Implante de uma Minibomba isoproterenol para induzir insuficiência cardíaca em camundongos

Resumo

A administração crônica de isoproterenol através de uma bomba osmótica implantada tem sido amplamente utilizada para imitar a insuficiência cardíaca avançada em camundongos. Aqui, nós descrevemos métodos detalhados no implante cirúrgico da mini-bomba para a administração contínua do isoproterenol sobre 3 semanas, assim como, Avaliação ecocardiográfica para a criação bem sucedida do modelo.

Resumo

Isoproterenol (ISO), é um agonista beta-adrenérgico não seletivo, que é amplamente utilizado para induzir lesão cardíaca em camundongos. Quando o modelo agudo imita a cardiomiopatia stress-induzida, o modelo crônico, administrado através de uma bomba osmótica, imita a falha de coração avançada nos seres humanos. O objetivo do protocolo descrito é criar o modelo crônico de insuficiência cardíaca induzida por ISO em camundongos usando uma minibomba implantada. Este protocolo foi usado para induzir a insuficiência cardíaca em 100 + cepas de camundongos linhagens. Técnicas na implantação da bomba cirúrgica são descritas detalhadamente e podem ser relevantes para qualquer pessoa interessada em criar um modelo de insuficiência cardíaca em camundongos. Além disso, as mudanças semanais de remodelação cardíaca com base em parâmetros ecocardiográficos para cada cepa e tempo esperado para o desenvolvimento do modelo são apresentadas. Em resumo, o método é simples e reprodutível. O ISO contínuo administrado através da mini-bomba implantada sobre 3 a 4 semanas é suficiente para induzir o remodelamento cardíaco. Finalmente, o sucesso para a criação do modelo ISO pode ser avaliado in vivo por ecocardiografia serial demonstrando hipertrofia, dilatação ventricular e disfunção.

Introdução

A insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (HFrEF) é acompanhada por uma resposta compensatória bem reconhecida do sistema nervoso simpático para manter a homeostase cardiovascular¹. O estresse hemodinâmico e os efeitos deletérios no coração e na circulação foram observados com a ativação crônica. Estes tornaram-se a pedra angular da farmacoterapia contemporânea para a insuficiência cardíaca e são mecanismos importantes na progressão da insuficiência cardíaca e antagonismo terapêutico de sistemas Neurohormonais¹.

Vários modelos de mouse estão disponíveis para investigações básicas de insuficiência cardíaca. Os modelos genéticos são atrativos para explorar terapias moleculares e investigar vias de sinalização. No entanto, esses modelos podem não ser relevantes para formas comuns de insuficiência cardíaca. Outros modelos comuns incluem a ligadura da artéria descendente anterior (Lad), a constrição transaórtica (TAC) e o isoproterenol (ISO), cada um visando uma etiologia patológica diferente^{2,3,4,5 ,6}. A ligadura da artéria de LAD induz um infarction miocárdico da parede anterior que cria assim um modelo específico para a cardiomiopatia isquêmica. O TAC induz a sobrecarga de pressão aguda para criar um modelo hipertensivo de insuficiência cardíaca. Embora o gradiente de pressão possa ser medido, permitindo a estratificação da hipertrofia, o início agudo da hipertensão carece de relevância clínica direta⁴. Ambos os modelos LAD e TAC requerem um alto nível de perícia cirúrgica para executar. O modelo ISO agudo de insuficiência cardíaca imita cardiomiopatia induzida por estresse, também conhecida como doença de Takotsubo, que é caracterizada por um aumento acentuado nas catecolaminas e atividade no ventrículo esquerdo que imita o infarto agudo do miocárdio^7, a ⁸. Em contrapartida, os modelos ISO crônicos de insuficiência cardíaca apresentam características de sintomas de insuficiência cardíaca avançada, com níveis cronicamente elevados de catecolaminas¹. As vantagens do modelo crônico do ISO são que fornece a estimulação adrenérgicos crônica que imita a falha de coração avançada e que é relativamente fácil de criar. O investigador deve escolher um modelo que melhor recapitula sua patologia de interesse.

O objetivo geral deste método é induzir a insuficiência cardíaca em camundongos usando uma mini bomba implantada que libera a ISO continuamente para imitar a ativação simpática crônica encontrada em pacientes com insuficiência cardíaca¹. O método é simples e reprodutível. Embora haja uma variação clara entre as cepas de camundongo, a ISO administrada durante 3 a 4 semanas a 30 mg/kg/dia é suficiente para induzir o remodelamento cardíaco na maioria dos camundongos. Especificamente, a ISO leva a uma fase compensatória pró-hipertrófica durante a semana 1 seguida de desbaste da parede, dilatação ventricular e diminuição da função sistólica nas semanas 2 e 3². O sucesso para a criação do modelo ISO pode ser avaliado in vivo por ecocardiografia serial demonstrando hipertrofia, dilatação e disfunção ventricular, bem como ex vivo via avaliação histológica e molecular do tecido cardíaco colhido para acúmulo lipídico, fibrose, estresse er, apoptose e expressão gênica^9,10,11,12.

Protocolo

Este protocolo adere às directrizes do cuidado animal da Universidade de Califórnia, Los Angeles (protocolo ARC #2010-075). Os leitores são aconselhados a aderir ao seu próprio protocolo IACUC-aprovado, como o cuidado do rato peri-procedimento e gestão de analgesia pode ser específico da instituição.

1. preparação da bomba osmótica isoproterenol

Nota: este procedimento foi aplicado com sucesso em ratos fêmeas 9 + week-old que pesam 18 + g de sobre 100 estirpes do rato linhagens, assim como, nos ratos masculinos em um subconjunto das tensões. Não há limite máximo de peso corporal para este procedimento. Inclua sempre controles pareados por idade, pois é desconhecido se a idade do tratamento afeta a suscetibilidade induzida por isoproterenol ao desenvolvimento de insuficiência cardíaca.

1. Pesar e gravar o peso corporal para cada rato.
2. Calcule a quantidade e a concentração apropriadas de isoproterenol para cada rato (ver tabela 1 ; Arquivo suplementar).
   Nota: as bombas osmóticas utilizadas neste experimento (tabela de materiais) têm um volume de reservatório de 100 μl e são projetadas para entregar drogas em caudais contínuos por até 28 dias. Prepare um extra de 20 μL de solução de isoproterenol por bomba para dar conta da perda de volume no tubo de enchimento durante o carregamento da bomba.
3. Pesar a quantidade apropriada de isoproterenol (tabela 1) usando um equilíbrio analítico e dissolvê-lo em 120 μL de solução estéril de nacl 0,9%. Pipetar vigorosamente ou Vortex por 1 min para solubilizar completamente isoproterenol.
   Nota: Prepare as bombas osmóticas num gabinete de biossegurança laboratorial. As bombas devem ser tratadas com luvas cirúrgicas. A técnica estéril é recomendada durante todo a preparação das bombas osmóticas e durante o procedimento cirúrgico da implantação.
4. Pesar e gravar a bomba osmótica vazia juntamente com seu moderador de fluxo e, em seguida, remover o moderador do fluxo.
5. Aspirar 120 μL de solução de isoproterenol para uma seringa de 1,0 mL e anexar o tubo de enchimento de ponta sem corte de 27 Gauge fornecido com as bombas osmóticas.
   Nota: Certifique-se de que a seringa e o tubo de enchimento estão livres de bolhas de ar.
6. Enquanto segura a bomba na posição vertical, insira o tubo de enchimento através da abertura da bomba na parte superior até que a ponta do tubo de enchimento fica perto da parte inferior do reservatório da bomba.
7. Carregue a bomba osmótica empurrando o êmbolo da seringa lentamente até que a solução de isoproterenol se encha até à abertura da bomba.
8. Retire cuidadosamente o tubo de enchimento e limpe a solução em excesso.
9. Insira de volta o moderador do fluxo para fechar a bomba e limpe qualquer solução em excesso.
10. Confirme que mais de 90% do volume do reservatório foi preenchido repesando a bomba osmótica.
    Nota: as bombas de controle são preparadas da mesma maneira preenchendo o reservatório da bomba com solução estéril de NaCl de 0,9%.

2. preparação de instrumentos cirúrgicos

1. Limpe todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo O iluminador do microscópio da luz do O-anel da fibra óptica, 2 fórceps, suporte da agulha, Sterilizers quentes do grânulo, grânulos de vidro, e tesouras (tabela dos materiais).
2. Autoclave instrumentos cirúrgicos em 121 ° C por 30 min para esterilizar instrumentos antes da cirurgia.

3. implante cirúrgico da bomba osmótica de isoproterenol

1. Induzir a anestesia colocando o mouse em uma câmara de indução com isoflurano a 3% em 95% de O2 e 5% de CO2. Manter a anestesia com isoflurano 2% através de uma nosecona.
2. Administrar 5 mg/kg de carprofeno s.c. ao Scruff do pescoço entre as omoplatas para analgesia.
3. Coloc a pomada oftálmica nos olhos para impedir a desidratação córnea.
4. Verifique a profundidade da anestesia, monitorando a taxa de respiração, reflexo de pinça do dedo do pé e cor da membrana mucosa.
5. Coloque o mouse em uma posição supina em uma almofada aquecida. Retire o cabelo do abdômen inferior e desinfete a pele com Betadine ou clorexidina.
   Nota: para minimizar a infecção pós-operatória, assegure-se de que o campo cirúrgico esteja livre de pêlos incidentes.
6. Use um par de tesouras cirúrgicas para cortar uma incisão de 1 cm-Long da pele do midline. Use um par de tesouras Blunt-ended para dissecar com cuidado a pele das paredes peritoneais subjacentes.
   Nota: uma entrega intraperitoneal é preferível para acomodar o tamanho da bomba.
7. Puxe as paredes peritoneais para longe do intestino subjacente com fórceps e corte um furo de 0,8 cm nas paredes peritoneais usando tesouras cirúrgicas finas.
8. Insira a bomba osmótica na cavidade peritoneal com a extremidade do fluxo moderador primeiro.
9. Feche a preensão nas paredes peritoneais usando 5,0 Suturas absorvíveis em uma forma interrompida. Use 6,0 suturas não absorvíveis para fechar a incisão cutânea de forma interrompida.
10. Coloque o mouse em uma incubadora dedicada para mantê-lo quente e seco durante a recuperação. Avalie a recuperação da anestesia monitorando o rato cada 30 minutos nas primeiras duas horas para o retorno da respiração e do movimento normais.
11. Uma vez que o rato se recuperou completamente da anestesia, retorne-o à carcaça rotineira. Continuar a monitorizar o animal para complicações diárias até 3 dias e, em seguida, a cada 2 a 3 dias depois, até o final do experimento.
    Observação: os animais devem ser monitorados quanto à evidência de dor ou infecção pós-operatória, sinais de perda de peso, falta de mobilidade, postura anormal, falha no noivo e excesso de lamber ou morder a área da incisão.
12. Administrar carprofeno 5mg/kg s.c. a cada 24 h para até 48 h e depois, conforme necessário.
13. Administrar 0,25 mg/mL de amoxicilina em água potável durante 5 dias para prevenir infecções no local cirúrgico.
14. Retire as suturas não absorvíveis após 7 a 10 dias.

4. Avaliação ecocardiográfica anestesia

Nota: a Avaliação ecocardiográfica pode ser realizada repetidamente para monitorar o remodelamento cardíaco de série durante várias semanas. Realizamos medições ecocardiográficas em intervalos semanais ao longo de 3 semanas.

1. Induzir anestesia em câmara de indução em 1,25% a 1,5% de isoflurano. Uma vez devidamente sedado, prenda o mouse sobre a plataforma de ecocardiografia com fita permitindo que o mouse continue recebendo anestesia através de um cone de nariz.
2. Diminua o isoflurano para uma dosagem de manutenção de 1% para minimizar os efeitos cronotrópicos e inotrópicos negativos da sedação excessiva. Tome nota das taxas respiratórias e cardíacas durante todo o estudo e ajuste a dosagem de isoflurano conforme necessário.
3. Retire o cabelo do peito com uma loção depilatória e limpe o peito livre de pêlos.
4. Coloque o gel de ultra-som no peito e posicione a sonda de ultra-som para a imagem do coração.
5. No modo B, a imagem do ventrículo esquerdo (LV) na visão de eixo longo do paraesternal. Ajuste a plataforma de ecocardiografia para alinhar a valva aórtica e o ápice do ve no plano do feixe de ultra-som.
6. Incline a plataforma da ecocardiografia para colocar o eixo longo do LV em 90 graus ao feixe do ultra-som e ao diâmetro máximo do LV no centro da imagem.
7. Imagem do eixo curto LV girando a sonda de ultra-som 90 graus.
8. Em M-modo medida LV espessura da parede e dimensões internas.
9. Coloque o mouse de volta na gaiola. Monitor para o retorno da respiração normal e movimentos espontâneos do corpo.

Resultados

Em nosso estudo publicado previamente, nós administramos uma dosagem do ISO de 30 mg/kg/d sobre 21 dias através da bomba osmótica através das tensões híbridas do painel da diversidade do rato 105 (hmdp)^2,13. Foram avaliados os desfechos por meio do ecocardiograma realizado na linha de base, semana 1, 2 e 3 do tratamento ISO (Figura 1). Semelhante a um estudo prévio em que os autores estudaram o impacto do isoproterenol entre 2...

Discussão

Aplicou-se este método a mais de 100 estirpes de camundongos incriados para avaliar os desfechos cardíacos devido à estimulação beta-adrenérgica crônica^2,13. As diferenças significativas na susceptibilidade ao isoproterenol são sabidas para existir entre tensões do rato e podem ser personalizadas à tensão de interesse como necessário¹⁶. Isso pode ser devido à variação na função do receptor beta-adrenérgico entre as cepas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place	Alzet	Model 1004	Includes filling tube, flow moderator and pump body
(-)-Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	16504-1G	(-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C.
1 ml sterile syringe	VWR	BD309602
30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator	AmScope	SKU: LED-30WR
5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture	Ethicon	J303H	5-0, absorbable
Fine Scissors - Sharp	FST	14060-09
Glass beads	FST	18000-46
Hot bead sterilizers	FST	18000-50
Iris forceps	WPI	15915
Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture	LOOK	AA-2176	6-0, non-absorbable
Needle holder	WPI	15926
Normal Saline, 0.9% NaCl	Fisher	89167-772