Farelerde Kalp Yetmezliğine Neden Olmak Için İzoproterenol Mini PompasıNın İmplantasyonu

Özet

İmplante ozmotik pompa ile izoproterenol kronik uygulama farelerde ileri kalp yetmezliği taklit etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Burada, 3 hafta boyunca sürekli izoproterenol uygulaması için cerrahi mini pompa implantasyonunda ayrıntılı yöntemlerin yanı sıra başarılı model oluşturma için ekokardiyografik değerlendirme yi açıklıyoruz.

Özet

Izoproterenol (ISO), seçici olmayan bir beta-adrenerjik agonisttir, farelerde kardiyak yaralanmaya neden olmak için yaygın olarak kullanılır. Akut model strese bağlı kardiyomiyopatiyi taklit ederken, ozmotik pompa ile yönetilen kronik model, insanlarda ileri kalp yetmezliğini taklit eder. Açıklanan protokolün amacı, implante edilmiş bir mini pompa kullanarak farelerde kronik ISO kaynaklı kalp yetmezliği modeli oluşturmaktır. Bu protokol, 100+ suşinda kalp yetmezliğine neden olmak için kullanılmıştır. Cerrahi pompa implantasyonu teknikleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve farelerde bir kalp yetmezliği modeli oluşturmak isteyen herkes için ilgili olabilir. Buna ek olarak, her gerginlik için ekokardiyografik parametrelere dayalı haftalık kardiyak remodeling değişiklikleri ve model gelişimi için beklenen zaman sunulmaktadır. Özetle, yöntem basit ve tekrarlanabilir. İmplante edilen mini pompa ile 3-4 hafta boyunca uygulanan sürekli ISO, kardiyak remodeling yapmak için yeterlidir. Son olarak, ISO modeli oluşturma başarısı hipertrofi, ventrikül dilasyonu ve disfonksiyon gösteren seri ekokardiyografi ile in vivo olarak değerlendirilebilir.

Giriş

Azaltılmış ejeksiyon fraksiyonu ile kalp yetmezliği (HFrEF) kardiyovasküler homeostazı korumak için sempatik sinir sisteminin iyi tanınan telafi edici yanıt eşlik ediyor¹. Kronik aktivasyon ile kalp ve dolaşım üzerine hemodinamik stres ve zararlı etkiler gözlendi. Bunlar kalp yetmezliği için çağdaş farmakoterapinin temel taşı haline gelmiştir ve nörohormonal sistemlerin kalp yetmezliği ve terapötik antagonizmasının ilerlemesinde önemli mekanizmalardır^1.

Birkaç fare modelleri kalp yetmezliği temel araştırmalar için kullanılabilir. Genetik modeller moleküler tedavileri keşfetmek ve sinyal yollarını araştırmak için çekicidir. Ancak, bu modeller kalp yetmezliği ortak formları ile ilgili olmayabilir. Diğer yaygın modeller sol anterior inen (LAD) arter ligasyonu, transaortik daralma (TAC), ve izoproterenol (ISO), her biri farklı bir patolojik^etiyoloji2 hedefleyen^{,3,4,5 ,6}. LAD arter ligasyonu böylece iskemik kardiyomiyopati için özel bir model oluşturarak bir anterior duvar miyokard infarktüsü indükler. TAC kalp yetmezliği hipertansif bir model oluşturmak için akut basınç aşırı neden olur. Basınç gradyanı ölçülebilmesine rağmen, hipertrofi tabakalaşmasıiçin izin, hipertansiyon akut başlangıçlı doğrudan klinik alaka yoksun⁴. Hem LAD hem de TAC modelleri yürütmek için yüksek düzeyde cerrahi uzmanlık gerektirir. Kalp yetmezliği Akut ISO modeli strese bağlı kardiyomiyopati taklit, Ayrıca Takotsubo hastalığı olarak bilinen, akut miyokard infarktüsü taklit sol ventrikül katekolaminler ve aktivite belirgin bir artış ile karakterizedir^{7, 8 .} Buna karşılık, kalp yetmezliği kronik ISO modelleri katekolaminler kronik yüksek düzeyde ile, ileri kalp yetmezliği belirtileri özellikleri mevcut¹. Kronik ISO modelinin avantajları, ileri kalp yetmezliğini taklit eden kronik adrenerjik stimülasyon sağlaması ve oluşturmasının nispeten kolay olmasıdır. Araştırmacı, patolojilerini en iyi şekilde özetleyen bir model seçmeli.

Bu yöntemin genel amacı, kalp yetmezliği hastalarında bulunan kronik sempatik aktivasyonu taklit etmek için sürekli ISO bültenleri implante mini pompa kullanarak farelerde kalp yetmezliği indüklemek için¹. Yöntem basit ve tekrarlanabilir. Fare suşları arasında belirgin bir varyasyon olmasına rağmen, 30 mg/kg/gün'de 3 ila 4 hafta arasında uygulanan ISO, çoğu farede kardiyak remodeling yapmak için yeterlidir. Özellikle, ISO hafta boyunca pro-hipertrofik kompansatör faz yol açar 1 duvar inceltme, ventrikül dilatasyonu ve hafta sistolik fonksiyon azalma takip 2 ve 3². ISO modelinin oluşturulmasında başarı hipertrofi, dilatasyon ve ventriküler disfonksiyonu gösteren seri ekokardiyografi ile in vivo olarak değerlendirilebilir, ayrıca miyokardiyal için hasat edilen kardiyak dokunun histolojik ve moleküler değerlendirilmesi yoluyla eksinyolen lipid birikimi, fibrozis, ER stres, apoptoz, ve gen ekspresyonu^9,10,11,12.

Protokol

Bu protokol Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles hayvan bakım kurallarına bağlıdır (ARC protokolü #2010-075). Peri-prosedür fare bakımı ve analjezi yönetimi kuruma özgü olabileceğiiçin okuyucuların kendi IACUC onaylı protokollerine uymaları tavsiye edilir.

1. Isoproterenol ozmotik pompa hazırlanması

NOT: Bu işlem, 100'den fazla inbred fare suşlarından 18+ g ağırlığındaki 9+ haftalık dişi farelerde ve suşların bir alt kümesindeki erkek farelerde başarıyla uygulanmıştır. Bu işlem için maksimum vücut ağırlığı sınırı yoktur. Tedavi yaşının kalp yetmezliği gelişimine karşı isoproterenol kaynaklı duyarlılığı etkileyip etkilemediği bilinmediği için her zaman yaşla uyumlu kontrolleri ekleyin.

1. Her fare için vücut ağırlığını tartın ve kaydedin.
2. Her fare için uygun miktarda ve izoproterenol konsantrasyonunu hesaplayın (Bkz. Tablo 1 ; Ek Dosya).
   NOT: Bu deneyde kullanılan ozmotik pompalar(Malzeme Tablosu)100 μL'lik bir rezervuar hacmine sahiptir ve 28 güne kadar sürekli akış hızlarında ilaç teslim etmek üzere tasarlanmıştır. Pompa yüklemesi sırasında dolum tüpündeki hacim kaybını hesaba katmak için pompa başına fazladan 20 μL'lik bir isoproterenol çözeltisi hazırlayın.
3. Analitik bir denge kullanarak uygun miktarda isoproterenol(Tablo 1)tartın ve 120 μL steril %0,9 NaCl çözeltisi içinde eritin. Pipet şiddetle veya girdap için 1 dakika tamamen izoproterenol solubilize etmek.
   NOT: Ozmotik pompaları bir laboratuvar biyogüvenlik kabininde hazırlayın. Pompalar cerrahi eldivenlerle kullanılmalıdır. Steril teknik ozmotik pompaların hazırlanması sırasında ve cerrahi implantasyon işlemi sırasında tavsiye edilir.
4. Tartmak ve akış moderatör ile birlikte boş ozmotik pompa kaydetmek ve daha sonra akış moderatör kaldırın.
5. 1.0 mL şırınga içine 120 μL isoproterenol çözeltisi aspire ve ozmotik pompalar ile sağlanan 27-gauge künt uçlu dolum tüpü takın.
   NOT: Şırınga ve dolum tüpünün hava kabarcıklarından arındırılmış olduğundan emin olun.
6. Pompayı dik konumda tutarken, dolum tüpünün ucu pompa haznesinin altına yakın olana kadar dolgu tüpünü üstteki açılan pompadan takın.
7. Izoproterenol çözeltisi pompa nın açılmasına kadar dolana kadar şırınga pistonlarını yavaşça iterek ozmotik pompayı yükleyin.
8. Dolgu tüpünü dikkatlice çıkarın ve fazla çözeltiyi silin.
9. Pompayı kapatmak için akış moderatörüne geri takın ve fazla çözümü silin.
10. Rezervuar hacminin %90'Dan fazlasının ozmotik pompanın yeniden tartılarak doldurulduğundan onaylayın.
    NOT: Kontrol pompaları, pompa haznesini steril %0,9 NaCl çözeltisi ile doldurarak aynı şekilde hazırlanır.

2. Cerrahi aletlerin hazırlanması

1. Fiber optik O-ring ışık mikroskobu aydınlatıcı, 2 adet forceps, iğne tutucu, sıcak boncuk sterilizatörler, cam boncuklar ve makas(Malzeme Tablosu)dahil olmak üzere tüm cerrahi aletleri temizleyin.
2. Otoklav cerrahi aletleri 121 ° C 30 dakika için ameliyat öncesi aletleri sterilize etmek.

3. Isoproterenol ozmotik pompa cerrahi implantasyon

1. Fareyi %95 O2 ve %5 CO2'de %3 izofluran ile indüksiyon odasına yerleştirerek anesteziyi teşvik edin. Anesteziyi nosekon ile %2 isofluran ile koruyun.
2. Analjezi için kürek kemikleri arasında boynun ensesine 5 mg/kg karprofen s.c. uygulayın.
3. Kornea dehidratasyon önlemek için gözlere oftalmik merhem yerleştirin.
4. Solunum hızı, ayak ucutu refleksve mukoza rengi izleyerek anestezi derinliğini kontrol edin.
5. Fareyi ısıtılmış bir ped üzerinde supine pozisyonunda yerleştirin. Alt karın saç çıkarın ve betadin veya klorheksidin ile cilt dezenfekte.
   NOT: Ameliyat sonrası enfeksiyonu en aza indirmek için, cerrahi alanın olay kıllarından arındırılmış olduğundan emin olun.
6. 1 cm uzunluğunda orta hat deri kesi kesmek için cerrahi makas bir çift kullanın. Altta yatan periton duvarlarından deriyi dikkatlice incelemek için bir çift künt uçlu makas kullanın.
   NOT: Pompanın büyüklüğünü karşılamak için intraperitoneal teslimat tercih edilir.
7. Periton duvarlarını forceps ile altta yatan bağırsaktan uzaklaştırın ve ince cerrahi makas kullanarak periton duvarlarında 0,8 cm'lik bir delik kesin.
8. Önce akış moderatörü ile periton boşluğuna ozmotik pompa yerleştirin.
9. Periton duvarlarındaki tutunucuyu 5.0 emilebilir dikişleri kesintiye uğramış bir şekilde kullanarak kapatın. Cilt kesisini kesintiye uğramış bir şekilde kapatmak için 6.0 emilemez dikişler kullanın.
10. Kurtarma sırasında fareyi sıcak ve kuru tutmak için özel bir kuluçka makinesine yerleştirin. Normal solunum ve hareket dönüşü için ilk iki saat içinde her 30 dakikada bir fareyi izleyerek anesteziden iyileşmeyi değerlendirin.
11. Fare anesteziden tamamen iyileştikten sonra, rutin gövdeye geri döndürün. Deney sonuna kadar her gün 3 güne kadar ve daha sonra her 2-3 gün sonra komplikasyonlar için hayvan izlemeye devam edin.
    NOT: Hayvanlar ameliyat sonrası ağrı veya enfeksiyon, kilo kaybı belirtileri, hareket kabiliyeti eksikliği, anormal duruş, damat yetersizliği ve kesi bölgesinin aşırı yalama veya ısırma belirtileri için izlenmelidir.
12. Carprofen 5mg/kg s.c. her 24 saat kadar 48 saat ve daha sonra gerektiği gibi uygulayın.
13. Cerrahi alan enfeksiyonlarını önlemek için içme suyunda 5 gün boyunca 0.25 mg/mL amoksisilin uygulayın.
14. 7 ila 10 gün sonra emilmeyen dikişleri çıkarın.

4. Anestezi altında ekokardiyografik değerlendirme

NOT: Birkaç hafta boyunca seri kardiyak remodelasyonu izlemek için ekokardiyografik değerlendirme tekrar tekrar yapılabilir. 3 hafta boyunca haftalık aralıklarla ekokardiyografik ölçümler yaptık.

1. Isofluran%1.25 ila %1.5 oranında indüksiyon odasında anestezi edin. Uygun şekilde sakinleştirildikten sonra, farenin bir burun konisi aracılığıyla anestezi almaya devam etmesini sağlayan bantla ekokardiyografi platformuna sabitleyin.
2. Aşırı sedasyonun negatif kronotropik ve inotropik etkilerini en aza indirmek için %1'lik bir bakım dozajına indirgen. Çalışma boyunca solunum ve kalp hızlarını dikkate alın ve gerektiğinde isofluran dozunu ayarlayın.
3. Bir depilatif losyon ile göğüs saç çıkarın ve saç ücretsiz göğüs silin.
4. Ultrason jelini göğüse yerleştirin ve ultrason sondasını kalbi görüntülemek için konumlandırın.
5. B modunda, parasternal uzun eksenli görünümde sol ventrikül (LV) görüntü. Ultrason ışınının düzlemindeki aort kapağını ve LV apeksini hizalamak için ekokardiyografi platformını ayarlayın.
6. Lv uzun eksenini ultrason ışınına ve LV maksimum çapını görüntünün merkezine yerleştirmek için ekokardiyografi platformını yatırın.
7. Ultrason sondasını 90 derece çevirerek LV kısa eksenini görüntüleyin.
8. M modunda LV duvar kalınlığı ve iç boyutları ölçün.
9. Fareyi kafese geri yerleştirin. Normal solunum ve spontan vücut hareketlerinin geri dönüşü için monitör.

Sonuçlar

Daha önce yayınlanan çalışmamızda, 105 Hibrid Fare Çeşitliliği Paneli (HMDP) suşları 2^,13arasında ozmotik pompa ile 21 gün boyunca 30 mg /kg/d iso dozu uygulandı. ISO tedavisinin 1, 2 ve3. Yazarlar arasında izoproterenol etkisini okudu önceki bir çalışmada benzer 23 fare suşları¹⁴, biz ekokardiyografik parametreler arasında çarpıcı inter-zorlanma varyasyon gözlendi. Ekokardiyografik p...

Tartışmalar

Bu yöntemi kronik beta-adrenerjik stimülasyon^a2,13nedeniyle kardiyak sonuçları değerlendirmek için 100' den fazla inbred fare suşlarına uyguladık. Izoproterenol duyarlılık önemli farklılıklar fare suşları arasında var olduğu bilinmektedir ve gerektiğinde ilgi zorlanma özelleştirilebilir¹⁶. Bu fare suşları arasında beta-adrenerjik reseptör fonksiyonu varyasyon u olabilir¹⁷, otonom sinir siste...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Osmotic Pump System with Flow Moderator in Place	Alzet	Model 1004	Includes filling tube, flow moderator and pump body
(-)-Isoproterenol hydrochloride	Sigma-Aldrich	16504-1G	(-)-Isoproterenol hydrochloride is a powder that needs to be stored at -20°C.
1 ml sterile syringe	VWR	BD309602
30 W LED Fiber optic O-ring light microscope illuminator	AmScope	SKU: LED-30WR
5-0 COATED VICRYL (polyglactin 910) Suture	Ethicon	J303H	5-0, absorbable
Fine Scissors - Sharp	FST	14060-09
Glass beads	FST	18000-46
Hot bead sterilizers	FST	18000-50
Iris forceps	WPI	15915
Look Sharpoint 6-0, 18" Black Nylon Monofilament Suture	LOOK	AA-2176	6-0, non-absorbable
Needle holder	WPI	15926
Normal Saline, 0.9% NaCl	Fisher	89167-772