Untersuchung der genetischen Abhängigkeiten mit CRISPR-Cas9-Wettbewerb-Assays

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt eine gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt (CRISPR) CRISPR-Cas9-basierte Methode für eine einfache und rasche Untersuchung der Rolle der mehrere Kandidaten-Gene in der akuten myeloischen Leukämie (AML) Zellproliferation in Parallel. Diese Technik ist skalierbar und kann in anderen Krebszelllinien angewendet werden.

Zusammenfassung

Gen Störung Studien sind weitgehend benutzt worden, um die Rolle einzelner Gene in AML-Pathogenese zu untersuchen. Für das komplette gen Störung erreichen, haben viele dieser Studien gemacht komplexe gen Knockout Modelle verwenden. Während dieser Studien mit Knockout-Mäusen eine elegante und bewährte System zur Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehung bieten, eine schnelle und skalierbare Methode zur Bewertung von Kandidatengenen, die spielen eine Rolle bei der AML Zellproliferation oder Überleben in AML Modelle hilft die parallele Abfrage des mehrere Kandidaten-Gene zu beschleunigen. Jüngste Fortschritte in der Genom-Bearbeitung Technologien haben unsere Leistungsfähigkeit genetische Störungen in nie gekanntem Ausmaß dramatisch verbessert. Ein solches System der Genom-Bearbeitung ist die CRISPR-Cas9-basierte Methode, die rasche und wirksame Änderungen im Genom Ziel-Zelle verwendet werden kann. Die Einfachheit und Skalierbarkeit der CRISPR/Cas9-vermittelte gen-Löschung macht es eine der attraktivsten Techniken für die Befragung einer Vielzahl von Genen in phänotypische Tests. Hier stellen wir einen einfache Assay mit CRISPR/Cas9 vermittelte gen-Störung kombiniert mit Hochdurchsatz-Flow-Zytometrie-based Wettbewerb Assays, um die Rolle der Gene, die eine wichtige Rolle bei der Verbreitung spielen kann oder das Überleben der Menschen zu untersuchen und murine AML-Zell-Linien.

Einleitung

Die letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Forschungsanstrengungen konzentriert sich auf die Ermittlung des Beitrags der wichtigsten molekularen Signalwege in der Pathogenese der akuten myeloischen Leukämie (AML) gesehen. Traditionell wurde gen-Störung in AML Zellen mit bedingter Knockout-Mäusen oder kurze Haarnadel RNA (ShRNA) durchgeführt. Knockout-Mäusen bieten ein ausgeklügeltes System für die räumlich-zeitliche Steuerung von gen-Löschung, ist Generierung von gen-Knockout-Mäusen arbeitsintensiv, zeitaufwändig und teuer. Darüber hinaus gen-Knockouts mit Rekombination Strategien ist nicht leicht skalierbar; Diese Strategien eignen nicht sich gut für die Befragung mehrerer Gene parallel. Nach der Entdeckung der RNA Interferenz-Methoden, um Knock-down endogenen mRNAs mit kleinen interferierende RNA (SiRNA) oder ShRNA begannen viele Gruppen mit RNA Interferenz Techniken, um die Rolle bestimmter Gene in AML zu untersuchen. Da murine und menschlichen AML-Zellen sind notorisch schwierig zu transfizieren, mit traditionellen Lipid-basierte Transfektion Methoden, die meisten Studien angestellt lentivirally oder retrovirally-codierte ShRNA für Genfunktion in AML Zellen zu studieren. Die jüngste Entdeckung der gruppierten regelmäßig dazwischen kurzer palindromische Wiederholungen (CRISPR) und die zugehörigen Cas Nukleasen (CRISPR-Cas9) hat gen-targeting Technologien^1,2,3revolutioniert. CRISPR-Cas9 verwenden, können bestimmte Gene oder genomische Regionen gelöscht, bearbeitet oder mit dem Stichwort Effizienz und Benutzerfreundlichkeit. CRISPR-Cas9-basierte gen-Bearbeitung taucht nun als die Methode der Wahl für die Untersuchung von Genotyp-Phänotyp-Beziehungen in unterschiedlichen Zelltypen aufgrund der Einfachheit, die Wirksamkeit und die breite Anwendbarkeit dieser Technik. CRISPR-Cas9-basierte Methoden sind auch immer die Methode der Wahl in AML, nicht nur für Abfragen einzelner Gene, sondern auch als eine Möglichkeit, mehrere Gene in angeordneten oder zusammengefasste genetische Schirme Ziel angestrebt untersucht mehrere Gene parallel als Potenzial AML-Abhängigkeiten^4,5,6.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine einfache Konkurrenzfähigkeit Test zur Messung der Auswirkungen von gen-Störung auf das Wachstum der AML Zellen, basierend auf stabile CRISPR-Cas9-vermittelten gen-Bearbeitung gefolgt von Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie. Diese Methode ist einfach, effizient und skalierbar bis Medium-Durchsatz Experimente zur Untersuchung der Rolle von mehreren Genen in AML Zellen parallel.

Protokoll

1. Erzeugung von AML Linie Zellklonen mit hohe Expression von stabilen und aktive Cas9

1. Produktion von Cas9 lentivirus
   1. Tag 0: Platte 4 x 10⁶ 293T Zellen in 10 mL DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und Penicillin und L-Glutamin in einer 10 cm Gewebe Kulturschale in einem Biosafety Level 2 (BSL2) zertifiziert Zelle Kultur Haube. Legen Sie die Schale in einem Inkubator 37 ° C.
   2. Tag 1: Die vergoldeten 293T Zellen sollte 70 – 80 % Zusammenfluss am 1. Tag. Führen Sie die Transfektion mit das folgende Protokoll am Nachmittag.
   3. Erwärmen Sie die Transfektion Medium, Kultur, Medien und Transfection Reagens auf Raumtemperatur. Alle erforderlichen Plasmide zur Transfektion Auftauen.
   4. Mix 9 µg psPAX2, 0,9 µg pMD2.G und 9 µg von pLenti-Cas9 Plasmide mit 500 µL Transfektion Medium in eine 5 mL-Tube.
   5. 14 mL Runde Unterrohr 1,7 mL Transfektion Medium hinzufügen. Fügen Sie 57 µL Transfection Reagens direkt in die Transfektion Medium in das Rohr zu vermeiden, berühren die Wand des Rohres.
   6. Sanft Transfektion Reagenzlösung die gesamte Plasmid-Mischung hinzu und mischen Sie durch leichtes Klopfen die Röhre auf der Seite. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20-30 min. Unterdessen verändern Sie das Medium von der kernigen 293T Platte.
   7. Fügen Sie die Transfektion Mischung tropfenweise hinzu, bis auf den Teller und schütteln Sie die Platte seitlich für effizientes Mischen. Legen Sie die Platte in einem Inkubator 37 ° C.
   8. Tag 2: Aspirieren des Überstands von der Transfektion Platte vorsichtig so, dass die Zellen nicht gestört oder von der Platte vertrieben. Verwerfen Sie den überstand. Fügen Sie 10 mL frisches 10 % DMEM Medium durch Abrutschen sanft von den Seiten der Platte zu vermeiden, die Zellen verdrängen.
   9. Tag 3: Sammeln Sie das Virus mit Überstand von der Transfektion Platte langsam in eine sterile Spritze 10 cm zeichnen. Nachdem der Überstand in die Spritze gesammelt, die Spritze beimessen Sie ein Sterilfilter 0,45 µM und halten Sie die Spritze und Filter über eine frische, sterile 15 mL Polypropylen konischem Rohr. Vorsichtig tauchen die Spritze um das Virus mit Überstand durch den 0,45 µM-Filter in der 15 mL Polypropylen konischem Rohr zu filtern.
   10. Speichern Sie die viral bedingte Medium in Aliquote von 2 mL in 2 mL Cryovials bei-80 ° C.
2. Transduktion von Zelllinien AML
   1. Tag-1: Verdünnen Sie 1 mg/mL rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment Lager um 10 µg/mL mit sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Mantel einer Gewebe-Kultur behandelt 6-well-Platte mit 2 mL 10 µg/mL rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment funktionierende Lösung in einer BSL2 genehmigt Zelle Kultur Kapuze. Wickeln Sie die Platte in Klarsichtfolie um Verdunstung und bei Raumtemperatur lagern über Nacht zu vermeiden.
   2. Tag 0: Auftauen des viralen Überstands mit Cas9. Aspirieren der rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment Lösung vollständig von der beschichteten Platte kurz vor Spinfection. Fügen Sie 2 mL viral bedingte Medium mit Cas9 auf den Teller und drehen Sie es 1.300 x g für 90 min bei 35 ° C. Dadurch werden die Viruspartikel, die Spinfected gut zu befestigen.
   3. Inzwischen zählen die Zellen ausgestrahlt werden und Spin-down 2 x 10⁶ Zellen in einem 15 mL Polypropylen konische Rohr. Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen das Pellet in 2 mL frische Nährmedien.
   4. Nach Spinfection auch die Spinfected den viralen überstand entfernen und entsorgen. Retroviralen Partikel aus der Überstand sind auch am unteren Rand der Spinfected befestigt. Nun, dazu die 2 x 10⁶ Zellen in 2 mL Medium vom Schritt oben Nukleinsäuretablette.
   5. Drehen Sie die Platte wieder auf 1.300 X g sehr kurz (1-2 min) ausreicht, um die Zellen am unteren niederzulassen. Die Platte wieder in den Inkubator und lassen Sie über Nacht für die Transduktion mit der Spinfected Viruspartikel an dem Brunnen befestigt.
   6. 1. Tag: Je nach Zelldichte, fügen Sie mehr Medium zu den transduced Zellen Überwucherung zu vermeiden hinzu.
   7. 2. Tag: Seit das pLenti-Cas9-Plasmid Blasticidin Widerstand Marker, fügen Sie Blasticidin bei einer 10 µg/mL Dosis ausgestrahlt und untransduced (Steuerung) MOLM13 oder Maus MLL-AF9-Leukämie-Zellen für die Auswahl der Cas9 mit dem Ausdruck Zellen hinzu.
      Hinweis: Blasticidin Auswahl an die Cas9 ausgestrahlt MOLM13 oder MLL-AF9 Leukämie-Zellen gilt als abgeschlossen, wenn alle untransduced Kontrollzellen beseitigt worden sind. Für Zell-Linien als MOLM13 und MLL-AF9 Leukämie muss eine Dosis-Antwort-Kurve vor dieses Experiment durchgeführt werden, so dass eine optimale Dosis eingesetzt werden kann. Titration von der viralen überstand kann auch bei niedrig-Transduktion durchgeführt werden.
3. Auswahl von High-Cas9 mit dem Ausdruck ihrer Zellen zu klonen.
   Hinweis: Uns ist aufgefallen, dass in einigen AML Zelllinien Klon Auswahl möglicherweise nicht notwendig: der größte Cas9-Blasticidin ausgewählt Bevölkerung bereits hat hocheffiziente Genom-Bearbeitung. In diesem Fall ist es möglich, Schritt 1.3 überspringen und fahren Sie mit Schritt 1.4 Cas9 Ausdruck in der Masse Cas9-Blasticidin AML Zellen durch westliche Beflecken zu beurteilen. Es wäre noch wichtig, gen-Bearbeitung Effizienz in diesen Massen Cas9-AML-Zellen (Schritt 1.5) bevor Sie fortfahren, die Wettbewerb-Assays zu bewerten. Wir vermuten, dass die Auswahl der einzelnen High-Cas9 Klone die Genom-Bearbeitung Variabilität, die besonders wichtig ist bei der Prüfung einer Reihe von verschiedenen einzelnen Guide RNAs (SgRNAs) reduziert.
   1. Führen Sie eine einzelne Zelle Art der Cas9-Blasticidin über einen FACS-Sorter in einer BSL2 genehmigt Haube enthaltenen MOLM13 und MLL-AF9 Leukämiezellen bezeichnet MOLM13-Cas9 und MLL-AF9-Cas9 Zellen, bzw. ausgewählt. Sortieren kann in 5 – 10 Rundboden Gewebe-Kultur behandelte 96 well Platten durchgeführt werden.
   2. Einmal einzelne MOLM13-Cas9 und MLL-AF9-Cas9 Klone kommissioniert wurden und einzeln genannt, erweitern Sie 10 – 20 Klone mit 10 µg/mL Blasticidin in Kulturmedien, Cas9 Ausdruck zu gewährleisten.
4. Ausdruck von stabilen Cas9 Protein durch Immunoblotting überprüfen.
   1. Nukleare Extrakte der Blasticidin ausgewählt-Klone von MOLM13 und MLL-AF9 Leukämie mit nuklearen Extraction Kit entsprechend des Herstellers Protokoll zu machen. Überprüfen Sie die Cas9-Protein-Expression mit Anti-Flag M2 Antikörper seit der Cas9 in das Plasmid pLenti-Cas9 mit einer N-terminalen Flagge Epitop verknüpft ist.
   2. Laden Sie 50 µg Gesamt-Protein aus jeder nukleare Extrakt auf 10 % Bis-Tris gel und das Gel bei 120 V laufen, bis die oberen Bänder sind gut getrennt.
   3. Blockieren Sie die Membran mit 5 % Milchlösung in TBST Puffer für 1 h.
   4. Inkubieren Sie die Membran mit 1:1,000 Verdünnung von Anti-Flag M2 Antikörper auf eine Endkonzentration von 1 µg/mL bei 4 ° C über Nacht.
   5. Am nächsten Tag waschen Sie die Membran mit TBST Puffer und inkubieren Sie mit HRP konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper zu einer Verwässerung des 1:5,000 (Endkonzentration von 0,16 µg/mL) bei Raumtemperatur für 1 h.
   6. Die Membran mit TBST gründlich zu waschen und den Fleck mit ECL-Substrat zu entwickeln.
   7. Wählen Sie 3 – 4 Klone mit die höchste Protein-Expression von Cas9, wie gesehen von Western blotting für weitere Funktionsanalyse (Abbildung 1).
5. Sicherstellung hohen Cas9 Aktivität in ausgewählten Klone
   1. Bereiten Sie Lentivirale Überstand aus einer SgRNA-encoding-Vektor mit Ausrichtung auf das menschliche SgRNAs oder Maus AAVS1 Safe-Harbor Locus wie in Schritt 1.1 beschrieben.
   2. Transduzieren oben Cas9 exprimierenden MOLM13 oder MLL-AF9 Leukämie-Klone mit der Anti-AAVS1 SgRNA Lentivirale überstand die oben beschriebene Spinfection-Methode verwenden. Wählen Sie mit 2,5 µg/mL Puromycin für 4 Tage.
   3. Genomischen DNA aus der MOLM13-Cas9 oder MLL-AF9-Cas9 Leukämie-Klone nach Puromycin Auswahl zusammen mit entsprechenden Wildtyp Steuerelemente mit dem Genomic DNA Extraktion Kit gemäß Herstellervorschrift zu reinigen. Einsatz 50 ng DNA als Vorlage eine PCR mit den AAVS1_test_primers mit 2 x master-Mix von Taq Polymerase und in Tabelle 1aufgeführten PCR-Programm ausführen.
   4. Führen Sie das PCR-Produkt auf einem 2 % Agarosegel und reinigen Sie Gel zu die 268 Basenpaaren Band mit einem Gel Extraction Kit entsprechend des Herstellers Protokoll. Sanger Sequenz das Gel gereinigt PCR-Produkt mit Hilfe des AAVS1_target-Frag_F-Primers.
   5. Bewerten Sie Bearbeitung Effizienz durch den Vergleich der AAVS1 bearbeitet und Wildtyp-Sequenzen mit online-Web-basierte Tools (Abbildung 2).

2. Klonen und Transduktion von SgRNAs in AML-Cas9 Zellen

1. Medium-Durchsatz Klonen von sgRNAs
   1. 4 – 6 SgRNAs für das gen des Interesses mit einem Web-basierten CRISPR-Design-Software zu entwerfen. Es sind eine Reihe von CRISPR-Design-Tools online verfügbar wie beispielsweise http://crispr.mit.edu/ die SgRNA Sequenzen generieren auf eine Eingabe DNA-Sequenz beruhen.
      1. Geben Sie einen entsprechenden Informationen in Felder mit Sternchen. Klicken Sie auf das Ziel-Genom für SgRNA Design. Fügen Sie die Zielsequenz im Feld Sequenz ein , und klicken Sie auf die Schaltfläche " senden ".
   2. Für das Klonen in der pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W SgRNA Expressionsplasmid, die Nukleotiden "CACC" Sinn Oligo und "AAAC" auf der Rückseite ergänzt antisense Oligo voranstellen, vor der Bestellung. Bestellung vorgemischt und Anti-Sinn Oligos in eine 96-Well-Platte gekennzeichnet Oligo-Mix aus einer Oligonukleotid-Synthese-Unternehmen.
      Hinweis: Wir haben gemacht, Verwendung von pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W Plasmid, das Ortsbild BbsI Einschränkung zum Klonen von SgRNA hat. Für den Fall, dass andere SgRNA Ausdruck Plasmide verwendet werden, müssen die Überhänge für SgRNA Oligonukleotide verwendet entsprechend geändert werden.
   3. Nehmen Sie eine separate U 96-Well Bodenplatte Glühen Plattegekennzeichnet. Machen Sie einen master-Mix von 1 µL T4 PNK, 1 µL 10 x T4 DNA-Ligatur Puffer und 6 µL Wasser pro Reaktion glühen.
   4. Jede Vertiefung der Glühen Platte 8 µL des master-Mix hinzufügen. 1 µL von 100 µM, Sinn und antisense Oligo (oder 2 µL der gemischten Gefühl-Anti-Sense-Oligos) zu den master-Mix hinzufügen. 2 – 3 Mal Pipette vorsichtig gut mischen, drehen Sie die Platte kurz um die Mixe auf den Boden des Brunnen zu erhalten.
   5. Verwenden Sie das folgende Programm Glühen auf einer PCR-Maschine: 30 min bei 37 ° C, 2 min 30 s bei 95 ° C gefolgt von langsame Abkühlung auf 22 ° C in Höhe von 0,1 ° C/s. Nehmen Sie nach Tempern eine frische 96-Well-Platte Verdünnt OligoMixgekennzeichnet. In dieser Platte Verdünnen der phosphorylierten und geglühten Oligos aus der oben genannten Reaktion mit Wasser (1: 200) mit einer Mehrkanal-Pipette.
   6. Digest 5 µg des pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W-Vektor mit 1,5 µL BbsI Restriktionsenzym (10.000 Einheiten/mL) mit einer entsprechenden Puffer bei 37 ° C für 2 h es für später Ligatur linearisieren.
   7. Nehmen Sie frische 96-well-Platte, Ligation Platte etikettiert und fügen 20 ng der BbsI verdaut pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W-Vektor zu einem Brunnen pro gewünschten SgRNA Ligatur. Dazu fügen Sie 2 µL der phosphorylierten, geglühten Oligos aus Verdünnt OligoMix Platte.
   8. Fügen Sie 1 µL 10 x T4 Ligase Puffer und 1 µL T4 DNA-Ligase-Enzym. Vorsichtig mit einer Mehrkanal-Pipette pipette und den Ligatur-Mix auf 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
      Hinweis: Ligatur-Mischungen können bei-20 ° C für die Transformationsschritt später gespeichert werden.
   9. Unterdessen Tauwetter 90 µL chemisch kompetenten E. Coli Zellen auf Eis 10 min vor Ende der Ligatur Schritt.
   10. Mit einer Mehrkanal-Pipette, machen Sie 10 µL-Aliquots der zuständigen Zellen in jede Vertiefung eine separate 96-well-Platte.
   11. Die Ligatur Mischung aus Schritt 2.1.8 in die gut mit den zuständigen Zellen, Pipette rauf und runter sanft hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   12. Pipette 5 µL des Bakterien-DNA-Mix direkt aus den oben genannten Reaktionen in einem 6 gut Platte mit LB-Agar mit 100 µg/mL Ampicillin. Wiederholen Sie für jede der Umwandlung Reaktionen.
   13. Jede Transformation Reaktion in gesondert gekennzeichneten gut von einem 6-Well-Platte-Platte. Fügen Sie ca. 5 – 8 Glasperlen zu jedem gut und schütteln die ganze 6-Well-Platte 8 – 10 Mal in einer kreisförmigen Bewegung.
   14. Wählen Sie 1 – 2 einzelne Kolonien aus jedem Brunnen mit einer sterilen 20 µL Pipettenspitze und Streifen sie in eine sorgfältig gekennzeichneten Stelle auf eine sterile 10 cm Petrischale mit LB-Agar und 100 mg/mL Ampicillin. Nach Schlieren in der LB-Platte, einfach Auswerfen der Spitze verwendet für Klon Streifen in 3 mL LB Ampicillin enthaltenden Medium in einer 14 mL Runde Unterrohr mit der entsprechenden bakteriellen Klon-Nummer gekennzeichnet.
   15. Senden Sie die bakterielle Platte direkt für Sanger Sequenzierung mit menschlichen U6 Promotor forward Primer.
   16. Reinigen Sie nach der Sequenz Bestätigung des geklonten SgRNAs die DNA aus der entsprechenden 14 mL-Tube mit einem Mini-Prep Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   17. Messen Sie Konzentration und Qualität der einzelnen Mini-Präparationen mit einem Spektralphotometer. Jeder Mini-Vorbereitung zu einer Konzentration von 15 ng/µL und Pipette in 96-well-Platte, gekennzeichnet SgRNA Klone Plattezu normalisieren.
       Hinweis: Diese Platte kann bei-20 ° C gelagert oder direkt zur Virus Vorbereitung verwendet werden.
2. Virale Produktion von SgRNA Konstrukte und Transduktion
   1. Für die Herstellung von SgRNA Lentivirale Partikel in das 96-Well-Format folgen die "ShRNA/SgRNA/ORF Hochdurchsatz virale Produktion (96 gut)" Protokoll von der genetischen Störung-Plattform (GPP Web Portal) des Broad Institute (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/Public/Resources/Protocols).
   2. 200 µL virale Überstand auf sterilen Röhrchen übertragen und sofort bei-80 ° C eingefroren.
   3. Tag-1: Mantel einen flachen Boden Non-Gewebe Kultur behandelt 96 well-Platte mit 100 µL der rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment in einer Konzentration von 10 µg/mL in einer BSL2 Zelle Kultur Kapuze. Wickeln Sie die Platte mit Klarsichtfolie zu vermeiden Verdampfungsverlust und lasse es über Nacht an Bank.
   4. Tag 0: Entfernen der rekombinanten menschlichen Fibronektin-Fragment aus jedem Brunnen. Die virale Überstand der einzelnen SgRNA bei Raumtemperatur auftauen. Fügen Sie 50 µL virale Überstand aus jeder Tube für jeden gut der Transduktion Platte beschichtet. Drehen Sie die Transduktion Platte bei 1.300 X g für 90 min bei 35 ° C.
   5. Gegen Ende des Spinfection zählen Sie MOLM13-Cas9 (Klon B3) Zellen aus der Kultur-Flasche. Verwenden Sie 10.000 Zellen pro Bohrloch in 100 µL Volumen. Zählen der Zellen für die Transduktion-Brunnen Berücksichtigung Totvolumen.
   6. Nach den 90 min Spinfection entfernen des Überstands aus den Vertiefungen, die mit einer Mehrkanal-Pipette auf 50 µL langsam durch Kippen der Plattenrandes angepasst. 100 µL der Kultur der MOLM13-Cas9 Klon B3 Zellen hinzu kommt jeder gut langsam Abrutschen von der Felge.
   7. Drehen Sie die Platte bei 1.300 X g für 2 min bei 35 ° C, die Zellen auf den Boden absetzen lassen. Übertragen Sie die Platte auf 37 ° C Gewebekultur Grade Inkubator.
   8. 1. Tag: Fügen Sie 100 µL frisches Medium zu jeder gut mit SgRNA ausgestrahlt Cas9-MOLM13 oder Cas9-MLL-AF9 Leukämie Zellen, so dass die mittlere Endvolumen 200 µL hinzu.

(3) Konkurrenzfähigkeit Assay

1. Tag 3: 72 h (Tag 3) post Transduktion, überprüfen Sie den Prozentsatz des SgRNA mit BFP positive Zellen in jedem Bohrloch durch Durchflusszytometrie (FACS). Verwenden Sie einen Zelle Lebensfähigkeit Farbstoff zu markieren und tote Zellen von der Analyse auszuschließen.
2. Weiter neu Beschichtung einen Anteil der Zellen in neue Brunnen mit frischem Medium nach jeder FACS Analyse Überwucherung während des Tests zu vermeiden.
3. Wiederholen Sie die FACS-Analyse alle 2 – 3 Tage um zu überprüfen, den relativen Anteil des BFP positiv (BFP + Ve) Zellen im Vergleich zu den BFP negative (BFP-Ve) (Abbildung 3). Den Anteil der BFP positive Zellen für jeden Zeitpunkt (mit FlowJo oder ähnlichen FACS-Analyse-Software) zu analysieren.
   1. Ziehen Sie Fcs-Dateien für jede Probe zu FlowJo Software. Klicken Sie doppelt auf jede eine Beispieldatei und plot eine Dot-Blot der forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC) mit FSC auf X Achse und SSC auf y-Achse. Tor der Zellen.
   2. Klicken Sie doppelt auf den geschlossenen Zellen und Plotten sie auf Lebensfähigkeit Fleck (auf die y-Achse) vs. FSC Höhe (H) oder Fläche (A)-Dot-Blot. Tor der Lebensfähigkeit Fleck negative (live) Zellen.
   3. Klicken Sie doppelt auf eingezäunten lebenden Zellen und Plotten Sie BFP (auf die y-Achse) vs. FSC (A) auf X-Achse. Tor BFP + Ve Zellen. Gelten Sie diese Tore für alle Proben durch Ziehen der Stichprobe auf Alle Proben unter Registerkarte " Gruppe ".
   4. Klicken Sie auf Tabellen-Editor , eine Analysetabelle aller Proben zu machen. Ziehen Sie BFP + Ve Graf aus eine Probe in der Tabelle und klicken Sie auf die Display -Taste im Tabellen-Editor , erstellen Sie eine Batch-Report aller Proben mit einem Tisch, den Anteil der BFP + Ve Zellen anzeigen. Speichern Sie die Tabelle als eine Xls.
4. Berechnen die proportionale Zunahme oder Abnahme der % BFP positive Zellen innerhalb der live Zellpopulation im Laufe der Zeit und vergleichen Sie dieses Verhältnis auf das Verhältnis von BFP positive Zellen im Steuerelement SgRNAs (z. B. Luciferase, Rührei oder GLP-SgRNA).
5. Darstellen Sie das Verhältnis der BFP positive Zellen für die verschiedenen SgRNAs einschließlich-Gens Interesse sowie Steuerelemente mithilfe von Tag 3 als Grundlage.

Ergebnisse

In unserer Studie ausgestrahlt wir zuerst die MOLM13 menschlichen AML-Zelllinie, die die MLL-AF9 Translokation mit hoher Titer Virus Codierung der Cas9-Blasticidin Lentivirale Plasmids trägt. In unseren Händen beschriebenen Schüttgut unsortierte MOLM13-Cas9-Zellen wurden hohe Niveau Cas9 Ausdruck durch westliche Beflecken nicht angezeigt und auch nicht ausführen wenn für effiziente gen bearbeiten-mit der Methode untersucht zuvor⁷. Daher gingen wir zu einzelnen...

Diskussion

In diesem Manuskript beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Durchführung eines CRISPR-Cas9-basierte Konkurrenzfähigkeit Assays untersucht die Rolle von Kandidatengenen in AML Zelllinien mit Flow-Zytometrie in Human/Murine AML Zellen (Abbildung 5). Das Ziel des Tests ist die Wirkung des Gens Löschung auf Wartung der AML Zellproliferation über zwei bis drei Wochen im Maßstab des Medium-Durchsatz zu identifizieren. Einige wichtige Schritte müssen sorgfältig befolgt werden, ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
FLAG-M2 Antibody	sigma-aldrich	F3165, lot # SLBS3530V
Anti-mouse Antibody	Invitrogen	31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Fisher	34095
ChemiDoc Imaging System	BIO RAD	17001401
Sorvall Legend RT centrifuge	Thermo Scientific
Blasticidin	Thermo Fisher	R21001
SYTOX Red	Thermo Fisher	S34859
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
DMEM	Thermo Fisher	11965-092
RPMI	Thermo Fisher	11875-093
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
Fetal Bovine Serum (FBS)	SAFC	12303C
single gRNA vector	Addgene #67974	pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear extraction kit	sigma-alorich	NXTRACT
XtremeGENE 9	sigma-alorich	6365787001
Retronectin	Takara	T100B
Flow cytometer	BD Biosciences
T4 PNK	NEBioLabs	M0201S
T4 DNA ligation buffer	NEBioLabs	B0202S
T4 DNA Ligase enzyme	NEBioLabs	M0202S
Ampicillin	Fisher scientific	BP1760-25
LB agar	Fisher scientific	BP9724-500
LB Broth	Fisher scientific	BP9731-500
Qiagen mini-prep kit	Qiagen	27104
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher	NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant Murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant Murine M-CSF	Peprotech	315-02
Stable competent cells	NEBiolabs	C3040I
10 cm Tissue Culture dishes	Fisher Scientific	353003
Cell lysis solution	Qiagen	158906
Protein precipitation solution	Qiagen	158910
DNA hydration solution	Qiagen	158914
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
BbSI	New England BioLabs	R0539S
APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit	Genessee Scientific	42-138
Puromycin	Fisher scientific	BP2956100
50 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495949A
15 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495970C