Indagine delle dipendenze genetiche utilizzando dosaggi di concorrenza basati su CRISPR-Cas9

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un cluster regolarmente intervallate breve palindromo si ripete (CRISPR) CRISPR Cas9 metodo basato per indagine semplice e rapida del ruolo di geni candidati multipli nella proliferazione delle cellule di leucemia mieloide acuta (LMA) in parallelo. Questa tecnica è scalabile e può essere applicata in altre linee cellulari di cancro pure.

Abstract

Gene perturbazione studi sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo dei singoli geni nella patogenesi AML. Per la realizzazione completa del gene, molti di questi studi hanno fatto ricorso a modelli di knockout del gene complesso. Mentre questi studi con topi knockout offrono un sistema elegante e time-tested per indagare le relazioni genotipo-fenotipo, un metodo veloce e scalabile per la valutazione di geni candidati che gioca un ruolo nella proliferazione delle cellule AML o sopravvivenza nei modelli AML aiuterà ad accelerare l'interrogatorio parallela di più geni candidati. I recenti progressi nelle tecnologie di modifica del genoma hanno drammaticamente migliorato la nostra capacità di eseguire perturbazioni genetiche in una scala senza precedenti. Uno di questi sistemi di editing genomico è il metodo di CRISPR-Cas9-based che può essere utilizzato per apportare modifiche rapide ed efficaci nel genoma della cellula bersaglio. La facilità e la scalabilità di omissione del gene per CRISPR/Cas9-mediata rende una delle tecniche più attraente per l'interrogatorio di un gran numero di geni nelle analisi fenotipiche. Qui, presentiamo un'analisi semplice utilizzando rottura CRISPR/Cas9 mediato del gene combinata con saggi di alto-rendimento flusso cytometry-concorrenza basata per indagare il ruolo dei geni che possono svolgere un ruolo importante nella proliferazione o la sopravvivenza dell'essere umano e murine linee cellulari AML.

Introduzione

Degli ultimi decenni hanno visto numerosi sforzi di ricerca focalizzati sull'identificazione il contributo dei principali meccanismi molecolari nella patogenesi della leucemia mieloide acuta (AML). Tradizionalmente, rottura del gene in cellule di AML è stata eseguita utilizzando topi knock-out condizionale o short hairpin RNA (shRNA). Mentre i topi knockout offrono un sofisticato sistema per il controllo spazio-temporale di omissione del gene, generazione di topi knockout del gene è laborioso, lungo e costoso. Inoltre, gene-Ko utilizzando strategie di ricombinazione non è facilmente scalabile; Queste strategie non si prestano bene per l'interrogatorio di parecchi geni in parallelo. Dopo la scoperta di metodi di interferenza del RNA di colpo mRNAs endogeno utilizzando piccolo RNA interferente (siRNA) o shRNA, molti gruppi iniziato utilizzando tecniche di interferenza del RNA per indagare il ruolo dei geni specifici in AML. Poiché le cellule AML sia murine ed umane sono notoriamente difficili a transfect utilizzando metodi di trasfezione basata sui lipidi tradizionali, la maggior parte studia lentivirally autonomo o con codifica retrovirally shRNA per lo studio della funzione del gene in cellule di AML. La recente scoperta di cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) e l'associato nucleasi Cas (CRISPR-Cas9) ha rivoluzionato la gene-targeting tecnologie^1,2,3. Utilizzando CRISPR-Cas9, specifici geni o regioni genomiche possono essere eliminate, modificate o taggate con efficienza e semplicità. CRISPR Cas9-editing basato su gene ora sta emergendo come il metodo di scelta per indagare le relazioni genotipo-fenotipo in tipi cellulari diversi a causa della semplicità, efficacia e ampia applicabilità di questa tecnica. Metodi basati su CRISPR-Cas9 stanno diventando il metodo di scelta in AML, non solo per interrogare i singoli geni, ma anche come un modo di indirizzare i geni multipli in disposti o pooled schermi genetici finalizzati ad indagare diversi geni in parallelo come potenziale AML-dipendenze^4,5,6.

In questo manoscritto, descriviamo un'analisi semplice crescita competitiva per misurare l'impatto della rottura del gene sulla crescita delle cellule di AML, basato sulla stabile CRISPR-Cas9-mediated gene-modifica seguita da citometria a flusso ad alta velocità. Questo metodo è semplice, efficiente e scalabile per esperimenti di media-velocità di trasmissione per investigare il ruolo di parecchi geni in parallelo in cellule AML.

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Protocollo

1. generare cloni di linea delle cellule AML con alta espressione di Cas9 stabili e attivi

1. Produzione di Cas9 lentivirus
   1. Giorno 0: Piastra 4 x 10⁶ 293T cellule in 10 mL di DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS) e penicillina e L-Glutammina in un piatto di coltura del tessuto di 10cm in un livello 2 di biosicurezza (BSL2) certificata cappa di cultura cellulare. Mettere il piatto in un incubatore a 37 ° C.
   2. Giorno 1: Le cellule 293T placcato dovrebbero essere il 70 – 80% confluenti il giorno 1. Eseguire la transfezione utilizzando il seguente protocollo nel pomeriggio.
   3. Riscaldare il mezzo di transfezione, terreni di coltura e reagente di transfezione a temperatura ambiente. Scongelare tutti i plasmidi richiesti per la transfezione.
   4. Mix 9 µ g di psPAX2, 0,9 µ g di pMD2.G e 9 µ g di plasmidi pLenti-Cas9 con 500 µ l di terreno di transfezione in una provetta da 5 mL.
   5. Aggiungere 1,7 mL di mezzo di transfezione di un 14 mL provetta a fondo sferico. Aggiungere 57 µ l di reagente di transfezione direttamente nel mezzo di transfezione nel tubo per evitare di toccare la parete del tubo.
   6. Delicatamente aggiungere il mix di intero plasmide alla soluzione di reagente di transfezione e mescolare scuotendo leggermente il tubo sul lato. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20-30 min. Nel frattempo, è possibile modificare il mezzo dalla piastra 293T seminato.
   7. Aggiungere il mix di transfezione goccia a goccia alla piastra e scuotere delicatamente la piastra lateralmente per la miscelazione efficiente. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C.
   8. Giorno 2: Aspirare il supernatante dalla piastra di transfezione delicatamente tale che le cellule non sono disturbate o sloggiate dalla piastra. Scartare il surnatante. Aggiungere 10 mL di mezzo DMEM 10% fresco facendo scorrere delicatamente verso il basso dai lati della piastra per evitare di staccare le cellule.
   9. Giorno 3: Raccogliere il virus contenente surnatante dalla piastra di transfezione lentamente disegnandola in una siringa sterile 10cm. Dopo il supernatante viene raccolto nella siringa, collegare un filtro sterile 0,45 µM alla siringa e tenere la siringa e il filtro sopra un tubo conico in polipropilene 15ml fresco, sterile. Immergere delicatamente la siringa per filtrare il virus contenente surnatante attraverso il filtro 0,45 µM nella provetta conica 15 mL in polipropilene.
   10. Memorizzi il medium condizionato virale nelle aliquote di 2 mL ciascuno in 2 mL cryovials a-80 ° C.
2. Trasduzione di linee cellulari AML
   1. Giorno -1: Diluire 1 mg/mL di brodo di frammento ricombinante umano fibronectina a 10 µ g/mL con soluzione salina sterile tampone fosfato (PBS). Cappotto di una non-tessuto cultura trattati ben 6 piastra con 2 mL di soluzione di lavoro di 10 µ g/mL fibronectina umana ricombinante frammento in una cappa di cultura cellulare BSL2 approvato. Avvolgere la piastra in pellicola trasparente per evitare la perdita per evaporazione e conservare a temperatura ambiente durante la notte.
   2. Giorno 0: Scongelare il surnatante virale contenente Cas9. Aspirare la soluzione di frammento di fibronectina umana ricombinante completamente dalla piastra rivestita poco prima di spinfection. Aggiungere 2 mL di medium condizionato virale con Cas9 alla piastra e girarla a 1.300 x g per 90 minuti a 35 ° C. Questo aiuta le particelle virali allegare alla spinfected bene.
   3. Nel frattempo, contare le cellule essere transduced e spin-down 2 x 10⁶ cellule in un tubo conico in polipropilene da 15 mL. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 2 mL di terreno di coltura fresco.
   4. Dopo spinfection, rimuovere tutto il surnatante virale dal spinfected bene ed eliminare. Particelle retrovirali dal surnatante sono attaccate alla parte inferiore della spinfected bene. A questo bene, aggiungere le 2 x 10⁶ cellule risospese in 2 mL di terreno dal passaggio precedente.
   5. Girare la piastra nuovamente a 1.300 x g molto brevemente (1 – 2 min) sufficiente per permettere alle cellule di stabilirsi nella parte inferiore. Posizionare la piastra nuovamente dentro l'incubatrice e lasciare durante la notte per trasduzione con particelle virali spinfected attaccate al pozzo.
   6. Giorno 1: A seconda della densità delle cellule, aggiungere più terreno alle cellule trasdotte per evitare la crescita eccessiva.
   7. Giorno 2: Poiché il plasmide pLenti-Cas9 ha un indicatore di resistenza di Dyfed, aggiungere Consciousness ad una dose di 10 µ g/mL per trasdotte e untransduced (controllo) MOLM13 o cellule di leucemia del topo MLL-AF9 per la selezione di Cas9 che esprimono le cellule.
      Nota: Dyfed selezione delle cellule di leucemia MOLM13 o MLL-AF9 Cas9 trasdotte è considerato completo quando tutte le celle del controllo untransduced sono state eliminate. Per linee cellulari diversi da leucemia MOLM13 e MLL-AF9, una curva dose-risposta deve essere eseguita prima di questo esperimento che può essere impiegata una dose ottimale. Titolazione del surnatante virale può essere eseguita anche in caso di tariffe basse-trasduzione.
3. Clonare la selezione delle cellule che esprimono alta-Cas9.
   Nota: Abbiamo notato che in alcune linee cellulari AML, selezione clonale potrebbe non essere necessario: la maggior parte della popolazione Cas9-Consciousness selezionato già ha alta efficienza modifica del genoma. In questo caso, è possibile saltare il passaggio 1.3 e passare al passo 1.4 per valutare l'espressione Cas9 nelle cellule AML massa Cas9-Consciousness mediante western blotting. Sarebbe comunque importante valutare l'efficienza modifica del gene in quelle celle di massa Cas9-AML (passo 1,5) prima di procedere all'analisi della concorrenza. Congetturiamo che la selezione di cloni di singola alta-Cas9 riduce la variabilità di modifica del genoma, che è particolarmente importante quando si verifica un numero di diversa singola guida RNAs (sgRNAs).
   1. Eseguire una singola cellula sorta del Cas9-Consciousness selezionato MOLM13 e MLL-AF9 cellule di leucemia che d'ora in poi chiamate MOLM13-Cas9 e cellule di MLL-AF9-Cas9, rispettivamente, utilizzando un sorter FACS contenuto in un cappuccio BSL2 approvato. L'ordinamento può essere eseguita in 5 – 10 fondo tondo non-tessuto cultura trattata 96 pozzetti.
   2. Una volta singola MOLM13-Cas9 e cloni di MLL-AF9-Cas9 sono state raccolte e denominato singolarmente, espandere cloni di 10 – 20 10 µ g/ml di consciousness in terreni di coltura per garantire il mantenimento dell'espressione Cas9.
4. Espressione di verificare di stabile Cas9 proteina dall'immunoblotting.
   1. Rendere gli estratti nucleari di tutti i cloni di Dyfed selezionato della leucemia MOLM13 e MLL-AF9 utilizzando nucleare Kit di estrazione secondo il protocollo del produttore. Controllare l'espressione della proteina Cas9 utilizzando Anti-Flag M2 anticorpo dal Cas9 nel plasmide pLenti-Cas9 è collegato ad un epitopo Flag N-terminale.
   2. Caricare 50 µ g di proteina totale da ogni estratto nucleare sul 10% Bis-Tris del gel ed eseguire il gel a 120 V fino a bande superiore sono ben separati.
   3. Bloccare la membrana con soluzione al 5% latte nel buffer di TBST per 1 h.
   4. Incubare la membrana con 1:1,000 diluizione di anticorpo di Anti-Flag M2 ad una concentrazione finale di 1 µ g/mL a 4 ° C durante la notte.
   5. Giorno successivo, lavare la membrana con buffer di TBST e incubare con l'anticorpo secondario dei HRP coniugato anti-topo ad una diluizione di 1:5,000 (concentrazione finale di 0,16 µ g/mL) a temperatura ambiente per 1 h.
   6. Lavare la membrana accuratamente con TBST e sviluppare la macchia usando il substrato di ECL.
   7. Pick 3 – 4 cloni con la più alta espressione della proteina di Cas9 come visto mediante Western blotting per l'ulteriore analisi funzionale (Figura 1).
5. Garantendo un'elevata attività Cas9 in cloni selezionati
   1. Preparare il surnatante lentivirali da un vettore di codifica sgRNA con sgRNAs targeting per l'essere umano o del mouse AAVS1 luogo di approdo sicuro come descritto nel passaggio 1.1.
   2. Trasducono alto MOLM13 Cas9-esprimendo o MLL-AF9 leucemia cloni con il surnatante di vettori lentivirali sgRNA anti-AAVS1 utilizzando il metodo di spinfection sopra descritto. Selezionare con 2,5 µ g/mL con puromicina per 4 giorni.
   3. Purificare il DNA genomico dai cloni di leucemia MOLM13-Cas9 o MLL-AF9-Cas9 dopo selezione con puromicina insieme ai rispettivi controlli di selvaggio-tipo utilizzando il kit di estrazione del DNA genomico seguendo le istruzioni del produttore. Uso 50 ng di DNA come un modello per eseguire una PCR con il AAVS1_test_primers utilizzando 2 x mix master di Taq polimerasi e il programma PCR elencati nella tabella 1.
   4. Eseguire il prodotto PCR su un gel di agarosio al 2% e gel-purificare la band di 268 base pair utilizzando un kit di estrazione del gel secondo il protocollo del produttore. Sequenza di Sanger il gel purificato prodotto di PCR utilizzando il primer AAVS1_target-frag_F.
   5. Valutare l'efficienza di editing dal confronto tra il AAVS1 modificato e wildtype sequenze utilizzando strumenti web-based online (Figura 2).

2. clonazione e trasduzione di sgRNAs in cellule di AML-Cas9

1. Velocità media effettiva clonazione di sgRNAs
   1. Progettazione sgRNAs di 4 – 6 per il gene di interesse utilizzando un software di progettazione CRISPR basata sul web. Ci sono una serie di strumenti di progettazione CRISPR disponibili online come http://crispr.mit.edu/ che genera sequenze di sgRNA basato su una sequenza di DNA input.
      1. Compilare un informazioni appropriate nei campi con gli asterischi. Fare clic sul genoma bersaglio per sgRNA design. Incollare alla sequenza di destinazione nella casella sequenza e fare clic sul pulsante Invia .
   2. Per la clonazione nella pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plasmide di espressione sgRNA W, anteporre i nucleotidi "CACC" al senso oligo e "AAAC" per l'inverso oligo antisenso completato prima di ordinare. I oligos ordine premiscelato di senso e antisenso in una piastra a 96 pozzetti etichettati Oligo-Mix da un'azienda di sintesi del oligonucleotide.
      Nota: Abbiamo fatto uso del pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plasmide W, che è il sito di restrizione BbsI per sgRNA clonazione. Nel caso in cui vengono utilizzati altri plasmidi di espressione sgRNA, strapiombi utilizzati per i oligonucleotides sgRNA bisogno di essere cambiato di conseguenza.
   3. Prendere una separato piastra a 96 pozzetti fondo U etichettata Piastra di ricottura. Fare un mix master di 1 µ l T4 PNK, 1 µ l di tampone di legatura del DNA T4 10x e 6 µ l di acqua per reazione di ricottura.
   4. Aggiungere 8 µ l di master mix in ciascun pozzetto della piastra ricottura. Aggiungere 1 µ l di 100 µM ciascuna, senso e oligo antisenso (o 2 µ l di misto senso-anti-senso oligos) per il mix master. Pipettare 2 – 3 volte delicatamente per amalgamare bene, far girare la piastra brevemente per ottenere le miscele di fondo dei pozzetti.
   5. Utilizzare il seguente programma di ricottura su una macchina PCR: 30 min a 37 ° C, 2 min 30 s a 95 ° C seguita da un raffreddamento lento a 22 ° C alla velocità di 0,1 ° C/s. Dopo la ricottura, prendere una piastra a 96 pozzetti fresca etichettata OligoMix diluito. In questo piatto, diluire i oligos fosforilati e temprato dalla reazione sopra con acqua (1: 200) usando una pipetta multicanale.
   6. Digest 5 µ g di pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - vettore W, con 1,5 µ l di enzima di restrizione BbsI (10.000 unità/mL), utilizzando un amplificatore adatto a 37 ° C per 2 h per linearizzare la per legatura più tardi.
   7. Prendere un piatto ben fresco 96 etichettati Piastra di legatura e aggiungere 20 ng della BbsI digerito pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - vettore di W da un pozzetto per la legatura sgRNA desiderato. Per questo, è necessario aggiungere 2 µ l di oligos fosforilato, temprato dalla piastra OligoMix diluito .
   8. Aggiungere 1 µ l di tampone di ligasi x T4 10 e 1 µ l di enzima T4 DNA ligasi. Delicatamente la pipetta con una pipetta multicanale e incubare il mix di legatura a temperatura ambiente per 2 h.
      Nota: Miscele di legatura sono memorizzabili a-20 ° C per il passaggio di trasformazione più tardi.
   9. Nel frattempo, disgelo 90 µ l di chimicamente competente Escherichia coli cellule su ghiaccio 10 min prima della fine della fase di legatura.
   10. Usando una pipetta multicanale, fare 10 aliquote µ l delle cellule competenti in ciascun pozzetto di una piastra ben 96 separata.
   11. Aggiungere la miscela di legatura da passo 2.1.8 nel bene contenente le cellule competenti, pipetta su e giù dolcemente e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   12. Pipettare 5 µ l della miscela di batteri-DNA direttamente dalla reazione di cui sopra in un 6 piastra ben contenente LB-agar con 100 µ g/mL di ampicillina. Ripetere per ciascuna delle reazioni di trasformazione.
   13. Ogni reazione di trasformazione in un separatamente etichettati bene di una piastra a 6 pozzetti della piastra. Aggiungere circa 5 – 8 perle di vetro a ogni bene e scuotere la piastra intera 6 pozzetti 8 – 10 volte in un movimento circolare.
   14. Scegli 1 – 2 singole colonie da ogni pozzetto con una pipetta sterile 20 µ l e striscia in un spot accuratamente etichettato su un sterile 10cm capsula di Petri con LB agar e ampicillina 100mg/mL. Dopo striature nella piastra LB, semplicemente espellere la punta utilizzata per clone striature in 3 mL di LB-ampicillina contenente il mezzo in un 14 mL provetta a fondo sferico contrassegnato con il numero corrispondente di clone batterica.
   15. Inviare la piastra batterica direttamente su Sanger sequenziamento con il primer forward del promotore umano U6.
   16. Dopo la conferma di sequenza di sgRNAs clonato, purificare il DNA dal tubo 14 mL corrispondenti utilizzando un kit di mini-preparazione secondo le istruzioni del produttore.
   17. Misurare la concentrazione e la qualità di ogni mini-preps con uno spettrofotometro. Normalizzare ogni mini-prep a una concentrazione di 15 ng / µ l e pipette in una piastra ben 96 etichettati sgRNA piastra di cloni.
       Nota: Questo piatto può essere conservato a-20 ° C o utilizzato direttamente per la preparazione di virus.
2. Produzione virale di sgRNA costrutti e trasduzione
   1. Per la produzione di particelle lentivirali sgRNA nel formato 96 pozzetti, seguire il "shRNA/sgRNA/ORF High Throughput produzione virale (ben 96)" protocollo dalla genetica piattaforma di perturbazione (GPP web Portal) del Broad Institute (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/public/Resources/Protocols).
   2. Trasferire 200 µ l del surnatante virale in provette sterili e congelare a-80 ° C immediatamente.
   3. Giorno -1: Cappotto una piastra ben 96 di coltura trattata fondo piatto Non-tessuto con 100 µ l del frammento ricombinante fibronectina umana ad una concentrazione di 10 µ g/mL in una cappa di cultura cellulare BSL2. Avvolgere la piastra utilizzando pellicola trasparente per evitare la perdita di evaporazione e lasciarlo tutta la notte al banco.
   4. Giorno 0: Rimuovere il frammento di fibronectina umana ricombinante da ogni pozzetto. Scongelare il surnatante virale di ogni sgRNA a temperatura ambiente. Aggiungere 50 µ l del surnatante virale da ciascuna provetta a ciascuno rivestito bene della piastra di trasduzione. Girare la piastra di trasduzione a 1.300 x g per 90 minuti a 35 ° C.
   5. Verso la fine del spinfection, contare le cellule MOLM13-Cas9 (clone B3) dal matraccio di cultura. Utilizzare 10.000 cellule per pozzetto in 100 µ l di volume. Contare le celle per tutti i pozzi di trasduzione, tenendo conto di volume morto.
   6. Dopo il spinfection di 90 min, rimuovere il surnatante da tutti i pozzetti usando una pipetta multicanale regolata a 50 µ l lentamente inclinando la piastra. Aggiungere 100 µ l della coltura delle cellule clone B3 MOLM13-Cas9 per ogni bene lentamente scivolare giù dal cerchio.
   7. Girare la piastra a 1.300 x g per 2 minuti a 35 ° C e lasciare che le celle di depositarsi sul fondo. Trasferire la piastra per la coltura del tessuto grado Incubatore 37 ° C.
   8. Giorno 1: Aggiungere 100 µ l di terreno nuovo per ogni sgRNA contenente trasdotte Cas9-MOLM13 o Cas9-MLL-AF9 leucemia cellule tale che il volume medio finale è di 200 µ l.

3. saggio di crescita competitivo

1. Giorno 3: 72 h (giorno 3) post di trasduzione, controllare la percentuale di sgRNA contenenti cellule positive di BFP in ciascun pozzetto mediante citometria a flusso (FACS). Utilizzare un colorante di attuabilità delle cellule per contrassegnare ed escludere le cellule morte dall'analisi.
2. Continuare a ri-placcatura una proporzione delle cellule in nuovi pozzi con medium fresco dopo ogni analisi FACS per evitare la crescita eccessiva durante il dosaggio.
3. Ripetere l'analisi di FACS ogni 2 – 3 giorni per controllare la proporzione relativa delle cellule positive (BFP + ve) di BFP rispetto alla controparte (BFP-ve) negativa BFP (Figura 3). Analizzare la percentuale di cellule positive di BFP per ciascun punto di tempo (usando il FlowJo o simile software di analisi di FACS).
   1. Trascinare i file Fcs per ogni campione al software FlowJo. Fare doppio clic su qualsiasi file di un campione e tracciare una macchia del puntino di forward scatter (FSC) vs lato a dispersione (SSC) con FSC su asse X e SSC sull'asse Y. Tutte le celle del cancello.
   2. Fare doppio clic sulle celle con cancello e tracciarle su macchia di redditività (sull'asse Y) vs FSC altezza (H) o macchia del puntino di zona (A). Cancello l'attuabilità macchia cellule negative (dal vivo).
   3. Fare doppio clic su cellule vive con cancello e trama BFP (sull'asse Y) vs FSC (A) su asse X. Gate BFP + ve cellule. Applicare tutti questi cancelli a tutti i campioni trascinando il campione selezionato per Tutti i campioni sotto scheda gruppo .
   4. Fare clic su Editor di tabelle per fare un tavolo di analisi di tutti i campioni. Trascinare conteggio BFP + ve da un campione nella tabella e fare clic sul pulsante di visualizzazione nell' Editor tabella per creare un report di batch di tutti i campioni con una tabella che mostra la percentuale di cellule BFP + ve . Salvare la tabella come un file xls.
4. Calcolare il proporzionale aumento o diminuzione cellule positive di BFP % all'interno della popolazione di cellule vive nel tempo, confrontare questo rapporto il rapporto delle cellule positive di BFP nel sgRNAs di controllo (ad esempio luciferasi, uova strapazzate o GFP sgRNA).
5. Tracciare il rapporto delle cellule positive di BFP per i diversi sgRNAs tra cui i geni di interesse, nonché i controlli utilizzando il giorno 3 come base di riferimento.

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Risultati

Nel nostro studio, abbiamo transduced in primo luogo la linea umana AML cellulare di MOLM13 che porta la traslocazione MLL-AF9 con alto-titolo virus codifica il plasmide lentivirale Cas9-Consciousness. Nelle nostre mani, alla rinfusa indifferenziati MOLM13-Cas9 cellule non venivano visualizzate alto livello Cas9 espressione mediante Western blotting e inoltre non hanno eseguito bene quando analizzati per efficiente gene modifica-utilizzando il metodo descritto in precedenza

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Discussione

In questo manoscritto, descriviamo un protocollo dettagliato per lo svolgimento di un'analisi di crescita competitiva basati su CRISPR-Cas9 per studiare il ruolo di geni candidati in linee cellulari AML mediante citometria a flusso in cellule di AML umano/murino (Figura 5). L'obiettivo del test è di identificare l'effetto della delezione del gene sulla manutenzione di proliferazione delle cellule AML oltre due o tre settimane su scala medio-velocità di trasmissione. Alcuni passaggi critici...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
FLAG-M2 Antibody	sigma-aldrich	F3165, lot # SLBS3530V
Anti-mouse Antibody	Invitrogen	31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Fisher	34095
ChemiDoc Imaging System	BIO RAD	17001401
Sorvall Legend RT centrifuge	Thermo Scientific
Blasticidin	Thermo Fisher	R21001
SYTOX Red	Thermo Fisher	S34859
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
DMEM	Thermo Fisher	11965-092
RPMI	Thermo Fisher	11875-093
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
Fetal Bovine Serum (FBS)	SAFC	12303C
single gRNA vector	Addgene #67974	pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear extraction kit	sigma-alorich	NXTRACT
XtremeGENE 9	sigma-alorich	6365787001
Retronectin	Takara	T100B
Flow cytometer	BD Biosciences
T4 PNK	NEBioLabs	M0201S
T4 DNA ligation buffer	NEBioLabs	B0202S
T4 DNA Ligase enzyme	NEBioLabs	M0202S
Ampicillin	Fisher scientific	BP1760-25
LB agar	Fisher scientific	BP9724-500
LB Broth	Fisher scientific	BP9731-500
Qiagen mini-prep kit	Qiagen	27104
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher	NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant Murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant Murine M-CSF	Peprotech	315-02
Stable competent cells	NEBiolabs	C3040I
10 cm Tissue Culture dishes	Fisher Scientific	353003
Cell lysis solution	Qiagen	158906
Protein precipitation solution	Qiagen	158910
DNA hydration solution	Qiagen	158914
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
BbSI	New England BioLabs	R0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit	Genessee Scientific	42-138
Puromycin	Fisher scientific	BP2956100
50 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495949A
15 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495970C