השרשה של מיני משאבה איזופרופיל כדי לגרום לאי ספיקת לב בעכברים

Summary

הממשל הכרוני של אלכוהול איזוטרואנרול באמצעות משאבת אוסמוטי מושתל נעשה שימוש נרחב כדי לחקות אי ספיקת לב מתקדמת בעכברים. כאן, אנו מתארים שיטות מפורטות השתלת מיני משאבה כירורגית עבור הממשל האיזופרופיל המתמשך לאורך 3 שבועות, כמו גם, הערכת האקו ליצירת מודל מוצלח.

Abstract

אלכוהול איזופרופיל (ISO), הוא האגוניסט לא סלקטיבי ביתא-אדרלירגיות, המשמש באופן נרחב כדי לגרום לפציעה בלב עכברים. בעוד מודל אקוטי מחקה מחלת שריר הלב מושרה, המודל הכרוני, מנוהל באמצעות משאבת אוסמוטי, מחקה אי ספיקת לב מתקדמת בבני אדם. מטרת הפרוטוקול המתואר היא ליצור את המודל הכרוני ISO המושרה לב בעכברים באמצעות משאבת מיני מושתל. פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לגרום אי ספיקת לב 100 + זנים של עכברים ממין. טכניקות על השתלת משאבה כירורגית מתוארים בפרוטרוט עשוי להיות רלוונטי לכל מי שמעוניין ליצור מודל אי ספיקת לב בעכברים. בנוסף, שיפוץ לב שבועי שינויים בהתבסס על פרמטרים האקוקרדיוגרפיות עבור כל זן וזמן צפוי לפיתוח מודל מוצגים. לסיכום, השיטה פשוטה ומתוכמת. ISO רציף מנוהל באמצעות משאבת מיני מושתל מעל 3 כדי 4 שבועות הוא מספיק כדי לגרום שיפוץ לב. בסופו של דבר, ההצלחה של יצירת מודל ISO עשוי להיות מוערך ב vivo על ידי בדיקת אקו-המוח מפגין היפרפרס, התרחבות חדרית, ו תפקוד.

Introduction

אי ספיקת לב עם שבר הוצאה מופחת (HFrEF) מלווה בתגובה פיצוי היטב מוכרת של מערכת העצבים הסימפתטית לשמור על הומאוסטזיס לב וכלי דם¹. לחץ הומודינמי והשפעות מזיקות על הלב ועל הסירקולציה נצפו בהפעלה כרונית. אלה הפכו לאבן הפינה של הפרמקותרפיה העכשווית עבור אי ספיקת הלב ומנגנונים חשובים בהתקדמות אי ספיקת הלב והאנטוניזם הטיפולית של מערכות הורמונליות¹.

כמה דגמי עכבר זמינים לחקירות בסיסיות של אי ספיקת לב. דגמים גנטיים הם אטרקטיביים לחקר טיפולים מולקולריים וחקירת מסלולים איתות. עם זאת, ייתכן שמודלים אלה לא יהיו רלוונטיים לצורות נפוצות של אי ספיקת לב. מודלים נפוצים אחרים כוללים השמאלית הקדמית שמאלית (בחור) עורק העורקים, הלוע החוצה (TAC), ו איזופנול (ISO), כל אחד מכוון לאטיולוגיה פתולוגית שונה^{2,3,4,5 ,6}. ליטל עורק בחור גורמת אוטם שריר הלב בקיר הקדמי ובכך ליצור מודל ספציפי עבור מחלת שריר הלב. . ליצור מודל לחץ דם גבוה יותר של אי ספיקת לב למרות הלחץ הדרגתי ניתן למדוד, המאפשר ריבוד של hypertrophy, התפרצות חריפה של יתר לחץ דם חסר רלוונטיות קלינית ישירה⁴. שני הדגמים של LAD ו-TAC דורשים רמה גבוהה של מומחיות כירורגית לביצוע. מודל ISO אקוטי של אי ספיקת לב מחקה מחלת שריר הלב, הידוע גם בשם מחלת Takotsubo, אשר מאופיין על ידי עלייה מסומנת catecholamines ופעילות בחדר השמאלי מחקה אוטם שריר הלב חריפה^{7, שמונה}. לעומת זאת, מודלים ISO כרוניים של אי ספיקת לב מציגים סימפטומים מאפיינים של אי ספיקת לב מתקדמת, עם רמות גבוהות באופן כרוני של catecholamines¹. היתרונות של מודל ISO כרוני הם כי הוא מספק גירוי אדרארדירגיות כרונית כי מחקה אי ספיקת לב מתקדמת וכי קל יחסית ליצור. החוקר צריך לבחור מודל כי הטוב ביותר מסכם את הפתולוגיה של האינטרסים שלהם.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לגרום אי ספיקת לב בעכברים באמצעות משאבת מיני מושתל המשחרר ISO ברציפות לחקות הפעלה אוהדת כרונית שנמצאו בחולים אי ספיקת לב¹. השיטה פשוטה ומתוכמת. למרות שיש וריאציה ברורה בין זני העכבר, ISO מנוהל על פני 3 עד 4 שבועות 30 מ"ג/ק"ג/יום מספיק כדי לגרום שיפוץ לב ברוב העכברים. במיוחד, ISO מוביל לשלב pro-יפרטרופית הפיצוי במהלך השבוע 1 ואחריו הקיר דליל, התרחבות חדרית וירידה בתפקוד סיסטולי ידי שבוע 2 ו-3². הצלחה עבור יצירת מודל ISO יכול להיות מוערך ב vivo על ידי אקו-קרדיוגרם הוכחת hypertrophy, התרחבות, ותפקוד חדרית, כמו גם לשעבר vivo באמצעות הערכה היסטולוגית ומולקולרית של רקמת לב שנקטפו עבור שריר הלב הצטברות השומנים, פיברוזיס, המתח ER, אפופטוזיס, ו ביטוי גנים^9,10,11,12.

Protocol

פרוטוקול זה דבק בהנחיות לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (פרוטוקול ARC #2010-075). מומלץ לקוראים לדבוק בפרוטוקול IACUC שאושרו בעצמם, כגון טיפול בעכבר פרי-הליך וניהול כאבים עשויים להיות ספציפיים למוסדות.

1. הכנת משאבת איזופנול אוסמוטי

הערה: הליך זה הוחל בהצלחה על 9 + שבוע עכברים נקבה במשקל 18 + g ממעל 100 זנים העכבר הטבעי, כמו גם, בעכברים זכר בקבוצת משנה של זנים. אין מגבלת משקל הגוף המרבי עבור הליך זה. כלול תמיד פקדים התואמים לגיל, מאחר שהוא אינו ידוע אם גיל הטיפול משפיע על הרגישות להתפתחות אי-היכולת האיזוגופרתית.

1. שוקלים ומקליטים את משקל הגוף לכל עכבר.
2. חשב את הכמות והריכוז המתאימים של איזופנול עבור כל אחד מהעכברים (ראו טבלה 1 ; קובץ משלים).
   הערה: משאבות אוסמוטי המשמשות בניסוי זה (טבלה של חומרים) יש נפח מאגר של 100 μl ו נועדו לספק סמים בקצב זרימה רציפה של עד 28 ימים. הכינו תוספת של 20 μL של פתרון איזופרופיל לכל משאבה לצורך הפסד אמצעי האחסון בצינור המילוי במהלך טעינת המשאבה.
3. שוקלים את הכמות המתאימה של האיזופנול (טבלה 1) באמצעות איזון אנליטי ומתמוסס אותו ב-120 μl של פתרון סטרילי 0.9%. פיפטה במרץ או מערבולת עבור 1 דקות כדי לחלוטין מסיסות איזופרופיל.
   הערה: הכינו את משאבות האוסמוטי בארון מעבדה ביולוגי. יש לטפל במשאבות עם כפפות ניתוח. טכניקה סטרילית מומלצת לאורך כל הכנת משאבות אוסמוטי ובמהלך תהליך השרשה כירורגית.
4. שקול ותעד את משאבת האוסמוטי הריקה יחד עם מנחה הזרימה שלו ולאחר מכן הסר את מנחה הזרימה.
5. מזמת 120 μL של פתרון איזופרופיל לתוך מזרק 1.0 mL ולצרף את הצינור 27 מספק בוטה מילוי מסופק עם משאבות אוסמוטי.
   הערה: ודא שהמזרק ומילוי הצינור הינם ללא בועות אוויר.
6. בעוד החזקת המשאבה בתנוחה זקופה, הכנס את צינור המילוי דרך פתח המשאבה בראש עד קצה צינור המילוי יושב ליד החלק התחתון של מאגר המשאבה.
7. טען את המשאבה האוסמוטי על-ידי דחיפת המזרק באיטיות עד שהפתרון האיזוטרולי מתמלא עד לפתיחת המשאבה.
8. הסר בזהירות את צינור המילוי ונגב את התמיסה העודפת.
9. הכנס חזרה את מנחה הזרימה כדי לסגור את המשאבה ולמחוק כל פתרון עודף.
10. ודא כי מעל 90% של נפח המאגר כבר מילא על ידי שקילה מחדש את המשאבה אוסמוטי.
    הערה: משאבות שליטה מוכנות באותו אופן על ידי מילוי מאגר המשאבה עם סטרילי 0.9% פתרון.

2. הכנת כלי ניתוח

1. נקה את כל כלי הניתוח, כולל סיבים אופטיים O-ring מיקרוסקופ אור, 2 מלקחיים, מחזיק מחט, מטהרי חרוז חם, חרוזי זכוכית ומספריים (טבלת חומרים).
2. מכשירים כירורגיים אוטוקלב ב 121 ° C עבור 30 דקות כדי לעקר מכשירים לפני הניתוח.

3. אלכוהול איזופרופיל אוסמוטי השתלת כירורגי

1. לגרום הרדמה על ידי הצבת העכבר בחדר אינדוקציה עם 3% isofלוריאן ב 95% O2 ו-5% CO2. שמור על הרדמה. עם 2% באמצעות מעדר
2. מנהל 5 מ"ג/ק"ג carprofen ספורטינג ראגה לעורף הצוואר בין להבי הכתפיים לחוסר כאבים.
3. הניחו משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי למנוע התייבשות הקרניות.
4. בדוק את עומק ההרדמה על ידי ניטור קצב הנשימה, הבוהן צביטה רפלקס, וצבע של קרום רירי.
5. למקם את העכבר במצב פרקדן על משטח מחומם. הסר את השיער מהבטן התחתונה וחטא את העור בבטאדין או בכלהקאיצין.
   הערה: כדי למזער זיהום שלאחר הניתוח, ודא כי השדה הכירורגי הוא ללא שיער במקרה.
6. השתמש זוג מספריים כירורגי כדי לחתוך חתך העור באורך של 1 ס מ. השתמש בזוג מספריים בוטים כדי לנתח בזהירות את העור מתוך קירות הצפק שבבסיס.
   הערה: משלוח פנימי בצפק עדיף להתאים את גודל המשאבה.
7. משוך את קירות הצפק הרחק המעי הבסיסי עם מלקחיים וחותכים חור 0.8 ס מ בקירות הצפק באמצעות מספריים כירורגי משובח.
8. הכנס את המשאבה האוסמוטי לתוך חלל הצפק עם מנחה הזרימה הראשון.
9. סגרו את החסימה בקירות הצפק תוך שימוש בתפרים נספגים 5.0 בצורה מופרעת. השתמש ב-6.0 בתפרים לא נספגים כדי לסגור את חתך העור בצורה מופרעת.
10. למקם את העכבר בחממה ייעודי כדי לשמור אותו חם ויבש במהלך ההתאוששות. הערכת ההתאוששות מהרדמה על ידי ניטור העכבר כל 30 דקות בשעתיים הראשונות להחזרת נשימה נורמלית ותנועה.
11. ברגע שהעכבר התאושש לחלוטין מן ההרדמה, להחזיר אותו לדיור שגרתי. המשיכו לעקוב אחר החיה לסיבוכים ביום עד שלושה ימים, ואז כל 2-3 ימים לאחר מכן עד סוף הניסוי.
    הערה: בעלי חיים צריכים להיות מנוטרים על ראיות של כאב שלאחר הניתוח או זיהום, סימנים של ירידה במשקל, חוסר ניידות, יציבה לא נורמלית, כישלון החתן, מוגזם ליקוק או נשיכות של אזור החתך.
12. ניהול carprofen 5mg/ק"ג ספורטינג ראגה כל 24 h עד 48 h ולאחר מכן לפי הצורך.
13. ניהול 0.25 mg/mL אמוקסיצילין ב שתיית מים 5 ימים כדי למנוע זיהומים באתר כירורגי.
14. הסירו תפרים שאינם נספגים לאחר 7 עד 10 ימים.

4. הערכת אקוקרדיוגרפית בהרדמה

הערה: ניתן לבצע הערכת אקו-קרדיוגרפית שוב ושוב כדי לפקח על שיפוץ לב סדרתי במשך מספר שבועות. בוצעו מדידות אקו-קרדיוגרפיות במרווחי זמן שבועיים במשך שלושה שבועות.

1. לגרום הרדמה בחדר אינדוקציה ב 1.25% ל 1.5% של isofלוריאן. פעם מסומם כראוי, לאבטח את העכבר על פלטפורמת אקו לב עם קלטת המאפשר לעכבר להמשיך לקבל הרדמה דרך קונוס האף.
2. הפחת את isof, למינון תחזוקה של 1% כדי למזער השפעות chronotropic שליליות ואינוטרופיות של הרגעה יתר. הינכם מתבקשים לשים לב לשיעורי הנשימה והלב במהלך הלימודים ולהתאים את המינון הנדרש.
3. להסיר את השיער בחזה עם תחליב להסרת ולנגב את החזה ללא שיער.
4. מניחים את ג'ל אולטרסאונד על החזה ומיקום בדיקה אולטרסאונד לדימוי הלב.
5. במצב B, התמונה שמאל החדר (LV) בתצוגה הציר הארוך הparasternal. להתאים את פלטפורמת אקו לב כדי ליישר את שסתום אבי העורקים ואת הפיסגה LV במישור של קרן אולטרסאונד.
6. להטות את פלטפורמת אקו לב כדי למקם את הציר הארוך LV ב 90 מעלות לקרן אולטרסאונד ואת הקוטר LV מקסימום במרכז התמונה.
7. תמונה של הציר הקצר LV על ידי הפיכת בדיקה אולטרסאונד 90 מעלות.
8. במצב M למדוד את עובי הקיר LV וממדים פנימיים.
9. מניחים את העכבר בחזרה לכלוב. לפקח על שיבה של נשימה נורמלית תנועות גוף ספונטנית.

תוצאות

במחקר שפורסם בעבר, יש לנו מינון ISO של 30 מ"ג/ק"ג/d מעל 21 ימים באמצעות משאבת אוסמוטי על פני 105 היברידית עכבר מגוון הפאנל (hmdp) זנים^2,13. העריכו את התוצאות באמצעות האקו-הד שבוצעה בתוכנית הבסיסית, שבוע 1, 2 ו-3 של טיפול ISO (איור 1). בדומה למחקר קודם שבו המחברי...

Discussion

יש לנו להחיל את השיטה הזאת על 100 + זנים של עכברים משני כדי להעריך תוצאות לב בשל גירוי ביתא-אדרררגיות^{כרונית 2,13}. הבדלים משמעותיים ברגישות לאיזופנול ידועים להתקיים בין זנים העכבר יכול להיות מותאם אישית את המתח של עניין כנדרש¹⁶. זה יכול להיות בגלל ור?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place	Alzet	Model 1004	Includes filling tube, flow moderator and pump body
(-)-Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	16504-1G	(-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C.
1 ml sterile syringe	VWR	BD309602
30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator	AmScope	SKU: LED-30WR
5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture	Ethicon	J303H	5-0, absorbable
Fine Scissors - Sharp	FST	14060-09
Glass beads	FST	18000-46
Hot bead sterilizers	FST	18000-50
Iris forceps	WPI	15915
Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture	LOOK	AA-2176	6-0, non-absorbable
Needle holder	WPI	15926
Normal Saline, 0.9% NaCl	Fisher	89167-772