Implantation einer Isoproterenol Mini-Pumpe zur Induzieren von Herzinsuffizienz bei Mäusen

Zusammenfassung

Die chronische Verabreichung von Isoproterenol über eine implantierte osmotische Pumpe wurde weit verbreitet verwendet, um fortgeschrittene Herzinsuffizienz bei Mäusen zu imitieren. Hier beschreiben wir detaillierte Methoden der chirurgischen Mini-Pump-Implantation für die kontinuierliche Isoproterenol-Verabreichung über 3 Wochen sowie die echokardiographische Beurteilung der erfolgreichen Modellerstellung.

Zusammenfassung

Isoproterenol (ISO), ist ein nicht-selektiver Beta-adrenergen Agonist, der weit verbreitet ist, um Herzverletzungen bei Mäusen zu induzieren. Während das akute Modell stressinduzierte Kardiomyopathie imitiert, imitiert das chronische Modell, das über eine osmotische Pumpe verabreicht wird, fortgeschrittene Herzinsuffizienz beim Menschen. Der Zweck des beschriebenen Protokolls ist es, das chronische ISO-induzierte Herzinsuffizienzmodell bei Mäusen mit einer implantierten Minipumpe zu erstellen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Herzinsuffizienz bei mehr als 100 Stämmen von inbrünstigen Mäusen zu induzieren. Techniken zur chirurgischen Pumpenimplantation werden ausführlich beschrieben und können für jeden relevant sein, der an der Erstellung eines Herzinsuffizienzmodells bei Mäusen interessiert ist. Darüber hinaus werden die wöchentlichen Veränderungen des Herzumbaus auf der Grundlage echokardiographischer Parameter für jeden Stamm und die erwartete Zeit für die Modellentwicklung vorgestellt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Methode einfach und reproduzierbar ist. Kontinuierliche ISO-Verabreichung über die implantierte Minipumpe über 3 bis 4 Wochen reicht aus, um einen Herzumbau zu induzieren. Schließlich kann der Erfolg der Erstellung von ISO-Modellin vivo durch serielle Echokardiographie bewertet werden, die Hypertrophie, ventrikuläre Dilatation und Dysfunktion demonstriert.

Einleitung

Herzinsuffizienz mit reduzierter Auswurffraktion (HFrEF) wird von einer anerkannten Kompensationsreaktion des sympathischen Nervensystems begleitet, um die kardiovaskuläre Homöostase^{aufrechtzuerhalten 1}. Hämodynamischer Stress und schädliche Auswirkungen auf Herz und Kreislauf wurden bei chronischer Aktivierung beobachtet. Diese sind zum Eckpfeiler der modernen Pharmakotherapie für Herzinsuffizienz geworden und sind wichtige Mechanismen für das Fortschreiten der Herzinsuffizienz und des therapeutischen Antagonismus neurohormonaler Systeme¹.

Für grundlegende Untersuchungen der Herzinsuffizienz stehen mehrere Mausmodelle zur Verfügung. Genetische Modelle sind attraktiv für die Erforschung molekularer Therapien und die Untersuchung von Signalwegen. Diese Modelle sind jedoch möglicherweise nicht relevant für häufige Formen von Herzinsuffizienz. Andere gängige Modelle sind linke vordere absteigende (LAD) Arterieligation, transaortische Verengung (TAC), und Isoproterenol (ISO), jedes Ziel für eine andere pathologische Ätiologie^{2,3,4,5 ,6}. DIE LAD-Arterienligation induziert einen vorderen Wandmyokardinfarkt und schafft so ein Modell, das speziell für die ischämische Kardiomyopathie spezifisch ist. TAC induziert akute Drucküberlastung, um ein hypertensives Modell der Herzinsuffizienz zu schaffen. Obwohl der Druckgradient gemessen werden kann, was die Schichtung der Hypertrophie ermöglicht, fehlt der akute Beginn der Hypertonie der direkten klinischen Relevanz⁴. Sowohl LAD- als auch TAC-Modelle erfordern ein hohes Maß an chirurgischem Know-how, um ausgeführt zu werden. AkuteISO-Modell der Herzinsuffizienz imitiert stressinduzierte Kardiomyopathie, auch bekannt als Takotsubo-Krankheit, die durch eine deutliche Zunahme der Katecholamine und Aktivität in der linken Herzkammer gekennzeichnet ist, die akuten Myokardinfarkt imitiert^{7, 8}. Im Gegensatz dazu stellen chronische ISO-Modelle von Herzinsuffizienz Symptome einer fortgeschrittenen Herzinsuffizienz dar, mit chronisch erhöhten Katecholamine-Spiegeln¹. Die Vorteile des chronischen ISO-Modells sind, dass es chronische adrenerge Stimulation bietet, die fortgeschrittene Herzinsuffizienz imitiert und dass es relativ einfach zu erstellen ist. Der Prüfer sollte ein Modell wählen, das am besten seine Pathologie von Interesse rekapituliert.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Herzinsuffizienz bei Mäusen mit einer implantierten Minipumpe zu induzieren, die ISO kontinuierlich freisetzt, um chronische sympathische Aktivierung enkleben zu können, die bei Herzinsuffizienzpatienten gefunden wurde¹. Die Methode ist einfach und reproduzierbar. Obwohl es deutliche Unterschiede zwischen den Mausstämmen gibt, ist ISO, die über 3 bis 4 Wochen bei 30 mg/kg/Tag verabreicht wird, ausreichend, um bei den meisten Mäusen einen Herzumbau zu induzieren. Insbesondere führt ISO zu einer prohypertrophen Kompensationsphase in Woche 1, gefolgt von Wandverdünnung, ventrikulärer Dilatation und Abnahme der systolischen Funktion durch Woche 2 und 3². Der Erfolg der ISO-Modellerstellung kann in vivo durch serielle Echokardiographie bewertet werden, die Hypertrophie, Dilatation und ventrikuläre Dysfunktion demonstriert, sowie ex vivo durch histologische und molekulare Bewertung von geerntetem Herzgewebe für intramyokardiale Lipidakkumulation, Fibrose, ER-Stress, Apoptose und Genexpression^9,10,11,12.

Protokoll

Dieses Protokoll entspricht den Tierpflegerichtlinien der University of California, Los Angeles (ARC-Protokoll #2010-075). Lesern wird empfohlen, sich an ihr eigenes IACUC-zugelassenes Protokoll zu halten, da die Behandlung von Peri-Procedure-Maus und das Analgesie-Management institutsspezifisch sein können.

1. Vorbereitung der osmotischen Isoproterenolpumpe

HINWEIS: Dieses Verfahren wurde erfolgreich auf 9+ Wochen alte weibliche Mäuse mit einem Gewicht von 18+ g von über 100 inzuchtbasierten Mausstämmen sowie bei männlichen Mäusen in einer Teilmenge von Stämmen angewendet. Es gibt keine maximale Körpergewichtsbeschränkung für dieses Verfahren. Immer altersgerechte Kontrollen enthalten, da nicht bekannt ist, ob das Alter der Behandlung Isoproterenol-induzierte Anfälligkeit für die Entwicklung von Herzinsuffizienz betrifft.

1. Wiegen und zeichnen Sie das Körpergewicht für jede Maus auf.
2. Berechnen Sie die angemessene Menge und Konzentration von Isoproterenol für jede Maus (siehe Tabelle 1 ; Ergänzende Datei).
   HINWEIS: Die in diesem Experiment verwendeten osmotischen Pumpen (Materialtabelle) haben ein Reservoirvolumen von 100 l und sind so konzipiert, dass sie Medikamente mit kontinuierlichen Durchflussraten für bis zu 28 Tage liefern. Bereiten Sie eine zusätzliche Isoproterenol-Lösung pro Pumpe auf, um den Volumenverlust im Füllrohr während der Pumpenbeladung zu berücksichtigen.
3. Die entsprechende Menge Isoproterenol (Tabelle 1) mit einem analytischen Gleichgewicht abwägen und in 120 l steriler 0,9% NaCl-Lösung auflösen. Pipette kräftig oder Wirbel für 1 min, um Isoproterenol vollständig zu löslich.
   HINWEIS: Bereiten Sie die osmotischen Pumpen in einem Labor-Biosicherheitsschrank vor. Pumpen sollten mit chirurgischen Handschuhen behandelt werden. Sterile Technik wird während der gesamten Herstellung der osmotischen Pumpen und während des chirurgischen Implantationsverfahrens empfohlen.
4. Wiegen und aufzeichnen Sie die leere osmotische Pumpe zusammen mit ihrem Strömungsmoderator, und entfernen Sie dann den Strömungsmoderator.
5. 120 l Isoproterenol-Lösung in eine 1,0 ml Spritze aspirieren und das 27-Spur-Stumpffüllrohr mit den osmotischen Pumpen befestigen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Spritze und das Füllrohr frei von Luftblasen sind.
6. Während Sie die Pumpe in aufrechter Position halten, legen Sie das Füllrohr durch die Pumpenöffnung oben ein, bis die Spitze des Füllrohres in der Nähe des Bodens des Pumpenbehälters sitzt.
7. Laden Sie die osmotische Pumpe, indem Sie den Spritzenkolben langsam drücken, bis sich die Isoproterenol-Lösung bis zur Pumpenöffnung füllt.
8. Entfernen Sie das Füllrohr vorsichtig und wischen Sie die überschüssige Lösung ab.
9. Legen Sie den Durchflussmoderator zurück, um die Pumpe zu schließen, und wischen Sie jede überschüssige Lösung ab.
10. Bestätigen Sie, dass über 90 % des Reservoirvolumens durch Umgewichtung der osmotischen Pumpe gefüllt wurden.
    HINWEIS: Steuerpumpen werden auf die gleiche Weise vorbereitet, indem das Pumpenreservoir mit einer sterilen 0,9% NaCl-Lösung gefüllt wird.

2. Vorbereitung von chirurgischen Instrumenten

1. Reinigen Sie alle chirurgischen Instrumente, einschließlich Glasfaser O-Ring Licht Mikroskop Beleuchtung, 2 Zangen, Nadelhalter, heiße Perlen sterilisatoren, Glasperlen und Schere (Tisch der Materialien).
2. Autoklavchirurgische Instrumente bei 121° C für 30 min, um Instrumente vor der Operation zu sterilisieren.

3. Isoproterenol osmotische Pumpe chirurgische Implantation

1. Induzieren Sie anästhesie, indem Sie die Maus in eine Induktionskammer mit 3% Isofluran in 95% O2 und 5% CO2 setzen. Halten Sie die Anästhesie mit 2% Isofluran über ein Nosecon aufrecht.
2. 5 mg/kg Carprofen s.c. zur Analgesie zwischen den Schulterblättern an den Hals verabreichen.
3. Setzen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen, um Hornhautaustrocknung zu verhindern.
4. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Atmungsrate, den Zehenkneifreflex und die Farbe der Schleimhaut überwachen.
5. Legen Sie die Maus in eine Supine-Position auf einem beheizten Pad. Entfernen Sie das Haar aus dem Unterbauch und desinfizieren Sie die Haut mit Betadin oder Chlorhexidin.
   HINWEIS: Um eine postoperative Infektion zu minimieren, stellen Sie sicher, dass das chirurgische Feld frei von vorfallenden Haaren ist.
6. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen 1 cm langen Mittellinien-Hautschnitt zu schneiden. Verwenden Sie eine stumpfe Schere, um die Haut sorgfältig von den darunter liegenden Peritonealwänden zu sezieren.
   HINWEIS: Eine intraperitoneale Lieferung wird bevorzugt, um die Größe der Pumpe unterzubringen.
7. Ziehen Sie die Peritonealwände mit Zangen vom darunter liegenden Darm weg und schneiden Sie mit einer feinen chirurgischen Schere ein 0,8 cm großes Loch in die Peritonealwände.
8. Setzen Sie die osmotische Pumpe mit dem Ende des Strömungsmoderators zuerst in die Peritonealhöhle ein.
9. Schließen Sie den Halt in den Peritonealwänden mit 5,0 resorbierbaren Nähten in einer unterbrochenen Weise. Verwenden Sie 6.0 nicht resorbierbare Nähte, um den Hautschnitt unterbrochen zu schließen.
10. Legen Sie die Maus in einen speziellen Inkubator, um sie während der Genesung warm und trocken zu halten. Bewerten Sie die Erholung von der Anästhesie, indem Sie die Maus alle 30 Min. in den ersten zwei Stunden auf die Rückkehr der normalen Atmung und Bewegung überwachen.
11. Sobald sich die Maus vollständig von der Anästhesie erholt hat, kehren Sie sie in die Routineunterkunft zurück. Überwachen Sie das Tier täglich bis zu 3 Tage und danach alle 2 bis 3 Tage bis zum Ende des Experiments auf Komplikationen.
    HINWEIS: Tiere sollten auf Anzeichen von postoperativen Schmerzen oder Infektionen, Anzeichen von Gewichtsverlust, Bewegungsmangel, abnorme Körperhaltung, mangelnde Pflege und übermäßiges Lecken oder Beißen des Schnittbereichs überwacht werden.
12. Carprofen 5mg/kg s.c. alle 24 h bis zu 48 h und danach nach Bedarf verabreichen.
13. Verabreichen Sie 0,25 mg/ml Amoxicillin im Trinkwasser 5 Tage lang, um Infektionen an der chirurgischen Stelle zu verhindern.
14. Entfernen Sie nicht resorbierbare Nähte nach 7 bis 10 Tagen.

4. Echokardiographische Beurteilung unter Anästhesie

HINWEIS: Echokardiographische Beurteilung kann wiederholt durchgeführt werden, um serielle Herz-Remodeling über mehrere Wochen zu überwachen. Wir führten echokardiographische Messungen in wöchentlichen Abständen über 3 Wochen durch.

1. Induzieren Sie die Anästhesie in einer Induktionskammer mit 1,25% bis 1,5% Isofluran. Nach entsprechender Sedatiert, sichern Sie die Maus auf der Echokardiographie-Plattform mit Klebeband, so dass die Maus weiterhin Anästhesie durch einen Nasenkegel erhalten.
2. Verringern Sie Isofluran auf eine Erhaltungsdosis von 1%, um negative chronotrope und inotropische Effekte der Übersedation zu minimieren. Beachten Sie die Atem- und Herzfrequenzen während der gesamten Studie und passen Sie die Dosierung von Isofluran nach Bedarf an.
3. Entfernen Sie die Brusthaare mit einer Enthaarungslotion und wischen Sie die Brust frei von Haaren.
4. Legen Sie das Ultraschallgel auf die Brust und positionieren Sie die Ultraschallsonde, um das Herz abzubilden.
5. Im B-Modus wird der linke Ventrikel (LV) in der parasternalen Langachsenansicht abgebildet. Passen Sie die Echokardiographie-Plattform an, um die Aortenklappe und die LV-Spitze in der Ebene des Ultraschallstrahls auszurichten.
6. Neigen Sie die Echokardiographie-Plattform, um die LV-Langachse bei 90 Grad auf den Ultraschallstrahl und den maximalen LV-Durchmesser in der Bildmitte zu platzieren.
7. Bild der LV-Kurzachse, indem Sie die Ultraschallsonde um 90 Grad drehen.
8. Im M-Modus lv Wandstärke und Innenabmessungen messen.
9. Legen Sie die Maus wieder in den Käfig. Monitor für die Rückkehr der normalen Atmung und spontane Körperbewegungen.

Ergebnisse

In unserer zuvor veröffentlichten Studie verabreichten wir eine ISO-Dosierung von 30 mg/kg/d über 21 Tage über die osmotische Pumpe über 105 Hybrid Mouse Diversity Panel (HMDP) Stämme^2,13. Wir bewerteten die Ergebnisse mit dem Echokardiogramm, das zu Beginn der Ersten, 2. und 3. Woche der ISO-Behandlung durchgeführt wurde (Abbildung 1). Ähnlich wie in einer früheren Studie, in der die Autoren die Auswirkungen von Isoprotereno...

Diskussion

Wir haben diese Methode auf über 100 Stämme von inzuchtbasierten Mäusen angewendet, um die Herzergebnisse aufgrund der chronischen beta-adrenergen Stimulation zu bewerten^2,13. Erhebliche Unterschiede in der Anfälligkeit für Isoproterenol sind bekannt, unter Mausstämmen existieren und kann an die Belastung saniert werden, wie erforderlich¹⁶. Dies kann auf die Variation der Beta-adrenergen Rezeptorfunktion zwischen den Mausstämmen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place	Alzet	Model 1004	Includes filling tube, flow moderator and pump body
(-)-Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	16504-1G	(-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C.
1 ml sterile syringe	VWR	BD309602
30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator	AmScope	SKU: LED-30WR
5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture	Ethicon	J303H	5-0, absorbable
Fine Scissors - Sharp	FST	14060-09
Glass beads	FST	18000-46
Hot bead sterilizers	FST	18000-50
Iris forceps	WPI	15915
Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture	LOOK	AA-2176	6-0, non-absorbable
Needle holder	WPI	15926
Normal Saline, 0.9% NaCl	Fisher	89167-772