החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

Summary

כתב יד זה מתאר שיטה CRISPR-Cas9 מבוססי מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר (CRISPR) לחקירה פשוט ומהיר של התפקיד של גנים מרובים המועמד בהתפשטות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ב במקביל. טכניקה זו היא מדרגית, יכול להיות מיושם במבנים אחרים סרטן התא גם כן.

Abstract

ג'ין ההפרעות מחקרים שימשו בהרחבה לחקור את התפקיד של גנים בודדים ב- AML פתוגנזה. להשגת שיבוש גנטי מלא, רבים ממחקרים אלה עשו שימוש מודלים נוקאאוט גנטי מורכב. בעוד מחקרים אלה עם עכברים knockout מציעים מערכת במבחן הזמן אלגנטית על חקירת יחסי גנוטיפ-כדי-פנוטיפ, שיטה מהיר ומדרגי להערכת מועמד גנים זה לשחק תפקיד התפשטות תאים AML או הישרדות AML דגמים יעזור לזרז חקירת גנים המועמד מרובים במקביל. ההתקדמות בטכנולוגיות לעריכת הגנום פופולארים באופן דרמטי את היכולת שלנו לבצע לפליטת גנטי בקנה מידה חסר תקדים. מערכת אחת כזאת של הגנום עריכה היא שיטת CRISPR-Cas9 מבוססי יכול לשמש כדי להפוך מהירה וכן שינויים בגנום תא היעד. נוחות ואת המדרגיות של מחיקה ג'ין CRISPR/Cas9-מתווכת ' עושה את זה אחת מהטכניקות האטרקטיבי ביותר עבור החקירה של מספר רב של גנים מבחני פנוטיפי. כאן, אנו מציגים וזמינותו פשוטה באמצעות גנים CRISPR/Cas9 מתווכת-בשילוב עם תפוקה גבוהה לזרום cytometry מבוססת על תחרות מבחני הפרעה לחקור את התפקיד של גנים שעשויים לשחק תפקיד חשוב התפשטות או ההישרדות של האדם, שורות תאים מאתר של AML.

Introduction

העשורים האחרונים ראינו מאמצים מחקרים רבים התמקדו בזיהוי התרומה של מסלולים מולקולריים מפתח ב פתוגנזה לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). באופן מסורתי, ג'ין-הפרעה בתאי AML בוצעה באמצעות עכברים knockout מותנה או סיכת ראש-קצרים RNA (shRNA). בעוד עכברים knockout מציעים מערכת מתוחכמת לשליטה-עתיים של ג'ין-מחיקה, יצירת עכברים knockout ג'ין הוא מהגידולים, גוזלת זמן יקר. יתר על כן, ג'ין-הסתרה באמצעות אסטרטגיות רקומבינציה אינה להרחבה בקלות; אסטרטגיות אלו אינם מתאימים עצמם טוב לחקירה של מספר גנים במקביל. לאחר הגילוי של שיטות התערבות RNA mRNAs אנדוגני דפיקה למטה בעזרת RNA קטנים מפריעות (siRNA) או shRNA, החלו קבוצות רבות באמצעות טכניקות התערבות RNA לחקור את התפקיד של גנים ספציפיים ב- AML. מאז תאים AML מאתר והן אנושי שקשה לחסלם transfect בשיטות תקנים מסורתי המבוסס על שומנים בדם, לרוב מחקרים shRNA מועסקים lentivirally או מקודד retrovirally ללמוד פונקציה גנים בתאים AML. גילוי זה התבצעה מקובצים באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR), nucleases Cas המשויך (CRISPR-Cas9) יש מהפכה פילוח ג'ין טכנולוגיות^1,2,3. באמצעות CRISPR-Cas9, גנים ספציפיים או אזורים גנומית ניתן למחוק, לערוך או מתויגים עם יעילות וקלות. CRISPR Cas9-עריכת מבוססי-ג'ין עכשיו מתעוררים כמו שיטת הבחירה עבור חוקרים יחסי גנוטיפ-כדי-פנוטיפ סוגי תאים שונים עקב פשטות, יעילות, ישימות רחבה של טכניקה זו. שיטות המבוססות על CRISPR-Cas9 גם הופכים שיטת הבחירה ב- AML, לא רק עבור חוקרים גנים בודדים, אבל גם כמו דרך היעד גנים מרובים במסכים ערוכים או במאגר הגנטי שמטרתו חוקרים מספר גנים במקביל כפוטנציאל AML-תלות^4,5,6.

כתב יד זה, אנו מתארים וזמינותו צמיחה תחרותי פשוטה למדידת ההשפעה של ג'ין-הפרעה על הגידול של תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה, בהתבסס על יציבה CRISPR Cas9-בתיווך גנים לעריכת ואחריו cytometry זרימה תפוקה גבוהה. שיטה זו היא פשוטה, יעילה, ניתן להרחבה עד בינוני-תפוקה ניסויים עבור חוקרים את התפקיד של מספר גנים במקביל בתאים AML.

Protocol

1. ייצור AML תא קו שיבוטים עם ביטוי גבוהה של Cas9 פעילה ויציבה

1. הפקה של Cas9 lentivirus
   1. יום 0: צלחת 4 x 10 תאים⁶ 293T ב- 10 מ"ל של DMEM עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין-גלוטמין בצלחת תרביות רקמה 10 ס מ ב אבטחה ברמה 2 (BSL2) מוסמך הוד התרבות תאים. הכנס את המאכל חממה 37 ° C.
   2. יום 1: התאים מצופה 293T צריך להיות 70 – 80% confluent ביום 1. לבצע את תרביות תאים באמצעות פרוטוקול הבאים בשעות אחר הצהריים.
   3. חממו את בינוני תרביות תאים, תרבות המדיה ואת תרביות תאים ריאגנט לטמפרטורת החדר. להפשיר את כל פלסמידים הנדרשים עבור תרביות תאים.
   4. מיקס 9 µg של psPAX2, 0.9 µg של pMD2.G µg 9 של פלסמידים pLenti-Cas9 עם µL 500 של תרביות תאים במדיום שפופרת 5 מ.
   5. להוסיף 1.7 מ של תרביות תאים בינוני mL 14 סיבוב התחתית התחתונה. הוסף µL 57 של תרביות תאים ריאגנט ישירות לתוך המדיום תרביות תאים בצינור כדי להימנע מלגעת הקיר של הצינור.
   6. בעדינות להוסיף את המיקס כולו פלסמיד תרביות תאים ריאגנט פתרון ומערבבים על-ידי הקשה בעדינות את הצינורית על הצד. דגירה התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות. בינתיים, לשנות את המדיום מהצלחת 293T הזריעה.
   7. להוסיף את תערובת תרביות תאים dropwise לצלחת, רוק בעדינות את הצלחת הצידה לערבוב יעיל. מקם את הצלחת חממה 37 ° C.
   8. יום 2: וארוקן את תגובת שיקוע מהצלחת תרביות תאים בעדינות כך התאים לא מופרע או רופף מהצלחת. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 10 מ של מדיום DMEM 10% טרי באמצעות החלקה למטה בעדינות מצד לצד של הצלחת להימנע הם מוציאים את התאים.
   9. יום 3: לאסוף את הוירוס המכילה תגובת שיקוע מהצלחת תרביות תאים לאט על-ידי ציור זה לתוך מזרק סטרילי 10 ס מ. לאחר תגובת שיקוע נאסף לתוך המזרק, לצרף המזרק מסנן מיקרומטר 0.45 סטרילי, החזק את המזרק ואת מסנן על צינור חרוטי פוליפרופילן טריים, סטרילי 15 מ"ל. מזנקת בעדינות את המזרק כדי לסנן את הווירוס המכיל תגובת שיקוע דרך המסנן מיקרומטר 0.45 לתוך הצינור חרוט פוליפרופילן 15 מ"ל.
   10. לאחסן המדיום הממוזגים ויראלית aliquots של 2 מ ל כל אחד ב- 2 mL cryovials ב-80 מעלות צלזיוס.
2. התמרה חושית של שורות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה
   1. יום-1: למהול 1 מ"ג/מ"ל fibronectin האנושי רקומביננטי פרגמנט המניה µg/mL 10 עם סליין סטרילי באגירה פוספט (PBS). המעיל רקמות תרבות-שאינם מטופלים 6 טוב צלחת עם 2 מ"ל של הפתרון עובד 10 µg/mL פרגמנט fibronectin האנושי רקומביננטי בשכונה תרבות תא BSL2 אושרה. עוטף את הצלחת לעטוף תיאחז כדי למנוע אובדן על אידוי וחנות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
   2. יום 0: להפשיר את תגובת שיקוע נגיפית המכילה Cas9. האחות הפתרון פרגמנט רקומביננטי fibronectin אנושי לחלוטין מן הלוח מצופה לפני spinfection. להוסיף 2 מ של נגיפי בינוני ממוזגים עם Cas9 לצלחת ולסובב את זה ב x 1300 גרם במשך 90 דקות ב- 35 מעלות צלזיוס. זה עוזר את חלקיקי נגיפי לצרף spinfected טוב.
   3. בינתיים, לספור את התאים כדי להיות transduced ו ספין למטה 2 x 10 תאים⁶ צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 2 מ"ל של מדיה תרבות טריים.
   4. לאחר spinfection, להסיר את תגובת שיקוע ויראלי spinfected טוב וזורקים. חלקיקי retroviral תגובת שיקוע מחוברים בתחתית spinfected טוב. זה להוסיף, התאים⁶ 2 x 10 resuspended ב 2 מ של האמצעי השלבים שלעיל.
   5. לסובב את הצלחת שוב ב 1300 x g מאוד בקצרה (1-2 דקות) מספיק כדי לאפשר את התאים להתיישב בחלק התחתון. מקם את הצלחת בחזרה לתוך החממה, להשאיר למשך הלילה עבור התמרה חושית עם חלקיקי נגיפי spinfected מחובר היטב.
   6. יום 1: בהתאם צפיפות התאים, יש להוסיף בינוני יותר לתאים transduced כדי למנוע גידול יתר.
   7. יום 2: מאז פלסמיד pLenti-Cas9 יש לסמן התנגדות Blasticidin, להוסיף Blasticidin במינון 10 מ ל/µg transduced, untransduced (בקרה) MOLM13 או תאים לוקמיה העכבר MLL-AF9 לבחירת Cas9 לבטא תאים.
      הערה: Blasticidin מבחר של Cas9-transduced MOLM13 או MLL-AF9 בתאי הלוקמיה נחשב מלאה כאשר כל התאים בקרה untransduced חוסלו. עבור שורות תאים חוץ MOLM13 ו- MLL-AF9 לוקמיה, עקומת תגובת המינון חייב להתבצע לפני הניסוי הזה כך יכול להיות מועסק המינון האופטימלי. טיטור של תגובת שיקוע ויראלי יכול להתבצע גם במקרה של המחירים נמוכים-התמרה חושית.
3. לשכפל את בחירת התאים מבטאים גבוהה-Cas9.
   הערה: שמנו לב כי בעוד כמה שורות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה, לשכפול הבחירה ייתכן שלא יהיה צורך: עיקר האוכלוסייה Cas9-Blasticidin נבחר כבר יש יעילות גבוהה לעריכת הגנום. במקרה זה, ניתן לדלג על שלב 1.3 ולעבור שלב 1.4 כדי להעריך את הביטוי Cas9 בתאים AML בצובר Cas9-blasticidin על-ידי המערב סופג את זה זה עדיין יהיה חשוב להעריך את יעילות לעריכת ג'ין באותם תאים בצובר Cas9-AML (שלב 1.5) לפני שימשיך מבחני תחרות. אנחנו משערת כי הבחירה של שיבוטים גבוהה יחיד-Cas9 מפחית את ההשתנות לעריכת הגנום, אשר חשוב במיוחד בעת בדיקת מספר של מדריך יחיד שונה RNAs (sgRNAs).
   1. מבצעים חד-תא בערך Cas9-Blasticidin נבחר תאים לוקמיה MOLM13 ו- MLL-AF9 מעתה בשם MOLM13-Cas9 ותאים MLL-AF9-Cas9, בהתאמה, שימוש של סדרן FACS הכלול ברדס BSL2 אושרה. ניתן לבצע מיון 5 – 10 עגול התחתון תרביות רקמה שטופלו לוחות טוב 96.
   2. פעם אחת MOLM13-Cas9, שיבוטים MLL-AF9-Cas9 נאספו ולהרחיב בנפרד בשם, 10 – 20 שיבוטים עם 10 µg/mL של Blasticidin תרבות בתקשורת כדי להבטיח שמירה על הביטוי Cas9.
4. הביטוי לבדוק חלבון Cas9 יציב על-ידי immunoblotting.
   1. להפוך תמציות הגרעין של כל שיבוטים Blasticidin נבחר של לוקמיה MOLM13 ו- MLL-AF9 באמצעות ערכת חילוץ גרעיני לפי הפרוטוקול של היצרן. בדוק Cas9 ביטוי חלבון באמצעות אנטי-דגל M2 נוגדן מאז Cas9 בתוך פלסמיד pLenti-Cas9 קשורה epitope N-מסוף דגל.
   2. לטעון µg 50 של חלבון הכולל של כל תמצית גרעיני על 10% Bis-טריס ג'ל ולהפעיל את הג'ל-120 V עד להקות העליון מופרדים היטב.
   3. לחסום את הקרום עם 5% פתרון חלב TBST מאגר מאובטח.
   4. דגירה הקרום עם 1:1,000 לדילול דגל נגד נוגדן M2-ריכוז הסופי של µg/mL 1-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   5. ביום למחרת, לשטוף את הקרום עם מאגר TBST, דגירה עם HRP מצומדת העכבר אנטי משני נוגדן-לדילול 1:5,000 (הריכוז הסופי של 0.16 µg/mL) בטמפרטורת החדר מאובטח.
   6. לשטוף את הקרום ביסודיות עם TBST ולפתח את האבן החשופה באמצעות ECL המצע.
   7. לבחור שיבוטים 3-4 עם הביטוי החלבון הגבוהה ביותר של Cas9 כפי שנראה סופג המערבי לצורך ניתוח פונקציונאלי נוסף (איור 1).
5. הבטחת הפעילות Cas9 גבוהה שיבוטים שנבחרו
   1. להכין lentiviral תגובת שיקוע של וקטור קידוד sgRNA עם sgRNAs לעבר האדם או עכבר AAVS1 כספת-הארבור לוקוס כפי שמתואר על 1.1 שלב.
   2. מגלי העליון להביע Cas9 MOLM13 או לוקמיה MLL-AF9 שיבוטים עם אנטי-AAVS1 sgRNA lentiviral תגובת שיקוע בשיטת spinfection שתוארו לעיל. בחר עם 2.5 µg/mL Puromycin ארבעה ימים.
   3. לטהר את הדנ א של שיבוטים לוקמיה MOLM13-Cas9 או MLL-AF9-Cas9 לאחר הבחירה Puromycin יחד עם פקדים פראי-סוג המתאימים באמצעות ערכת חילוץ דנ א גנומי לפי הוראות היצרן. שימוש 50 ng של DNA כתבנית כדי לבצע PCR עם AAVS1_test_primers באמצעות 2 x מיקס מאסטר של אנזימים, התוכנית PCR המפורטים בטבלה1.
   4. להפעיל את המוצר PCR על ג'ל agarose 2%, ג'ל-לטהר את הלהקה זוג בסיסים 268 באמצעות ערכת חילוץ ג'ל לפי הפרוטוקול של היצרן. סאנגר רצף הג'ל טהור PCR מוצר באמצעות פריימר של AAVS1_target-frag_F.
   5. להעריך יעילות העריכה על ידי השוואה של AAVS1 נערך רצפים wildtype באמצעות כלים מבוססי-אינטרנט מקוון (איור 2).

2. שיבוט, התמרה חושית של sgRNAs בתאים AML-Cas9

1. תפוקה בינונית שכפול של sgRNAs
   1. עיצוב sgRNAs 4-6 עבור הגן עניין באמצעות תוכנת עיצוב CRISPR מבוססי-אינטרנט. יש מספר CRISPR עיצוב כלים זמינים באינטרנט כגון http://crispr.mit.edu/ אשר ליצור רצפים sgRNA מבוסס על רצף ה-DNA קלט.
      1. מלא את המידע המתאים בשדות עם כוכביות. לחץ על הגנום היעד עבור עיצוב sgRNA. הדבק את רצף היעד בתיבה רצף ולחץ על לחצן שלח .
   2. לקראת שיבוט ב pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W sgRNA ביטוי פלסמיד, רצץ של נוקלאוטידים "CACC" חוש oligo, "AAAC" כדי oligo antisense המלווים הפוך לפני שמזמינים. סדר premixed חוש וחוש אנטי oligos בצלחת 96-ובכן מתויג Oligo-מיקס של חברת סינתזה oligonucleotide.
      הערה: אנחנו עשינו שימוש pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W פלסמיד, שבו יש דרך האתר הגבלת BbsI sgRNA שיבוט. במקרה השני פלסמידים ביטוי sgRNA משמשים, המסוכך על המשמש את oligonucleotides sgRNA צריך להשתנות בהתאם.
   3. לקחת U התחתון 96-ובכן לוח נפרד מתויג חישול צלחת. להפוך את תערובת הבסיס של 1 µL PNK T4, µL 1 של 10 x מאגר מצדו T4 DNA ו 6 µL של מים ליום חישול התגובה.
   4. הוסף 8 µL של המיקס מאסטר כל טוב של צלחת מחזק. להוסיף 1 µL של 100 מיקרומטר, הגיוני, antisense oligo (או 2 µL של מעורבות oligos הגיוני-אנטי-סנס) לתערובת בסיס. פיפטה 2 – 3 פעמים בעדינות לערבב היטב, לסובב את הצלחת בקצרה כדי לקבל את תערובות לתחתית של וולס.
   5. השתמש בתוכנית מחזק הבאים על מכונת ה-PCR: 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 2 דקות 30 s ב 95 ° C ואחריו קירור איטי עד 22 ° C בשיעור של 0.1 º C/s. לאחר חישול, לקחת צלחת 96-ובכן טרי מתויג OligoMix מדולל. . על הצלחת הזו, לדלל את oligos phosphorylated ואת annealed מן התגובה לעיל עם מים (1:200) באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
   6. µG 5 תקציר של pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W וקטור עם 1.5 µL של אנזים הגבלה BbsI (10,000 יחידות/mL) באמצעות מאגר המתאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים כדי linearize זה עבור מצדו מאוחר יותר.
   7. לקחת צלחת טוב טרי 96 מתויג מצדו צלחת ולהוסיף 20 ng של BbsI מתעכל pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W וקטור באר אחת לכל מצדו sgRNA הרצוי. להוסיף 2 µL של oligos phosphorylated, annealed מהצלחת OligoMix מדולל .
   8. מוסיפים 1 µL 10 x T4 ליגאז מאגר µL 1 של האנזים T4 DNA ליגאז. פיפטה עם פיפטה רב-ערוצי ובעדינות דגירה המיקס מצדו בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
      הערה: ניתן לאחסן מצדו mixes ב-20 ° C עבור השלב שינוי מאוחר יותר.
   9. בינתיים, הפשרה 90 µL של כשיר מבחינה כימית e. coli תאים על הקרח 10 דקות לפני סוף השלב מצדו.
   10. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להפוך aliquots 10 µL של התאים המוסמכת כל טוב של צלחת נפרדת טוב 96.
   11. להוסיף את התערובת מצדו מהשלב 2.1.8 תגובה על תוך טוב המכיל תאי המוסמכת, פיפטה מעלה מטה בעדינות, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   12. פיפטה 5 µL של חיידקים-DNA לערבב ישירות מן התגובה לעיל לתוך 6. ובכן לוח המכיל LB-אגר עם 100 µg/mL אמפיצילין. חזור על כל התגובות טרנספורמציה.
   13. צלחת כל תגובה טרנספורמציה לתוך בנפרד שכותרתה טוב של צלחת 6-. טוב. מוסיפים כ 5-8 חרוזי זכוכית לכל טוב לנער את הצלחת כל 6-ובכן 8 – 10 פעמים בתנועה סיבובית.
   14. לבחור מושבות יחידה 1-2 מכל קידוח עם טיפ פיפטה µL 20 סטרילית, פסים זה מקום בזהירות עם תוויות ברורות על סטרילי 10 ס מצלחת פטרי עם אגר LB ו- 100 מ"ג/מ"ל אמפיצילין. אחרי שהתרוצץ המשקולת ליברות, פשוט להוציא את הטיפ משמש לשכפול ומבטא לתוך 3 מ ל LB-אמפיצילין המכיל במדיום mL 14 סיבוב התחתית התחתונה מסומן עם מספר שיבוט בקטריאלי המתאים.
   15. שלח את הצלחת חיידקי ישירות סנגר רצף עם פריימר לפנים יזם U6 אנושי.
   16. לאחר אישור רצף של sgRNAs משובטים, לטהר את הדנ א מהצינור 14 מ"ל המתאימים באמצעות ערכת הכנה מיני לפי הוראות היצרן.
   17. מודדים את ריכוז ואיכות כל המיני-preps עם ספקטרופוטומטרים. לנרמל בכל מיני להתכונן לכל ריכוז של 15 ng/µL ו פיפטה לתוך צלחת טוב 96 מתויג sgRNA צלחת שיבוטים.
       הערה: הצלחת הזו יכול להיות מאוחסן ב-20 ° C או להשתמש ישירות עבור הכנת וירוס.
2. בייצור נגיפי של המבנים sgRNA התמרה חושית
   1. לייצור של חלקיקים lentiviral sgRNA בתבנית 96-ובכן, בצע "shRNA/sgRNA/ORF תפוקה גבוהה ייצור ויראלי (96 טוב)" פרוטוקול של פלטפורמת ההפרעות גנטיות (GPP אינטרנט בפורטל) במכון ברוד (URL: https:// portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols).
   2. µL 200 של תגובת שיקוע ויראלי להעביר צינורות סטרילי ומקפיאים מיד ב-80 מעלות צלזיוס.
   3. יום-1: מעיל בתחתית שטוח רקמות ללא תרבות מטופלים 96 טוב צלחת עם 100 µL של קטע רקומביננטי fibronectin אנושי-ריכוז של µg/mL 10 בשכונה תרבות תא BSL2. לעטוף את הצלחת באמצעות גלישת תיאחז כדי למנוע אידוי אובדן ולהשאיר אותה על הספסל במשך הלילה.
   4. יום 0: להסיר את השבר רקומביננטי fibronectin אנושי מכל קידוח. להפשיר את תגובת שיקוע ויראלי של כל sgRNA בטמפרטורת החדר. להוסיף 50 µL של תגובת שיקוע ויראלי מהצינור כל אחד מצופה היטב של צלחת התמרה חושית. לסובב את הצלחת התמרה חושית ב x 1300 גרם במשך 90 דקות ב- 35 מעלות צלזיוס.
   5. לקראת סוף spinfection, נחשב MOLM13-Cas9 (שיבוט B3) תאים מן הבקבוק תרבות. השתמש 10,000 תאים לכל טוב בכרך µL 100. לספור את התאים על כל התמרה חושית הבארות, נפח מת התחשבות.
   6. לאחר spinfection 90 דקות, הסר את תגובת שיקוע כל הבארות באמצעות פיפטה רב-ערוצי התרגלו 50 µL לאט בהטיית לצלחת. להוסיף כל טוב לאט מחליק במורד משפת 100 µL התרבות של התאים המשובטים B3 MOLM13-Cas9.
   7. לסובב את הצלחת ב x 1,300 g למשך 2 דקות ב- 35 ° C לתת את התאים להתפשר על גבי התחתון. להעביר את הצלחת החממה כיתה של תרביות רקמה 37 º C.
   8. יום 1: הוספת µL 100 של בינוני טריים כל טוב המכיל sgRNA transduced Cas9-MOLM13 או Cas9-MLL-AF9 לוקמיה תאים כך שאמצעי האחסון בינוני הסופי 200 µL.

3. תחרותי צמיחה Assay

1. יום 3: 72 h (יום 3) לכתוב התמרה חושית, לבדוק את אחוז sgRNA המכיל תאים חיוביים BFP כל היטב על ידי cytometry זרימה (FACS). השתמש צבע הכדאיות תא כדי לסמן או לא לכלול תאים מתים מניתוח.
2. המשך מחדש יופיצ שיעור של התאים לתוך בארות חדשות בינונית טרייה לאחר כל ניתוח FACS למנוע יתר במהלך וזמינותו.
3. חזור על הניתוח FACS כל 2-3 ימים כדי לבדוק את חלקם היחסי של BFP חיובי (BFP + ve) תאים בהשוואה BFP עמיתיהם (BFP-ve) שלילי (איור 3). לנתח את אחוז BFP תאים חיוביים עבור כל נקודת זמן (באמצעות FlowJo או תוכנה דומה של ניתוח FACS).
   1. גרור קבצים Fcs עבור כל דגימה תוכנה FlowJo. לחץ פעמיים על כל קובץ דוגמא אחת, מגרש אבן חשופה נקודה של פיזור קדמי (FSC) לעומת הצד פיזור (האס) עם FSC על ציר והאס על ציר Y. שער כל התאים.
   2. לחץ פעמיים על התאים מגודרת, מניחים אותם על הכתם הכדאיות (על ציר Y) לעומת FSC גובה (H) או אזור (א) נקודה חשופה. שער הכדאיות כתם שלילי תאים (חיים).
   3. לחץ פעמיים על תאים חיים מגודרת, להתוות BFP (לאורך ציר Y) לעומת FSC (א) על ציר X. שער BFP + ve תאים. חלות כל השערים הללו כל הדגימות על-ידי גרירת המדגם הנבחר כל דוגמאות תחת לשונית קבוצה .
   4. לחץ על שולחן עורך לעשות טבלת ניתוח של כל הדגימות. גרור ספירת BFP + ve דוגמא אחת בטבלה ולחץ על לחצן תצוגה ב- שולחן עורך כדי ליצור דוח אצווה של כל הדגימות עם שולחן מציג את אחוז תאים BFP + ve . שמור את הטבלה xls.
4. לחשב את העלייה פרופורציונליים או ירידה % BFP תאים חיוביים בתוך האוכלוסייה תא חי לאורך זמן והשווה יחס זה ביחס של תאים חיוביים BFP sgRNAs שליטה (כגון לוציפראז, ביצים מקושקשות או GFP sgRNA).
5. להתוות את היחס שבין BFP תאים חיוביים עבור sgRNAs שונות כולל את gene (s) של הריבית וכן פקדי משתמש יום 3 כקו הבסיס.

תוצאות

במחקר שלנו, אנחנו קודם transduced את MOLM13 האנושית AML שורת התאים הנושאת רוברטסונית MLL-AF9 עם כייל גבוה וירוס קידוד פלסמיד lentiviral את Cas9-blasticidin. בידיים שלנו, בצובר ממוינת תאי MOLM13-Cas9 תציג את הביטוי Cas9 ברמה גבוהה על ידי סופג המערבי ואת גם לא לבצע היטב כאשר לבדיקה עבור ג'ין יעיל עריכה-באמצע...

Discussion

כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לביצוע של צמיחה תחרותי המבוססות על CRISPR-Cas9 assay לחקור את התפקיד של המועמד גנים ב- AML שורות תאים באמצעות cytometry זרימה ב- AML האדם/מאתר תאים (איור 5). מטרת וזמינותו היא לזהות את ההשפעה של ג'ין מחיקה על תחזוקה של התפשטות תאים AML מעל שבועיים עד שלושה שב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FLAG-M2 Antibody	sigma-aldrich	F3165, lot # SLBS3530V
Anti-mouse Antibody	Invitrogen	31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Fisher	34095
ChemiDoc Imaging System	BIO RAD	17001401
Sorvall Legend RT centrifuge	Thermo Scientific
Blasticidin	Thermo Fisher	R21001
SYTOX Red	Thermo Fisher	S34859
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
DMEM	Thermo Fisher	11965-092
RPMI	Thermo Fisher	11875-093
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
Fetal Bovine Serum (FBS)	SAFC	12303C
single gRNA vector	Addgene #67974	pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear extraction kit	sigma-alorich	NXTRACT
XtremeGENE 9	sigma-alorich	6365787001
Retronectin	Takara	T100B
Flow cytometer	BD Biosciences
T4 PNK	NEBioLabs	M0201S
T4 DNA ligation buffer	NEBioLabs	B0202S
T4 DNA Ligase enzyme	NEBioLabs	M0202S
Ampicillin	Fisher scientific	BP1760-25
LB agar	Fisher scientific	BP9724-500
LB Broth	Fisher scientific	BP9731-500
Qiagen mini-prep kit	Qiagen	27104
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher	NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant Murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant Murine M-CSF	Peprotech	315-02
Stable competent cells	NEBiolabs	C3040I
10 cm Tissue Culture dishes	Fisher Scientific	353003
Cell lysis solution	Qiagen	158906
Protein precipitation solution	Qiagen	158910
DNA hydration solution	Qiagen	158914
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
BbSI	New England BioLabs	R0539S
APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit	Genessee Scientific	42-138
Puromycin	Fisher scientific	BP2956100
50 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495949A
15 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495970C