Enquête de dépendances génétiques utilisant la concurrence fondée sur les Cas9-CRISPR

Résumé

Ce manuscrit décrit une méthode de base CRISPR-Cas9 de groupés régulièrement entrecoupées court palindromique répète (CRISPR) pour une enquête rapide et simple du rôle de plusieurs gènes candidats à la prolifération des cellules de la leucémie myéloïde aiguë (AML) Parallèlement. Cette technique est évolutive et peut être appliquée dans les autres lignées cellulaires cancéreuses ainsi.

Résumé

Études de perturbation de gènes ont été utilisés intensivement pour enquêter sur le rôle des gènes individuels dans la pathogenèse de l’AML. Pour la réalisation complète du gène perturbation, beaucoup de ces études ont fait l’utilisation de modèles knock-out gène complexe. Bien que ces études sur des souris knockout offrent un système élégant et ayant fait leurs preuves pour enquêter sur les relations génotype-phénotype à, une méthode rapide et évolutive pour l’évaluation des gènes candidats qui jouent un rôle dans la prolifération cellulaire AML ou la survie dans les modèles AML aidera à accélérer l’interrogatoire parallèle de plusieurs gènes candidats. Les progrès récents dans les technologies de modification du génome ont amélioré considérablement notre capacité à effectuer des perturbations génétiques à une échelle sans précédent. Un tel système de modification du génome est la méthode CRISPR dotés de Cas9 qui permet d’effectuer des modifications rapides et efficaces dans le génome de cellules cibles. La simplicité et l’évolutivité des CRISPR/Cas9-mediated gene-suppression rend une des techniques plus attrayants pour l’interrogatoire d’un grand nombre de gènes dans des tests phénotypiques. Nous présentons ici un essai simple avec CRISPR/Cas9 médiée par gène-perturbation combinée à haut-débit débit-cytometry-concurrence fondée sur les dosages d’enquêter sur le rôle des gènes qui peuvent jouer un rôle important dans la prolifération ou la survie de l’homme et lignées de cellules murines AML.

Introduction

Les dernières décennies ont vu les nombreux efforts de recherche axés sur l’identification de la contribution des principales voies moléculaires dans la pathogenèse de la leucémie myéloïde aiguë (AML). Traditionnellement, disruption de génique dans les cellules de Lam a été réalisée à l’aide de la souris knock-out conditionnel ou court-hairpin RNA (Sharn). Tandis que chez des souris knockout offrent un système sophistiqué de contrôle spatio-temporelle de la délétion de gène, générant des souris knockout gène est fastidieux, long et coûteux. En outre, gène-coups de grâce à l’aide de stratégies de recombinaison n’est pas facilement évolutive ; ces stratégies ne se prêtent pas bien à l’interrogatoire de plusieurs gènes en parallèle. Après la découverte de méthodes d’interférence ARN à l’ARNm endogène de précipitation à l’aide de petits ARN interférents (siARN) ou Sharn, nombreux groupes a commencé à utiliser des techniques de RNA interference pour enquêter sur le rôle des gènes spécifiques dans AML. Puisque les cellules AML murins et humains sont notoirement difficiles à transfecter à l’aide de méthodes de transfection de lipides à base traditionnelle, la plupart des études Sharn lentivirally salarié ou codé en retrovirally pour étudier la fonction des gènes dans les cellules de l’AML. La découverte récente de cluster régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions (CRISPR) et les nucléases de Cas connexes (CRISPR-Cas9) a révolutionné les technologies de ciblage de gène^1,2,3. En utilisant CRISPR-Cas9, certains gènes ou régions génomiques peuvent être supprimées, sous la direction ou le tag avec efficacité et facilité. CRISPR Cas9-gène-modification basée est en train d’émerger comme la méthode de choix pour l’étude des relations génotype-phénotype à dans les types de cellules différentes en raison de la simplicité, l’efficacité et large applicabilité de cette technique. Méthodes CRISPR dotés de Cas9 deviennent aussi la méthode de choix des AML, non seulement pour interroger des gènes individuels, mais aussi comme une façon de cibler des gènes multiples dans les écrans génétiques rangés ou centralisées visant à enquêter sur plusieurs gènes en parallèle comme potentiel AML-dépendances^4,5,6.

Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un dosage simple croissance compétitive pour mesurer l’impact de la gène-perturbation sur la croissance des cellules de l’AML, selon stable CRISPR-Cas9-mediated gene édition suivie par cytométrie en flux haut débit. Cette méthode est simple, efficace et évolutive à débit moyen des expériences pour étudier le rôle de plusieurs gènes en parallèle dans les cellules de l’AML.

Protocole

1. générer AML Cell Line Clones avec forte Expression de Cas9 Stable et Active

1. Production de Cas9 lentivirus
   1. Jour 0 : Plaque 4 x 10⁶ 293 t cells dans 10 mL de DMEM avec 10 % sérum fœtal (SVF) et de la pénicilline et de L-glutamine dans un plat de culture de tissu de 10 cm dans un niveau 2 de biosafety (BSL2) certifié hotte de culture cellulaire. Placer le plat dans un incubateur à 37 ° C.
   2. Jour 1 : Les cellules 293 t plaqué devraient être 70 – 80 % anastomosé au jour 1. Effectuer la transfection utilisant le protocole suivant dans l’après-midi.
   3. Réchauffer le moyen de transfection, de milieux de culture et de réactif de transfection à température ambiante. Fondre tous les plasmides requis pour la transfection.
   4. Mix 9 mg de psPAX2, 0,9 µg de pMD2.G et 9 µg de plasmides pLenti-Cas9 avec 500 µL de milieu de transfection dans un tube de 5 mL.
   5. Ajouter 1,7 mL de milieu de transfection dans un 14 mL tube fond rond. Ajouter 57 µL de réactif de transfection directement dans le milieu de transfection dans le tube pour éviter de toucher les parois du tube.
   6. Doucement, ajouter le mélange de plasmide entier à la solution de réactif de transfection et mélanger en tapotant doucement le tube sur le côté. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 à 30 min. Dans le même temps, changer le milieu de la plaque de semis 293 t.
   7. Ajouter le mélange de transfection goutte à la plaque et en faisant doucement tourner la plaque sur le côté pour un mixage efficace. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C.
   8. Jour 2 : Aspirer le surnageant de la plaque de transfection doucement, telles que les cellules ne sont pas perturbés ou délogés de la plaque. Jeter le surnageant. Ajouter 10 mL de milieu DMEM de frais 10 % en glissant doucement sur les côtés de la plaque pour éviter les délogeant les cellules.
   9. Jour 3 : Récupérer le virus contenant surnageant de la plaque de transfection lentement en dessinant une seringue stérile de 10 cm. Après que le surnageant est recueilli dans la seringue, fixer un filtre de 0,45 : stérile à la seringue et tenez la seringue et le filtre dans un tube conique polypropylène fraîche et stérile de 15 mL. Doucement, plonger la seringue pour filtrer le virus contenant le liquide surnageant à travers le filtre de 0,45 µM dans le tube conique polypropylène 15 mL.
   10. Magasin du milieu conditionné viral en aliquotes de 2 mL chacun dans 2 mL cryovials à-80 ° C.
2. Transduction de lignées cellulaires AML
   1. J -1 : Diluer 1 mg/mL bouillon de fragment de fibronectine humaine recombinante à 10 µg/mL avec stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Manteau une culture de tissu-non traités 6 plaque bien avec 2 mL de la solution de travail de fragment de fibronectine humaine recombinante 10 µg/mL dans une hotte de culture cellulaire BSL2 approuvé. Enrouler la plaque dans le film alimentaire pour éviter la perte sur l’évaporation et conserver à température ambiante pendant la nuit.
   2. Jour 0 : Décongeler le surnageant viral contenant Cas9. Aspirer la solution de fragment de fibronectine humaine recombinante complètement à partir de la plaque enduite juste avant spinfection. Ajouter 2 mL de milieu conditionné viral avec Cas9 à la plaque et faire tourner à 1 300 x g pendant 90 min à 35 ° C. Cela aide les particules virales attacher à la spinfected bien.
   3. Pendant ce temps, compter les cellules d’être transduites et spin down 2 x 10⁶ cellules dans un tube conique polypropylène 15 mL. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 2 mL de milieux de culture fraîche.
   4. Après spinfection, retirer tous le surnageant viral de la spinfected bien et jeter. Des particules rétrovirales du surnageant sont attachés à la partie inférieure de le spinfected bien. Eh bien, ajouter à cela les 2 x 10⁶ cellules resuspendues dans 2 mL de milieu à partir de l’étape précédente.
   5. Faites tourner la plaque à nouveau à 1 300 x g très brièvement (1 à 2 min) suffisant pour que les cellules se sédentariser en bas. Replacez la plaque dans l’incubateur et laisser une nuit pour la transduction avec les particules virales spinfected attachés au puits.
   6. Jour 1 : Selon la densité des cellules, ajouter plus de moyen aux cellules transduits pour éviter la prolifération.
   7. Jour 2 : Puisque le plasmide pLenti-Cas9 dispose d’un marqueur de résistance Blasticidine, ajoutez Blasticidine à une dose de 10 µg/mL à transduite et untransduced (contrôle) MOLM13 ou cellules de leucémie de souris MLL-AF9 pour la sélection de Cas9 exprimant des cellules.
      Remarque : Blasticidine sélection des Cas9-transduites MOLM13 ou MLL-AF9 cellules leucémiques est considérée complète lorsque toutes les cellules de contrôle untransduced ont été éliminés. Pour les lignées de cellules autres que la leucémie MOLM13 et MLL-AF9, une courbe dose-réponse doit être effectuée avant cette expérience afin qu’une dose optimale peut être employée. Titrage du surnageant viral peut également être effectuée en cas de taux faible-transduction.
3. Dupliquer la sélection des cellules exprimant haut-Cas9.
   Remarque : Nous avons remarqué que dans certaines lignées cellulaires AML, sélection du clone sera ne peut-être pas nécessaire : le gros Cas9-Blasticidine sélectionné population déjà a le rendement élevé de modification du génome. Dans ce cas, il est possible de sauter l’étape 1.3 et de passer à l’étape 1.4 afin d’évaluer l’expression de Cas9 dans les cellules AML en vrac Cas9-blasticidine western Blot. Encore, il serait important d’évaluer l’efficacité d’édition de gène dans les cellules en vrac Cas9-AML (1.5 étape) avant de procéder à des analyses de compétition. On présume que la sélection de clones de haut-Cas9 unique réduit la variabilité du génome-édition, qui est particulièrement importante lorsque vous testez un certain nombre de différent guide unique RNAs (sgRNAs).
   1. Effectuer une cellule unique sorte de la Cas9-Blasticidine sélectionné MOLM13 et MLL-AF9 cellules leucémiques dorénavant appelés MOLM13-Cas9 et cellules de MLL-AF9-Cas9, respectivement, à l’aide d’un trieur de FACS contenu dans une hotte BSL2 approuvé. Tri peut être effectué en 5 à 10 fond rond sans culture tissulaire traitée 96 puits plaques.
   2. Autrefois simple MOLM13-Cas9 et clones de MLL-AF9-Cas9 ont été choisies et nommé individuellement, développez des clones de 10 – 20 10 µg/ml de Blasticidine dans les milieux de culture pour assurer le maintien de l’expression de Cas9.
4. Expression contrôle de protéine de Cas9 stable par immunoblotting.
   1. Faire des extraits nucléaires de tous les clones de Blasticidine choisi de MOLM13 et MLL-AF9 leucémie en utilisant le Kit d’Extraction nucléaire conformément au protocole du fabricant. Vérifiez Cas9 expression de la protéine à l’aide d’Anti-Flag M2 anticorps depuis le Cas9 dans le plasmide pLenti-Cas9 est lié à un épitope pavillon N-terminale.
   2. Charge 50 µg de protéines totales de chaque extrait nucléaire sur 10 % Bis-Tris gel et exécutez le gel à 120 V jusqu'à ce que les bandes supérieures sont bien séparées.
   3. Bloquer la membrane avec une solution de lait 5 % dans un tampon TBST pendant 1 h.
   4. Incuber la membrane avec une dilution de 1 : 1 000 d’anticorps M2 Anti-Flag à une concentration finale de 1 µg/mL à 4 ° C durant la nuit.
   5. Le lendemain, lavez la membrane avec un tampon TBST et incuber avec HRP anti-souris secondaires anticorps conjugué à une dilution de 1:5,000 (concentration finale de 0,16 µg/mL) à la température ambiante pendant 1 h.
   6. Lavez la membrane soigneusement avec un mélange TBST et développer la tache en utilisant des substrats ECL.
   7. Sélectionner les 3 – 4 clones avec la plus haute expression de la protéine de Cas9 vu par Western Blot pour plus loin l’analyse fonctionnelle (Figure 1).
5. Assurer une activité élevée de Cas9 dans clones sélectionnés
   1. Préparer le surnageant des gènes d’un vecteur d’encodage sgRNA avec sgRNAs ciblant l’humain ou souris AAVS1 locus de safe harbor, tel que décrit à l’étape 1.1.
   2. Transduce haut Cas9 exprimant MOLM13 ou leucémie de MLL-AF9 clones avec l’anti-AAVS1 sgRNA des gènes surnageant à l’aide de la méthode spinfection décrite ci-dessus. Sélectionnez avec 2,5 µg/mL Puromycine pendant 4 jours.
   3. Purifier l’ADN génomique de ces clones de leucémie MOLM13-Cas9 ou MLL-AF9-Cas9 après sélection de la Puromycine ainsi que de leurs témoins respectifs sauvage en utilisant le kit d’extraction d’ADN génomique selon les instructions du fabricant. Utilisation 50 ng d’ADN en tant que modèle pour effectuer un ACP avec le AAVS1_test_primers à l’aide de 2 x master mix de la Taq polymérase et le programme PCR énumérés au tableau 1.
   4. Exécuter le produit PCR sur un gel d’agarose à 2 % et gel-purifier la bande 268 paires de bases en utilisant un gel extraction kit conformément au protocole du fabricant. Séquence de Sanger le gel purifié produit de PCR à l’aide de l’apprêt AAVS1_target-frag_F.
   5. Évaluer l’efficacité édition par la comparaison de la AAVS1 sous la direction et les séquences de type sauvage à l’aide d’outils en ligne sur le web (Figure 2).

2. le clonage et la Transduction des sgRNAs dans les cellules de l’AML-Cas9

1. Débit moyen de clonage de sgRNAs
   1. Conception sgRNAs de 4 à 6 pour le gène d’intérêt en utilisant un logiciel de conception CRISPR basée sur le web. Il existe un certain nombre d’outils de conception CRISPR disponible en ligne tels que http://crispr.mit.edu/ qui génèrent des séquences sgRNA basée sur une séquence d’ADN d’entrée.
      1. Remplir une information appropriée dans les champs avec des astérisques. Cliquez sur le génome de la cible pour la conception de sgRNA. Coller la séquence cible dans la boîte de la séquence et cliquez sur le bouton " soumettre ".
   2. Pour le clonage dans la pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - le plasmide W sgRNA expression, faire précéder les nucléotides « CACC » le sens oligo et « AAAC « à l’inverse oligo antisens complétée avant de commander. Oligos de sens et anti-sens ordre prémélangée dans une plaque à 96 puits étiquetés Oligo-Mix auprès d’une compagnie de synthèse d’oligonucléotide.
      Remarque : Nous avons fait usage de la pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plasmide W, qui possède le site de restriction BbsI pour le clonage de sgRNA. Dans le cas où autres plasmides d’expression sgRNA sont utilisés, les surplombs utilisés pour les oligonucléotides sgRNA doivent être modifiées en conséquence.
   3. Prendre une plaque à 96 puits bas U distincte étiquetée Plaque de recuit. Faire un mélange maître de 1 µL T4 PNK, 1 µL d’ADN T4 ligature mémoire tampon 10 x et 6 µL d’eau par la réaction de recuit.
   4. Ajouter 8 µL du mélange maître dans chaque puits de la plaque de recuit. Ajouter 1 µL de 100 µM de chacun, sens et antisens oligo (ou 2 µL de mixte anti-sens-sens oligos) au master mix. Pipette de 2 – 3 fois doucement pour bien mélanger, tourner la plaque brièvement pour obtenir le mélange au fond du puits.
   5. Utilisez le programme de recuit suivant sur une machine PCR : 30 min à 37 ° C, 2 min 30 s à 95 ° C suivie d’un refroidissement lent à 22 ° C à raison de 0,1 ° C/s. Après le recuit, prendre une plaque à 96 puits frais étiquetée OligoMix dilué. Dans cette assiette, diluer les oligos phosphorylée et recuits de la réaction ci-dessus avec de l’eau (1 : 200) à l’aide d’une pipette multicanaux.
   6. Digest 5 µg de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - vecteur W avec 1,5 µL d’enzyme de restriction BbsI (10 000 unités/mL) en utilisant un tampon approprié à 37 ° C pendant 2 h à linéariser il pour la ligature plus tard.
   7. Prenez une plaque bien frais 96 étiquetés Ligature plaque et ajouter 20 ng de la BbsI digérés (BbsI) - PGKpuro2ABFP - pKLV2-U6gRNA5 vecteur W d’un puits par la ligature sgRNA désirée. Pour cela, ajouter 2 µL d’oligos phosphorylée, recuit de la plaque OligoMix dilué .
   8. Ajouter 1 µL de tampon de ligase 10 x T4 et 1 µL de l’enzyme T4 DNA Ligase. Doucement, déposer avec une pipette multicanaux et incuber le mélange de ligature à température ambiante pendant 2 h.
      Remarque : Ligature des mélanges peuvent être stockés à-20 ° C pendant l’étape de transformation plus tard.
   9. Pendant ce temps, les cellules de dégel 90 µL d' chimiquement compétent e. coli sur glace 10 min avant la fin de l’étape de la ligature.
   10. À l’aide d’une pipette multicanaux, faire 10 µL d’extraits des cellules compétentes dans chaque puits d’une plaque bien 96 séparée.
   11. Ajouter le mélange de la ligature de l’étape 2.1.8 dans la cupule contenant les cellules compétentes, pipette de haut en bas doucement et incuber pendant 10 min à température ambiante.
   12. Pipette 5 µL du mélange bactéries-ADN directement par la réaction ci-dessus dans un 6 bien sur plaque contenant LB-agar avec 100 µg/mL d’ampicilline. Répétez pour chaque les réactions de transformation.
   13. Plaque de chaque réaction de transformation dans une étiquette séparément bien d’une plaque de 6 puits. Ajouter environ 5 à 8 de perles de verre à chaque bien et secouer la plaque entière 6 puits de 8 à 10 fois dans un mouvement circulaire.
   14. Prélever des colonies unique 1 – 2 de chaque puits avec une pointe de pipette stérile 20 µL et il faire des rayures dans un spot soigneusement étiqueté sur une stérile de 10 cm boîte de pétri avec LB agar et 100 mg/mL ampicilline. Après étalement dans la plaque de la LB, simplement éjecter l’embout utilisé pour clone stries dans 3 mL de LB-ampicilline milieu contenant dans un 14 mL tube fond rond portant le numéro de clone bactérien correspondante.
   15. Envoyer la plaque bactérienne directement pour Sanger sequencing avec l’amorce vers l’avant du promoteur U6 humain.
   16. Après confirmation de la séquence de sgRNAs clonés, purifier l’ADN de tube de 14 mL correspondant à l’aide d’un kit de mini-préparent selon les instructions du fabricant.
   17. Mesurer la concentration et la qualité de chacun des mini-preps avec un spectrophotomètre. Normaliser chaque mini-préparent à une concentration de 15 ng/µL et pipette dans une assiette bien 96 étiquetés sgRNA plaque de Clones.
       Remarque : Cette plaque peut être conservée à-20 ° C ou utilisée directement pour la préparation de virus.
2. Production virale des constructions sgRNA et transduction
   1. Pour la production de particules lentivirales sgRNA au format 96 puits, suivez le « Sharn/sgRNA/ORF haut débit Production virale (96 puits) « protocole de la plate-forme de Perturbation génétique (portail web GPP) de l’Institut Broad (URL : https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/public/Resources/Protocols).
   2. Transférer 200 µL de liquide surnageant viral dans des tubes stériles et congeler à-80 ° C immédiatement.
   3. J -1 : Recouvrir une plaque bien 96 de culture traitée fond plat Non-tissu avec 100 µL de fragment de fibronectine humaine recombinante à une concentration de 10 µg/mL dans une hotte de culture cellulaire BSL2. Enrouler la plaque à l’aide de film alimentaire pour éviter les pertes par évaporation et laisser la nuit au banc.
   4. Jour 0 : Retirer le fragment de fibronectine humaine recombinante de chaque puits. Décongeler le surnageant viral de chaque sgRNA à température ambiante. Ajouter 50 µL de liquide surnageant viral dans chaque tube à chaque enduit puits de la plaque de transduction. Faites tourner la plaque de transduction à 1 300 x g pendant 90 min à 35 ° C.
   5. Vers la fin de spinfection, comte MOLM13-Cas9 (clone B3) cellules du flacon de culture. Utiliser 10 000 cellules par puits dans 100 volumes µL. Compter les cellules pour tous les puits de transduction, compte tenu de volume mort.
   6. Après la spinfection de 90 min, retirez le surnageant de tous les puits à l’aide d’une pipette multicanaux ajustée à 50 µL lentement par l’inclinaison de la plaque. Ajouter 100 µL de la culture de cellules de clone B3 MOLM13-Cas9 pour chaque bien lentement glisser vers le bas de la jante.
   7. Faites tourner la plaque à 1 300 x g pendant 2 min à 35 ° C et laisser les cellules déposent sur le fond. Placer la plaque dans l’étuve de grade de vitroplants de 37 ° C.
   8. Jour 1 : Ajouter 100 µL de milieu frais à chaque sgRNA bien contenant transduites Cas9-MOLM13 ou Cas9-MLL-AF9 leucémie des cellules telles que le dernier volume moyen est de 200 µL.

3. test de croissance compétitive

1. Jour 3 : 72 h (jour 3) post transduction, vérifiez le pourcentage de sgRNA contenant les cellules positives BFP dans chaque puits par cytométrie en flux (FACS). Utilisez une teinture de viabilité cellulaire pour marquer et exclure les cellules mortes de l’analyse.
2. Continuer la modification des plaques une proportion des cellules dans les nouveaux puits avec un milieu frais après chaque analyse de FACS pour éviter la prolifération pendant le test.
3. Répéter l’analyse de FACS tous les 2 – 3 jours pour vérifier la proportion relative de BFP positif (BFP + ve) cellules par rapport aux contreparties BFP (BFP-ve) négatifs (Figure 3). Analyser le pourcentage de cellules positives BFP pour chaque point de temps (en utilisant le FlowJo ou le logiciel d’analyse similaire FACS).
   1. Faire glisser les fichiers Fcs pour chaque échantillon au logiciel FlowJo. Double-cliquez sur n’importe quel fichier d’un échantillon et tracer une tache point de dispersion vers l’avant (FSC) vs le diffusion latérale (SSC) avec FSC sur X axe et SSC sur l’axe Y. Porte de toutes les cellules.
   2. Cliquez deux fois sur les cellules fermées et tracer sur la tache de la viabilité (sur l’axe des Y) par rapport à la hauteur (H) de FSC ou zone (A) dot blot. Porte la viabilité tacher des cellules (vivantes) négatifs.
   3. Cliquez deux fois sur des cellules vivantes fermées et terrain BFP (sur l’axe des Y) vs FSC (A) sur axe des X. Barrière BFP + ve cellules. Appliquer toutes ces portes à tous les échantillons en faisant glisser l’échantillon sélectionné pour Tous les échantillons sous l’onglet groupe .
   4. Cliquez sur Éditeur de Table pour faire un tableau d’analyse de tous les échantillons. Faites glisser le comte BFP + ve dans un échantillon à la table et cliquez sur le bouton d’affichage dans l' Éditeur de Table pour créer un rapport de traitement par lots de tous les échantillons avec un tableau affichant le pourcentage de cellules BFP + ve . Enregistrez la table sous un xls.
4. Calculer l’augmentation proportionnelle ou diminution % BFP positive de cellules au sein de la population de cellules vivantes au fil du temps et comparer ce ratio au ratio de cellules positives BFP dans le sgRNAs de contrôle (par exemple la luciférase, brouillés ou GFP sgRNA).
5. Tracer le rapport de BFP cellules positives pour la sgRNAs différentes, y compris l’ou les gènes d’intérêt ainsi que les contrôles à l’aide de jour 3 sous la ligne de base.

Résultats

Dans notre étude, nous avons tout d’abord transduites la MOLM13 humaine AML lignée qui porte la translocation de MLL-AF9 avec haut-titre virus codant le plasmide lentiviraux Cas9-blasticidine. Dans nos mains, en vrac non triées de cellules MOLM13-Cas9 ne manifestaient pas de haut niveau d’expression Cas9 Western Blot et n’a pas exécuté aussi bien quand le dosage efficace gène édition-à l’aide de la méthode décrite précédemment⁷. Par conséquent,...

Discussion

Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour effectuer un test de croissance compétitive CRISPR dotés de Cas9 pour enquêter sur le rôle des gènes candidats dans des lignées cellulaires AML cytométrie-dans les cellules humaines/murin AML (Figure 5). L’objectif du test est d’identifier l’effet de la suppression du gène sur l’entretien de la prolifération cellulaire AML pendant deux à trois semaines sur une échelle de débit moyen. Certaines étapes ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
FLAG-M2 Antibody	sigma-aldrich	F3165, lot # SLBS3530V
Anti-mouse Antibody	Invitrogen	31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Thermo Fisher	34095
ChemiDoc Imaging System	BIO RAD	17001401
Sorvall Legend RT centrifuge	Thermo Scientific
Blasticidin	Thermo Fisher	R21001
SYTOX Red	Thermo Fisher	S34859
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
DMEM	Thermo Fisher	11965-092
RPMI	Thermo Fisher	11875-093
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030081
Fetal Bovine Serum (FBS)	SAFC	12303C
single gRNA vector	Addgene #67974	pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear extraction kit	sigma-alorich	NXTRACT
XtremeGENE 9	sigma-alorich	6365787001
Retronectin	Takara	T100B
Flow cytometer	BD Biosciences
T4 PNK	NEBioLabs	M0201S
T4 DNA ligation buffer	NEBioLabs	B0202S
T4 DNA Ligase enzyme	NEBioLabs	M0202S
Ampicillin	Fisher scientific	BP1760-25
LB agar	Fisher scientific	BP9724-500
LB Broth	Fisher scientific	BP9731-500
Qiagen mini-prep kit	Qiagen	27104
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher	NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant Murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant Murine M-CSF	Peprotech	315-02
Stable competent cells	NEBiolabs	C3040I
10 cm Tissue Culture dishes	Fisher Scientific	353003
Cell lysis solution	Qiagen	158906
Protein precipitation solution	Qiagen	158910
DNA hydration solution	Qiagen	158914
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
BbSI	New England BioLabs	R0539S
APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit	Genessee Scientific	42-138
Puromycin	Fisher scientific	BP2956100
50 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495949A
15 mL polypropylene conical tubes	Fisher scientific	1495970C