da una membrana lipidica a doppio strato, nelle loro citoplasma. Per la maggior parte dei batteri magnetotattici noto, magnetosomes sono assemblati in catene all'interno del citoplasma, quindi conferendo un momento di dipolo magnetico permanente alle cellule e causando loro di allineare passivamente con campi magnetici esterni. A causa di queste caratteristiche specifiche, batteri magnetotattici hanno un grande potenziale per applicazioni mediche e commerciali. Tuttavia, la maggior parte delle specie sono microaerofili e hanno requisiti specifici O₂ concentrazione, che li rende più difficile a crescere regolarmente rispetto a molti altri batteri come Escherichia coli. Qui presentiamo protocolli dettagliati per la coltivazione di tre dei più ampiamente studiati ceppi di batteri magnetotattici, tutti appartenenti al genere Magnetospirillum. Questi metodi consentono un controllo preciso della concentrazione₂ O reso disponibile ai batteri, al fine di garantire che si sviluppano normalmente e sintetizzare magnetosomes. Crescita di batteri magnetotattici per ulteriori studi utilizzando queste procedure non richiede lo sperimentalista di essere un esperto in microbiologia. I metodi generali presentati in questo articolo possono anche essere utilizzati per isolare e cultura altri batteri magnetotattici, anche se è probabile che la composizione chimica media di crescita dovrà essere modificato.

Introduzione

I batteri magnetotattici (MTB) rappresentano una vasta gamma di procarioti gram-negativi onnipresente in habitat acquatici d'acqua dolce e marini¹. Questi batteri condividono la capacità di produrre magnetici cristalli di magnetite (Fe₃O₄) o grigite (Fe₃S₄), che sono nella maggior parte dei casi assemblati in catene all'interno delle cellule. Questo particolare motivo strutturale è dovuta alla presenza di numerose proteine specifiche che agiscono sia nel citoplasma dei batteri e sulla membrana del lipido che circonda ogni cristallo². Ogni singolo cristallo e sua circostante delle vescicole di membrana viene chiamato un magnetosoma ed è che variano nel formato da circa 30 a 50 nm in Magnetospirillum specie³. A causa della disposizione di catena di magnetosomes, questi batteri possiedono un momento di dipolo magnetico permanente che li rende allineare passivamente con campi magnetici applicati esternamente. Di conseguenza, questi batteri nuotano attivamente lungo linee di campo magnetico, che agiscono come semovente micro-Compasso presumibilmente a più efficacemente individuare le condizioni più favorevoli (ad es., concentrazione di O₂ ) per la crescita.

Una proprietà interessante della MTB è la loro capacità di regolare sia la chimica e la cristallografia dei loro cristalli magnetosoma. Maggior parte dei ceppi produrre relativamente elevata purezza cristalli di magnetite o greigite, anche se alcuni biomineralize entrambi minerali⁴. In tutti i casi, i batteri sono in grado di controllare con precisione le dimensioni e la forma dei loro cristalli di singolo dominio magnetico. Questo spiega perché una grande quantità di ricerca è impegnata a sviluppare una migliore comprensione di come MTB eseguire questo processo biomineralization. Comprensione di questo processo potrebbe consentire ai ricercatori di adattare-fare nanocristalli magnetici per molte applicazioni mediche e commerciali.

Un ostacolo sostanziale al ricerche approfondite su MTB è stata la difficoltà della loro coltivazione in laboratorio. Maggior parte delle specie, tra cui i ceppi utilizzati in questo lavoro, sono obligately microaerofili se coltivata con O₂ come un accettore terminale di elettroni. Questo spiega perché questi batteri si trovano più spesso la zona di transizione tra condizioni ossidanti e anossiche (l'interfaccia ossica-anossico, OAI). Ciò dimostra chiaramente che la MTB hanno precise esigenze di concentrazione di O₂ che ovviamente deve essere presa in considerazione quando si concepisce la crescita media per questi organismi. Inoltre, la grande varietà esistente di MTB implica che diversi ceppi saranno necessari diversi tipi di gradienti chimici e sostanze nutrienti per ottenere una crescita ottimale.

In questo lavoro descriviamo i metodi per la coltivazione di tre di MTB più ampiamente studiati: Magnetospirillum magneticum (ceppo AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) e M. gryphiswaldense (MSR-1). Queste specie filogeneticamente appartengono alla classe di Alphaproteobacteria , nel phylum Proteobacteria , sono elicoidale nella morfologia e possiedono un flagello polare a ciascuna estremità della cella. Forniamo i protocolli per la coltivazione di ceppo MSR-1 sia liquido e O₂ gradiente di concentrazione media semi-solido, basato su ricette medie precedentemente pubblicate^5,6. Inoltre presentiamo un protocollo dettagliato per la crescita di ceppi AMB-1 e MS-1 nelle modificate magnetico Spirillum crescita medio (MGSM)⁷.

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Protocollo

1. installazione della stazione₂ N

Nota: Scegliere il diametro interno del tubo di modo che può essere collegato al serbatoio con perdita minima e in modo che il cilindro di una siringa di plastica da 1 mL si adatta strettamente in questo tubo. Un'illustrazione del completo N₂ stazione di gas è fornita nella Figura 1.

1. Tranquillamente installare un serbatoio di gas N₂ nei pressi di una panchina su cui c'è spazio sufficiente per impostare la stazione di₂ N (una lunghezza di circa 50 cm).
2. Collegare al serbatoio un pezzo di tubo abbastanza a lungo per raggiungere l'area dove sorgerà la stazione. Se necessario, applicare il nastro di Teflon all'uscita del serbatoio per evitare eventuali perdite.
3. Per costruire una stazione in grado di bubbling cinque bottiglie di mezzo allo stesso tempo, tagliate quattro pezzi di tubo di circa 5 cm di lunghezza.
4. Assemblare i pezzi di tubo in una linea con tre raccordi in plastica a forma di T di tre vie. Collegare un'estremità di questa linea per il pezzo di tubo all'uscita del serbatoio₂ N attraverso un raccordo a T extra. Aggiungere un raccordo all'estremità opposta del gomito di 90°.
5. Utilizzare nastro per fissare la struttura di un'asta metallica orizzontale posizionato circa 30 cm sopra la panca.
6. Collegare cinque pezzi di tubi (circa 20 cm di lunghezza) alle uscite libera degli accessori installati nel passo 1.4.
7. Rimuovere i pistoni da cinque siringhe di plastica 1,0 mL e tagliare l'estremità più grande di queste siringhe (cioè., il fronte lato all'ago), mantenendo solo la parte graduata. Riempire queste siringhe con cotone, non troppo strettamente.
8. Inserire le siringhe nei pezzi di tubi verticali lunghe 20 cm e utilizzare acqua saponata per garantire che non vi siano perdite quando N₂ sta fluendo.
9. Rimuovere i tappi di cinque aghi 25g (0,5 x 25 mm) e inserire questi aghi 10 cm pezzi di tubi sottili. Accertarsi che gli aghi misura strettamente nella tubazione.
   Attenzione: Esiste un rischio di accoltellamento durante questo passaggio. Fatelo lentamente e con attenzione.
10. Attaccare gli aghi preparati nel passaggio 1,9 per le siringhe della stazione₂ N. Assicurarsi che N₂ è che fluisce attraverso tutte le cinque linee e tenere la stazione in stand-by.

2. crescita media preparazione

Nota: È possibile regolare la quantità di terreno preparato, come spiegato nella procedura 2.1.2, 2.2.2 e 2.3.8. La quantità di acqua e prodotti chimici utilizzati appena ha bisogno di essere regolato proporzionalmente. Il ruolo di tutti i componenti di media è descritto in supplementari nella tabella 1.

1. Preparazione del terreno di coltura liquido per MSR-1
   1. Preparare una soluzione di citrato ferrico 10mm aggiungendo 0,245 g di citrato ferrico a 100 mL di acqua distillata deionizzata. Riscaldare e mescolare per sciogliere, fino al giallo all'arancione chiaro soluzione è ottenuta. Autoclave la soluzione utilizzando uno standard ciclo (almeno 15 min di esposizione a 121 ° C) e quindi conservare questa soluzione madre a temperatura ambiente al buio.
      Nota: Eliminare la soluzione di citrato ferrico quando un precipitato diventa evidente.
   2. In un becher contenente 1 L di acqua distillata e deionizzata, aggiungere quanto segue nell'ordine mescolando: 1,0 mL del minerale traccia supplemento soluzione, 0,1 g di KH₂PO₄, 0,15 g di MgSO₄,7 H₂O, 2,38 g di HEPES, 0,34 g di NaNO₃ , Estratto di 0,1 g di lievito, 3,0 g di peptone di fagioli di soia, 4,35 mL di lattato di potassio (soluzione al 60% w/w) e 5 mL di soluzione madre di Fe (III) citrato da 10 mM.
      Nota: Regolare le quantità proporzionalmente se è necessaria una minore quantità di mezzo di crescita. Per una stazione di₂ N capace di bubbling cinque bottiglie allo stesso tempo, come quella costruita nel passaggio 1 del presente protocollo, preparare 300 mL di terreno.
      Attenzione: Traccia minerale e Fe (III) citrato stock soluzioni devono essere mantenuti sterili. Per evitare contaminazioni, utilizzare una tecnica sterile standard quando utilizzarli (fiamma aperta cime delle bottiglie utilizzando un bruciatore di Bunsen) e Puntali sterili per l'erogazione. Conservare la soluzione minerale in frigorifero a 4 ° C.
   3. Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, regolare il pH a 7.0 con soluzione di NaOH 1 M. Dispensare il mezzo preparato in flaconi da 125 mL del siero. Versare 60 mL di terreno in ogni bottiglia.
   4. Bolla N₂ nel medium per 30 min rimuovere il disciolto O₂, utilizzando il piccolo tubo collegato alla stazione₂ N descritta nel passaggio 1. Mettere un tappo di gomma butilica sopra ogni bottiglia, lasciando una piccola apertura per consentire al gas in eccesso di uscire la bottiglia.
      Attenzione: Schiuma potrebbe formare mentre spumeggiante con N₂. Regolare di conseguenza il flusso di gas per evitare la produzione di schiuma.
   5. A crimpare sigillare ogni bottiglia con il tappo preparato e un sigillo in alluminio. Il sigillo di alluminio assicura che la bottiglia rimane sigillata durante il resto del protocollo.
   6. Scollegare gli aghi e il tubo sottile dalla stazione₂ N e sostituirli con aghi puliti (1 pollice, ≤ 23 G). Regolare le valvole del serbatoio₂ N in modo che un delicato flusso continuo di gas esce il serbatoio (circa 50 mL/min).
      Nota: Maggiore di 23G aghi possono lasciare permanente unsealable fori nel tappo.
   7. Inserire uno degli aghi collegati al serbatoio₂ N in una bottiglia di mezzo, attraverso il tappo di gomma. Inserire immediatamente un altro ago pulito nella stessa bottiglia. Ripetere questo passaggio per le altre bottiglie e lasciate scorrere₂ N per circa 30 min sostituire l'aria nelle bottiglie di N₂.
   8. Scollegare una bottiglia dalla stazione₂ N rimuovendo l'ago corrispondente. Attendere per alcuni secondi fino a quando la pressione nella bottiglia di terreno diminuisce a pressione atmosferica e rimuovere il secondo ago. Ripetere questo passaggio per tutte le bottiglie rimanenti.
      Attenzione: Per evitare O₂ da immettere nuovamente le bottiglie di terreno di coltura dopo passo 2.1.4, eseguire passaggi 2.1.4 - 2.1.8 in rapida successione. Se tutte le bottiglie non possono essere collegate alla stazione₂ N allo stesso tempo, procedere con passaggi 2.1.4-2.1.8 per il primo set di bottiglie e quindi ripetere questi passaggi per le bottiglie rimanenti.
   9. Autoclave le bottiglie. Lasciate raffreddare fino a temperatura ambiente durante la notte e conservarle a temperatura ambiente in seguito.
2. Preparazione del terreno di coltura liquido per AMB-1 e MS-1
   1. Preparare una soluzione di chinato ferrico di 10 mM. Prima sciogliere 0,19 g di acido chinico in 100 mL di acqua distillata o deionizzata, quindi aggiungere 0,27 g di FeCl₃.6h₂O. mescolare per sciogliere, fino ad ottenuta una soluzione di rossa, chiara scuro. Sterilizzare in autoclave la soluzione utilizzando un ciclo standard (almeno 15 min di esposizione a 121 ° C).
      Nota: Conservare la ferrica soluzione chinato a temperatura ambiente al buio come una soluzione sterile. Scartare la soluzione quando un precipitato diventa evidente.
   2. In un becher contenente 1 L di acqua distillata e deionizzata, aggiungere quanto segue nell'ordine mescolando: 10,0 mL della soluzione di supplemento di vitamina, 5,0 mL della soluzione di integratore minerale traccia, 0,68 g di KH₂PO₄, 0,848 g del succinato del sodio bibasico esaidrato, 0,575 g di-sodio tartrato diidrato, 0,083 g di sodio acetato triidrato, 0,45 mL di 0,1% Resazurin acquosa, 0,17 g di NaNO₃, 0,04 g di acido ascorbico e 3,0 mL della soluzione di riserva chinato di Fe (III) da 10 mM.
      Nota: Regolare le quantità proporzionalmente se è necessaria una minore quantità di mezzo di crescita. Per una stazione di₂ N capace di bubbling cinque bottiglie allo stesso tempo, come quella costruita nel passaggio 1 del presente protocollo, preparare 300 mL di terreno.
      Attenzione: Vitamina, minerali traccia e soluzioni di riserva chinate di Fe (III) devono essere mantenuti sterili. Per evitare contaminazioni, utilizzare una tecnica sterile standard e Puntali sterili durante l'erogazione. Conservare le soluzioni minerali e vitamina in frigorifero a 4 ° C.
   3. Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, regolare il pH a 6,75 utilizzando la soluzione di NaOH 1 M.
   4. Fare riferimento alla procedura 2.1.3-2.1.9 per il resto del protocollo.
3. Preparazione del terreno di coltura semisolido per MSR-1
   1. Preparate un 0,5 M tampone fosfato soluzione pH 7.0 sciogliendo 3,362 g di K₂HPO₄ e g 4,178 di KH₂PO₄ in 100 mL di acqua distillata deionizzata. Controllare se il pH è 7.0 e regolare il pH leggermente con KH₂PO₄ o NaOH se necessario. Conservare la soluzione in una bottiglia di vetro tappata (preferibile alla plastica al fine di evitare scambio di ossigeno).
   2. Preparare 100 mL di una soluzione di acido cloridrico 0,02 M. Aggiungere 0,2 g di FeCl₂.4h₂O questa soluzione e mescolare per sciogliere al fine di ottenere una soluzione di cloruro di ferro di 10 mM. Conservare la soluzione al buio in una bottiglia di vetro tappata.
   3. Preparare una soluzione di bicarbonato di sodio 0,8 M sciogliendo 6,72 g di NaHCO₃ in 100 mL di acqua distillata deionizzata. Conservare la soluzione in una bottiglia di vetro tappata.
   4. Autoclave le soluzioni preparate in passaggi 2.2.1 - 2.2.3 usando un ciclo standard (almeno 15 min di esposizione a 121 ° C). Memorizzarli come sterile soluzioni di riserva nel buio.
   5. In un becher contenente 1 L di acqua distillata e deionizzata, aggiungere quanto segue nell'ordine continuando a mescolare: 5 mL della soluzione di integratore minerale traccia, 0,2 mL di soluzione acquosa resazurin 1%, 0,4 g di NaCl, 0,3 g di NH₄Cl, 0,1 g di MgSO₄.7h₂ O, 0,05 g di CaCl₂.2h₂O, 1 g di sodio succinato, 0,5 g di acetato di sodio, 0,2 g di lievito di estrarre e 1,6 g di agar.
   6. Coprire il recipiente con carta stagnola e autoclave la soluzione preparata al punto 2.3.5.
   7. Poco prima della fine del ciclo di autoclave, preparare un fresco 4% L-cysteine· HCl· H₂O soluzione sciogliendo 0,8 g di L-cysteine· HCl· H₂O in 20 mL di acqua distillata deionizzata. Neutralizzare la soluzione a pH 7.0 con soluzione di NaOH 5m.
      Attenzione: è importante che la soluzione di cisteina è preparata fresco per evitare l'ossidazione della cisteina. Conservare la soluzione minerale in frigorifero a 4 ° C.
   8. Dopo la sterilizzazione in autoclave, lasciare raffreddare la media fino a 50 – 60 ° C e portare il becher sotto la fiamma di un becco Bunsen. Rimuovere il foglio di alluminio e aggiungere rapidamente le seguenti in ordine mentre mescolando delicatamente: 0,5 mL di soluzione di vitamine, 2,8 mL di soluzione tampone fosfato sterile stock, 3 mL di soluzione madre di sterile ferro cloruro, 1,8 mL di brodo sterile bicarbonato di sodio soluzione e 10 mL di soluzione di cisteina filtro-sterilizzato.
      Nota: Regolare le quantità proporzionalmente se è necessaria una minore quantità di mezzo di crescita. È solitamente conveniente preparare un lotto di 120 mL di terreno.
      Attenzione: Tutte le soluzioni devono rimanere sterili per uso futuro. Eseguire il passaggio 2.3.8 utilizzando una tecnica sterile standard e pipetta sterile suggerimenti durante l'erogazione.
   9. Dopo l'aggiunta di tutte le sostanze chimiche, è possibile trasferire il mezzo caldo in provette Hungate di 16 mL tappo a vite sterile. 12 mL di terreno di trasferimento in ogni provetta e sigillare i tubi.
      Attenzione: Per evitare contaminazioni, eseguire il passaggio 2.3.9 sotto la fiamma di un becco Bunsen. Eseguire prima l'agar solidifica, mentre il mezzo è a 40 ° C o sopra.
   10. Lasciare riposare i tubi per diverse ore fino a quando l'agar si solidifica e l'OAI diventa apparente, materializzando come una rosa al interfaccia incolore, circa 1 a 3 cm sotto la superficie del mezzo.
       Nota: Il mezzo dovrebbe girare lentamente incolore nel tubo. La quantità di tempo necessario per questa transizione è variabile e dipende dalla quantità di O₂ inizialmente disciolto nel mezzo.

3. inoculazione di MTB

Nota: Le colture di ceppi AMB-1, MS-1 e MSR-1 possono essere ottenute in commercio (Tabella materiali).

Attenzione: Eseguire le seguenti operazioni in condizioni sterili, sotto la fiamma di un becco Bunsen.

1. Inoculazione di ceppi MSR-1, AMB-1 e MS-1 in mezzo liquido
   1. Sigillare una bottiglia di siero vuoto 125 mL con un tappo di gomma butilica e un sigillo di alluminio a crimpare. Inserire due aghi in bottiglia attraverso il tappo e collegare una siringa preparata come 1.7 passaggio ad uno di loro. Collegare la siringa in un cilindro di O₂ attraverso lo stesso tipo di tubazione come quello utilizzato per la stazione di₂ N.
   2. Lasciate che attraversa₂ O la bottiglia per circa 30 min, per garantire che tutta l'aria nella bottiglia è sostituito da O₂. Rimuovere entrambi gli aghi, consentendo una leggera sovrapressione in bottiglia e quindi autoclave. Consentire la bottiglia raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.
      Nota: Per risparmiare tempo, eseguire i passaggi 3.1.1 e 3.1.2 durante la preparazione media e autoclave la bottiglia con il mezzo o le soluzioni di riserva.
   3. Sterilizzare le cime dei tappi di sia il fresca bottiglia e la bottiglia di₂ O applicando alcune gocce di soluzione di etanolo 70% sopra di essi e passarli attraverso la fiamma di un becco Bunsen.
   4. Utilizzando un ago e una siringa sterile, estrarre 1 mL O₂ dalla bottiglia O₂ e trasferirlo nella bottiglia media fresca. Assicurarsi che l'ago sia strettamente sulla siringa durante questo passaggio per evitare qualsiasi aria nella siringa.
   5. Se si utilizza l'inoculo da un'altra cultura cresciuta in una bottiglia di vetro, sterilizzare i tappi il fresca bottiglia media sia il più vecchio flacone di coltura applicando alcune gocce di soluzione di etanolo 70% sopra di essi e passarli attraverso la fiamma di un becco Bunsen. Se si utilizza l'inoculo da un tubo della cultura congelato, basta lasciarlo caldo fino a temperatura ambiente con il tubo sigillato sotto la fiamma di un becco Bunsen.
   6. Se si utilizza l'inoculo da un'altra cultura cresciuta in una bottiglia di vetro, inoculare 1 mL della cultura più anziane nel medium fresco. Se si utilizza l'inoculare da azione congelate, inoculare solo 0,1 mL per diluire il glicerolo o dimetil solfossido (DMSO) utilizzato nel processo di congelamento. In entrambi i casi, utilizzare un ago sterile e una siringa sterile.
   7. Incubare la coltura a 32 ° C ed e inoculare in mezzo fresco dopo 4-7 giorni.
2. Inoculazione di MSR-1 in mezzo semi-solido gradiente di O₂
   1. Verificare che il tubo di mezzo fresco Visualizza un ben definito OAI, materializzata da una rosa di interfaccia incolore.
   2. Se l'inoculo è proveniente da un altro O₂ gradiente di concentrazione semi-solida cultura, raccogliere i batteri di pipettaggio 50 µ l della cultura con una pipetta sterile messo sulla band formata dai batteri. Inoculare lentamente questi batteri a OAI nel medium fresco (Rosa/incolore interfaccia), evitando di disturbare l'interfaccia. Se l'inoculo è proveniente da una cultura congelata, procedere nello stesso modo con 100 µ l di inoculo invece.
   3. Sigillare il tubo e lasciare che i batteri crescono tra i 25 ° C e 30 ° C. Trasferimento in mezzo fresco utilizzando la stessa procedura prima della band di batteri raggiunge la superficie del mezzo.

4. osservazione dei batteri

1. Sterilizzare il tappo della bottiglia cultura applicando la soluzione di etanolo 70% su di esso e facendolo passare attraverso la fiamma di un becco Bunsen. Per mezzo di semi-solido, aprire il tubo sotto la fiamma di un becco Bunsen. Usare un ago sterile e una siringa sterile per estrarre i batteri.
2. Uso l'impiccagione drop metodo⁸ per garantire che i batteri sono magnetici e motili.
   Nota: Microscopia di contrasto di fase dà grandi risultati, ma non è obbligatoria. Ingrandimenti compresi tra 10 X 60 X sono adatti.
3. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) consente di osservare la struttura delle cellule e la magnetosomes in dettaglio⁸.

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Risultati

Corretta preparazione dei media crescita può essere valutato come segue. Alla fine del processo, soluzioni chiare (cioè., privo di qualsiasi precipitato) dovrebbe essere ottenuta (questo è vero sia per mezzi liquidi e la coltura di semi-solido gradiente O₂ ). Un'immagine di visualizzazione l'aspetto previsto del mezzo liquido MSR-1 prima inoculazione può essere visto nella Figura 2a. Un successo mezzo semi-solido di O₂ gradi...

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Discussione

I requisiti specifici di O₂ concentrazione di MTB li rendono banale a crescere in laboratorio. Un passaggio chiave del protocollo per mezzo liquido è la rimozione iniziale di tutti i O₂ dal mezzo al fine di controllare la concentrazione finale aggiungendo un volume determinato di O₂, appena prima dell'inoculazione. È stato dimostrato che MSR-1 cresce in condizioni aerobiche quasi completamente, tuttavia, il magnetismo delle cellule è drasticamente ridotto. I risultati dello stesso stud...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AMB-1	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 700264
MS-1	ATCC	ATCC 31632
MSR-1	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)	DSM 6361
Ferric citrate	Sigma-Aldrich	F3388-250G
Trace mineral supplement	ATCC	MD-TMS
KH2PO4	EMD	PX1565-1
MgSO4.7 H2O	EMD	MX0070-1
HEPES	BioShop Canada Inc	HEP001.250
NaNO3	Sigma-Aldrich	S5506-250G
Yeast extract	Fischer scientific	DF210929
Peptone	Fischer scientific	DF0436-17-5
Potassium L-lactate solution (60%)	Sigma-Aldrich	60389-250ML-F
D-(-)-Quinic acid	Sigma-Aldrich	138622
FeCl3.6H2O	Fischer scientific	I88-100
Vitamin supplement	ATCC	MD-VS
Sodium succinate hexahydrate	Fischer scientific	S413-500
Sodium L-tartrate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	228729-100G
Sodium acetate trihydrate	EMD	SX0255-1
Resazurin	Difco	0704-13
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-25G
K2HPO4	Caledon	6620-1-65
FeCl2 .4H2O	Sigma-Aldrich	44939-250G
Sodium bicarbonate	EMD	SX0320-1
NaCl	Caledon	7560-1
NH4Cl	EMD	1011450500
CaCl2.2 H2O	EMD	1023820500
Agar A	Bio Basic Canada Inc	FB0010
L-cysteine.HCl.H2O	Sigma-Aldrich	C7880-100G
1.0 mL syringes	Fischer scientific	B309659
25G  x 1 needles	BD	305125
125 mL serum bottles	Wheaton	223748
20 mm aluminum seals	Wheaton	224223-01
20mm E-Z Crimper	Wheaton	W225303
Butyl-rubber stoppers	Bellco Glass, Inc.	2048-11800
Hungate tubes	Chemglass (VWR)	CLS-4208-01
Septum stopper, 13mm, Hungate	Bellco Glass, Inc.	2047-11600
Glass culture Tubes	Corning (VWR)	9826-16X
Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent	Sigma-Aldrich	H1758-100ML	11.6 - 12 N