植入异丙酮醇微型泵，以诱导小鼠心力衰竭

摘要

通过植入的渗透泵长期给用异丙酮醇，已被广泛用于模拟小鼠的晚期心力衰竭。在这里，我们描述了手术微型泵植入在持续异丙酮醇给3周内的详细方法，以及成功创建模型的超声心动图评估。

摘要

Isoproterenol（ISO）是一种非选择性β-肾上腺素激动剂，广泛用于诱导小鼠心脏损伤。虽然急性模型模仿压力引起的心肌病，而通过渗透泵施用的慢性模型模仿人类晚期心力衰竭。所述协议的目的是使用植入的微型泵在小鼠中创建慢性ISO引起的心力衰竭模型。该协议已用于诱导100+系近亲繁殖小鼠的心力衰竭。手术泵植入技术被详细描述，可能与任何有兴趣在小鼠中创建心力衰竭模型的人相关。此外，还介绍了基于每个菌株的超声心动图参数和模型开发的预期时间，每周心脏重塑变化。总之，该方法简单易用。通过植入式微型泵在3至4周内连续施用ISO，足以诱导心脏重塑。最后，通过连续超声心动图显示肥大、心室扩张和功能障碍，可以评估ISO模型创建的成功。

引言

心力衰竭与减少弹出分数（HFrEF）伴随着一个公认的补偿反应的同情神经系统，以保持心血管^平衡1。慢性活化观察到血液动力学压力和对心脏和循环的有害影响。这些已成为当代心力衰竭药物治疗的基石，是心力衰竭和神经激素系统治疗对抗发展的重要^机制1。

有几个小鼠模型可用于心脏衰竭的基本调查。基因模型对探索分子疗法和研究信号通路很有吸引力。然而，这些模型可能与常见的心力衰竭形式无关。其他常见模型包括左前下降 （LAD） 动脉结扎、 横端收缩 （TAC） 和异丙酮醇 （ISO），每个模型针对不同的病理病因^{2、3、4、5 ，6}.LAD动脉结扎诱导前壁心肌梗死，从而创建缺血性心肌病的专用模型。TAC诱导急性压力过载，形成心力衰竭的高血压模型。虽然可以测量压力梯度，允许肥大的分层，但高血压的急性发病缺乏直接的临床^{相关性4。}LAD 和 TAC 型号都需要高水平的外科专业知识才能执行。急性ISO心力衰竭模型模仿应激引起的心肌病，也称为Takotsubo病，其特征是卡他索明的明显增加和左心室的活性，模仿急性心肌梗^{死7， 8}.相比之下，慢性ISO型心力衰竭模型存在晚期心力衰竭的症状特征，慢性高浓度的儿茶酚^胺1。慢性 ISO 模型的优点是，它提供模仿晚期心力衰竭的慢性肾上腺素刺激，并且相对容易产生。研究者应该选择一个模型，最好地概括他们感兴趣的病理学。

这种方法的总体目标是诱导小鼠的心力衰竭，使用植入的微型泵，释放 ISO 持续模仿慢感活化发现心力衰竭^{患者 1 。}该方法简单易用。虽然小鼠菌株之间有明显差异，但以30毫克/千克/天在30mg/kg/天下施用3至4周的ISO足以诱导大多数小鼠进行心脏重塑。具体来说，ISO在第1周导致亲肥大补偿阶段，随后在第2周^和第32周出现壁变薄、心室扩张和收缩功能下降。ISO模型创建的成功可以通过连续的超声心动图在体内评估，证明肥大、扩张和心室功能障碍，以及通过组织学和分子评估采集的心脏组织进行肌萎缩性功能评估。脂质积累，纤维化，ER压力，凋亡，和基因表达9，10，11，12。

研究方案

该协议符合加州大学洛杉矶分校的动物护理指南（ARC 协议#2010-075）。建议读者遵守自己的IACUC批准的协议，因为近程序小鼠护理和麻醉管理可能是特定于机构的。

1. 制备异丙酮醇渗透泵

注:此程序已成功应用于9周以上雌性小鼠，体重超过18克，来自100多个近亲繁殖小鼠菌株，以及一个菌株子集的雄性小鼠。此过程没有最大重量限制。始终包括年龄匹配的对照，因为治疗年龄是否影响异丙酮醇对心力衰竭发展的易感性是未知的。

1. 称量并记录每只鼠标的体重。
2. 计算每只小鼠的异丙酮醇的适当量和浓度（见表1 ;补充文件）。
   注:本实验中使用的渗透泵（材料表）的储液罐体积为100 μL，旨在以连续流速输送药物长达28天。为每个泵准备额外的 20 μL 异丙醇溶液，以考虑泵加载期间灌装管的体积损失。
3. 使用分析平衡量称出适量的异丙酮醇（表1），并将其溶解在120μL无菌0.9%NaCl溶液中。大力移液或涡旋1分钟，完全溶解异丙酮醇。
   注:在实验室生物安全柜中准备渗透泵。泵应用手术手套处理。在整个渗透泵的制备和手术植入过程中，推荐使用无菌技术。
4. 称重并记录空渗透泵及其流量调节器，然后拆量调节器。
5. 将 120 μL 异丙酮醇溶液吸入 1.0 mL 注射器，并连接渗透泵随附的 27 度钝头填充管。
   注:确保注射器和灌装管没有气泡。
6. 将泵保持直立位置时，通过顶部的泵开口插入加注管，直到加注管的尖端位于泵储液罐底部附近。
7. 缓慢地推动注射器柱塞，直到异丙酮醇溶液充满泵开口，从而加载渗透泵。
8. 小心地拆下填充管并擦掉多余的溶液。
9. 插入回流调节器以关闭泵并擦去任何多余的溶液。
10. 通过重新称重渗透泵，确认超过 90% 的储液罐体积已加满。
    注:控制泵的制备方式与向泵储液罐中注入无菌 0.9% NaCl 溶液的方式相同。

2. 手术器械的准备

1. 清洁所有手术器械，包括光纤 O 型环光显微镜照明灯、2 钳子、针架、热珠消毒器、玻璃珠和剪刀（材料表）。
2. 在121°C下进行高压灭菌手术器械30分钟，在手术前对器械进行消毒。

3. 异丙酮醇渗透泵手术植入

1. 将小鼠放入诱导室，在 95% O2 和 5% CO2 中放置 3% 的分氟酶，从而诱导麻醉。通过诺塞酮维持麻醉与2%的异常鲁兰。
2. 将5毫克/千克的卡罗芬（Carprofen s.c.）施用至肩部刀片之间的颈部擦伤，以治疗性痛风。
3. 将眼部膏放在眼睛上，以防止角膜脱水。
4. 通过监测呼吸速率、脚趾捏反射和粘膜的颜色来检查麻醉深度。
5. 将鼠标放在加热垫上的上等位置。去除下腹部的头发，用贝他丁或氯西丁对皮肤进行消毒。
   注:为尽量减少术后感染，请确保手术场没有事故毛发。
6. 使用一把手术剪刀切割一个1厘米长的中线皮肤切口。使用一把钝端剪刀仔细解剖底层壁的皮肤。
   注: 最好采用腹内输送来容纳泵的大小。
7. 用钳子将围肠壁从下肠道拉开，并用精细的手术剪刀在围肠壁上切开一个0.8厘米的洞。
8. 先将渗透泵插入带流量调节器端的围层腔中。
9. 以中断的方式使用 5.0 可吸收缝合线关闭围网壁中的保持。使用 6.0 不可吸收缝合线以中断的方式关闭皮肤切口。
10. 将鼠标放入专用培养箱中，使其在恢复过程中保持温暖和干燥。通过在头两小时内每30分钟监测一次小鼠，以恢复正常的呼吸和运动，评估麻醉的恢复情况。
11. 一旦小鼠从麻醉中完全恢复，将其返回到常规外壳。继续每天监测动物的并发症，最多3天，然后每2至3天，直到实验结束。
    注:应监测动物术后疼痛或感染、体重减轻迹象、行动不便、姿势异常、无法梳理以及切口区域过度舔或咬。
12. 每24小时施用卡罗芬5mg/kg s.c.，长达48小时，此后根据需要。
13. 在饮用水中施用0.25毫克/mL阿莫西林5天，以防止手术部位感染。
14. 7 至 10 天后去除不可吸收的缝合线。

4. 麻醉下的超声心动图评估

注:可反复进行超声心动图评估，以监测数周内心脏重塑的连续。我们每周进行一次超声心动图测量，为期 3 周。

1. 诱导麻醉在诱导室在1.25%至1.5%的异常鲁兰。一旦适当镇静，用胶带将鼠标固定在回声心形图平台上，让小鼠通过鼻锥继续接受麻醉。
2. 将异二苯减为维持剂量为1%，以尽量减少过度镇化的负时间性和不热带作用。在整个研究中注意呼吸和心率，并根据需要调整胶质剂量。
3. 去除胸毛与脱毛化妆水和擦拭胸部无毛。
4. 将超声波凝胶放在胸部，并放置超声波探头以成像心脏。
5. 在 B 模式下，在半轴长轴视图中对左心室 （LV） 进行成像。调整超声心动图平台，使超声束平面中的主动脉瓣和 LV 顶点对齐。
6. 倾斜超声心动图平台，将 LV 长轴置于 90 度处，将超声波光束和 LV 最大直径置于图像中心。
7. 通过转动超声波探头 90 度，对 LV 短轴进行成像。
8. 在 M 模式下测量 LV 壁厚和内部尺寸。
9. 将鼠标放回笼子。监测正常呼吸和自发身体运动返回。

结果

在我们之前发表的研究中，我们通过渗透泵在105种混合小鼠多样性面板（HMDP）^菌株2、13中施用ISO剂量为30mg/kg/d。我们使用在ISO治疗的基线第1、2和3周进行的超声心动图评估结果（图1）。与先前的研究类似，作者研究了异丙酮醇在23个小鼠^菌株14中的影响，我们观察到超声心动图参数之间惊人的菌株间变异。根据?...

讨论

我们已经将这种方法应用于超过100多种近亲小鼠，以评估慢性β-肾上腺素刺激引起的心脏^{结果2，13。}已知在小鼠菌株中存在异丙酮醇的易感性显著差异，可根据所需兴趣菌株进行定制¹⁶。这可能是由于小鼠^菌株17之间β-肾上腺素受体功能的变化，自主神经系统^活性16的菌株依赖性差异，β-肾上腺素受?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place	Alzet	Model 1004	Includes filling tube, flow moderator and pump body
(-)-Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	16504-1G	(-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C.
1 ml sterile syringe	VWR	BD309602
30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator	AmScope	SKU: LED-30WR
5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture	Ethicon	J303H	5-0, absorbable
Fine Scissors - Sharp	FST	14060-09
Glass beads	FST	18000-46
Hot bead sterilizers	FST	18000-50
Iris forceps	WPI	15915
Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture	LOOK	AA-2176	6-0, non-absorbable
Needle holder	WPI	15926
Normal Saline, 0.9% NaCl	Fisher	89167-772