יחסי למחצה כמותית של התרופה מגיב יציבות היעד (חצים) שיטת לימוד האינטראקציה Rapamycin/mTOR

Summary

במחקר זה, הצלחנו לשפר את יכולות ניתוח הנתונים של הניסוי חצים על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים והערכת האהדה של ליגוניות חלבונים ואינטראקציות. ניתן להתוות את האינטראקציות לשתי עקומות: עקומת פרוטחרדה ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה של mTOR-rapamycin כמקרה מופתי.

Abstract

זיקה לסמים יציבות היעד (משחק דארטס) היא שיטה איתנה לזיהוי מטרות מולקולות קטנות של חלבון מולקולה. ניתן להשתמש בו כדי לאמת אינטראקציות קטנות ומולקולות של חלבונים ולמצוא מטרות חלבון פוטנציאליות עבור מוצרים טבעיים. לעומת שיטות אחרות, חצים משתמש יליד, לא שונה, מולקולות קטנות הוא פשוט וקל לתפעול. במחקר זה, אנו משפרים עוד יותר את יכולות ניתוח הנתונים של הניסוי חצים על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים והערכת הזיקה של חלבונים ליגוניים ואינטראקציות. ניתן להתוות את החלבון-ligand אינטראקציות לשתי עקומות: עקומת פרוטחרדה ועקומת תלות במינון. השתמשנו באינטראקציה של mTOR-rapamycin כמקרה מופתי להקמת הפרוטוקול שלנו. מתוך עקומת נגד חרדה ראינו כי פרוטפוליזיס של mTOR על ידי בינוי היה מעוכב על ידי נוכחות של rapamycin. עקומת תלות המינון אפשרה לנו להעריך את הזיקה המחייב של rapamycin ו mTOR. שיטה זו עשויה להיות שיטה רבת עוצמה ופשוטה לזיהוי מדויק של חלבונים ביעד הרומן ולמיטוב האירוסין של מטרת הסמים.

Introduction

זיהוי מולקולה קטנה היעד חלבונים הוא חיוני הבנה מכניסטית ופיתוח של תרופות טיפוליות פוטנציאליות^1,2,3. אהדה כרומטוגרפיה, כשיטה קלאסית לזיהוי חלבונים היעד של מולקולות קטנות, הניב תוצאות טובות^4,5. עם זאת, שיטה זו יש מגבלות, בשינוי כימי זה של מולקולות קטנות לעתים קרובות גורמת מופחת או שונה ספציפיות הקשירה או אהדה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, כמה אסטרטגיות חדשות פותחו לאחרונה ויישם כדי לזהות את מטרות המולקולה הקטנה ללא שינוי כימי של מולקולות קטנות. אלה שיטות ישירות לזיהוי היעד של מולקולות קטנות ללא תוויות כוללות עמידות בפני התרופה ביציבות היעד (חצים)⁶, יציבות של חלבונים משיעורי חמצון (sprox)⁷, הטלפון התרמי משמרת תרמית (cetsa)^{8 ,9}, ו התרמי פרופיל פרוטדום (tpp)¹⁰. שיטות אלה הן יתרון מאוד כי הם משתמשים טבעיים, מולקולות קטנות שאינן בשימוש ולהסתמך רק על אינטראקציות כריכה ישירה למצוא חלבונים היעד¹¹.

בין אלה שיטות חדשות, חצים היא מתודולוגיה פשוטה יחסית שיכולה בקלות להיות מאומצת על ידי רוב מעבדות^12,13. החצים תלויים במושג כי חלבונים ליגטיים להפגין שונה רגישות השפלה אנזימטית ביחס לחלבונים לא מאוגדים. חלבון היעד החדש יכול להיות מזוהה על ידי בחינת הלהקה שונה ב SDS-דף ג ' ל באמצעות ספקטרומטריה כרומטוגרפיה נוזלית המסה (LC-MS/MS). גישה זו יושמה בהצלחה לזיהוי של מטרות לא ידועות בעבר של מוצרים טבעיים ותרופות^{14,15,16,17,18} , ¹⁹. הוא גם חזק כאמצעי למסך או לאמת קשירה של תרכובות לחלבון מסוים^20,21. במחקר זה, אנו מציגים שיפור לניסוי על ידי ניטור השינויים ביציבות החלבונים עם מולקולות קטנות וזיהוי ליגולי חלבונים וכריכה. אנו משתמשים באינטראקציה mTOR-rapamycin כדוגמה כדי להדגים את הגישה שלנו.

Protocol

1. לאסוף ולקבל תאים

1. לגדל תאים 293T באמצעות מדיום שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% סרום עוברי, 2 מ"מ גלוטמין ו 1% אנטיביוטיקה. תרבות הדגירה ב 37 ° c תחת 5% CO₂.
   הערה: מצב הגדילה של התאים עלול להשפיע על היציבות של הניסויים הבאים.
2. הרחב את התאים בתרבות עד שנגיע ל-80 \ u201290% זרימה.
3. מערבבים 345 μL של פירוק התא מגיב (לראות את הטבלה של חומרים) עם 25 μl של קוקטייל מעכב הפרוטאז 20x, 25 μl של 1 M נתרן פלואוריד, 50 μl של 100 mM β-glycerophosphate, 50 μl של המלח מילימטר נתרן פירופוספט, ו-5 μl של ה50 מילימטר נתרן. השאר את מאגר הליזה מקורר בקרח.
   הערה: מאגרי הליזה אחרים עם דטרגנטים שונים (לדוגמה, טריטון X-100 או NP-40) יכולים לשמש עם חצים כל עוד הם לא משתמשים. חלבונים ממברנה או חלבונים גרעיניים יכול להיות מופק על ידי הוספת 0.4% טריטון X-100 או 0.4% NP-40 ליפוסט התא.
4. רוחצים את התאים פעמיים עם תמיסת מלח באגירה קרה (PBS).
5. השתמש מגרד התא כדי לאסוף את התאים בכמות מתאימה של מאגר פירוק תאים ולהעביר את התאים lysing לתוך צינור 1.5 mL.
   הערה: מספר התאים הדרושים עבור כל ניסוי בחצים ישתנו בהתאם לכמות החלבון שניתן לחלץ מקווי תאים שונים. באופן כללי, ריכוז החלבון של הליפוסט המשמש הוא בין 4 \ u20126 μg/μL. 1 10 ס מ לוחית של תאים 293T ב 85 \ u201290% שליטה, לאחר עם 300 μL של מאגר לליזה בדרך כלל תוצאות ליפוסט עם ריכוז חלבון של ~ 5 μg/μL.
6. מערבבים את מאגר הליזה/התאים ליסינג גם היטב ומכשלי את השפופרת על הקרח במשך 10 דקות.
7. צנטריפוגה את הצינור ב 18,000 × g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
8. העבר את הסופרנטאנט לתוך צינור 1.5 mL חדש ושמור על קרח.
9. ביצוע שיטת BCA לקירוב ריכוז החלבון של lysates.

2. החלבון ליסביטים עם המולקולה הקטנה

1. פיצול 99 μL של lysates לשני שפופרות 1.5 mL.
2. להפוך ריכוז המניה ההתחלתית של 10 מ"מ מולקולה קטנה. בעת ביצוע חצים, אחד יכול להתחיל בריכוז גבוה יותר של המולקולה הקטנה (5 \ u201210x הערך EC50) כדי להבטיח מחייב אופטימלי.
   1. הוסף 1 μl של הממס כי המולקולה הקטנה מסיסים ב או 1 μl של פתרונות מניות קטנים מולקולה כל סדרת מחלקים של ליפוסט. הצינוק הנייד לאחר עם פתרונות עבור 30 \ u201260 min בטמפרטורת החדר עם טלטול.
3. על הקרח, הקמת מדלל סדרתי (1:200, 1:400, 1:800 ו-1:1600) של פתרון בינוי טרי x TNC (עבור 1 מ ל של מאגר 10x TNC, לערבב 300 μL של מים באולטרסאונד עם 100 μL של 5 M נתרן כלוריד, 100 μL של 1 M סידן כלוריד , ו 500 μL של 1 M טריס-HCl, pH 8.0).
4. לבחון מגוון רחב של בינוי: יחסי חלבון (למשל, המשתרעים מ-1:100 עד 1:2000) כדי להבטיח את היכולת של השפעת הצעד הנבון על המטרה (ים).
   הערה: כדי לחשב את ריכוזי הצורות (לדוגמה): 5 הריכוז הפרוטאין μg/μL x 20 מדגם μL = 100 μg חלבון. עבור כינוי: החלבון יחס של 1:100 אנחנו צריכים 0.5 μg/μL (100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL) הפתרון. ייתכן שיהיה צורך לחזור על ניסוי זה מספר פעמים כדי לקבל מגוון מתאים של בינוי: יחס החלבונים.

3. בצע הפרוטפוליזיס

הערה: עבור פרוטפוליזיס, שלבים מתבצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת

1. בעקבות דגירה עם מולקולה קטנה, לחלק כל סדרת מחלקים ל 20 μl דגימות.
2. הוסף 2 μL של מגוון הפתרונות הייחודיים בכל מדגם במרווחי זמן ספציפיים (כל 30 s). השתמש בנפח שווה של מאגר TNC של 1x כדי ליצור מדגם בקרה שאינו מתעכל.
3. לאחר 5 \ u201220 min, להפסיק את העיכול באמצעות תוספת של 2 μL של הצטננות 20x מעכב פרוטאז הקוקטייל כל 30 s. מערבבים היטב ו-דגירה על הקרח 10 דקות.
4. לדלל דגימות עם נפח מתאים של 5x SDS-עמוד טעינת מאגר ולרתוח ב 95 ° c עבור 5 דקות.
5. ביצוע החלק הבא של הניסוי או לאחסן את דגימת החלבון ב--80 ° c.

4. בדיקת קוונפיקציה וניתוח

1. לאחר החצים, לבצע מכתים כחול Coomassie לפי הפרוטוקול שפורסם בעבר²².
2. להקות החלבון המוכתמת צריכות להיות ברורות מאוד לאחר הדתמת. יוצקים את הפתרון המשמש destain ולהוסיף טריים 1% חומצה אצטית תמיסה כדי לכסות את הג. הניחו את הג מתחת לאור כדי להתבונן בלהקות עם הבדלים משמעותיים בין קבוצות עם (קבוצת לדוגמה) או ללא (קבוצת בקרה) את המולקולה הקטנה.
3. חותכים את שתי הלהקות המקבילות מהג עם כלי סטרילי ולבצע LC-MS/MS מיד.
   הערה: LC-MS/MS צריך להיעשות בהקדם האפשרי בגלל החלבונים ב ג'ל לבזות ברציפות.
4. לעכל את הלהקות, לחלץ פפטידים ולבצע LC-MS/MS ניתוח²³.
   1. כדי לנתח נתוני LC-MS/MS, הראשון לזהות את כל החלבונים בלהקה בודדים. שנית, להשתמש הספקטרום פפטיד להתאים (PSM) כדי לייצג את השפע של כל חלבון.
      הערה: PSM מספק את המספר הכולל של רצפי פפטיד מזוהה עבור החלבון, כולל אלה יתיר זוהו. באופן כללי, באיזו תכיפות פפטיד מזוהה/רצף יכול לשמש הערכה גסה של כמה שופע החלבון הוא במדגם. חלבונים המועשרת בקבוצת המדגם בקבוצת הביקורת הם חלבונים של עניין.
5. להשיג את הנוגדנים העיקריים של החלבונים שנבחרו. בצעו את הכתם המערבי כדי לוודא שהמולקולה הקטנה יכולה לאגד ישירות לחלבונים ביעד הפוטנציאלי²⁴.
   1. העמיסו כמויות שוות של חלבון לתוך הבארות של 8% SDS-דף ג'ל, יחד עם סמן המשקל המולקולרי המתאים. הפעל את ג'ל עבור 30 דקות ב 80 V, לאחר מכן להתאים את המתח כדי 120 V ולהמשיך לרוץ עבור 1 \ u20122 h.
6. לכמת את להקות חלבון היעד השונים באמצעות עיבוד תמונה וניתוח תוכנה (לראות את הטבלה של חומרים).
7. נתח את הנתונים וצייר את העקומות.
   1. קביעת עקומת פרוטחרדה לחלבון מטרה
      1. היחס בין החלבון הוא מגוון בעת ביצוע הפרוטפוליזיס. נרמל נתונים מניתוח תמונה על-ידי מייחס את ערכי עוצמת הלהקה המתאימים לרצועות הבלתי מעומות ל-100%.
      2. השתמש בניתוח רגרסיה לא לינארית של הניתוח הסטטיסטי ותוכנת הציור כדי להתוות עיקול של נתונים מנורמל לעוצמת הרצועה היחסית והיחס בין החלבונים: יחסי החלבון.
      3. תחילה, פתח את התוכנה, בחר את סוג הטבלה והגרף כ-XY ואפשר 3 לשכפל ערכים בעמודות משנה זה לצד זה. לאחר מכן הזן את הנתונים המתאימים בשטח שמתחת ל-x ו-y. תחת x, להזין את המספרים 0, 1, 2, 3, 4, 5 (כמקום מחזיקי התאים המתאימים: יחסי חלבון).
      4. בעמודה y, הזן את הנתונים המנורמל עבור עוצמות הרצועה היחסיות. בצע "רגרסיה לא לינארית" ויישם "מינון-תגובה-גירוי" באמצעות "יומן (אגוניסט) לעומת תגובה-מדרון משתנה (ארבעה פרמטרים)" משוואה.
      5. המר את הביאורים של ציר ה-X בעקומה ליחסי החלבון המקבילים.
   2. קביעת עקומת התלות במינון לחלבון מטרה
      הערה: לניתוח התלות במינון, המולגינה של המולקולה הקטנה שונה מכל הדגימות. בינוי יציבה: החלבון יחס צריך להיות מידע על ידי ניתוח של נתונים פרוטפוליזיס. כלומר: יחס החלבון שהראה הבדל מקסימאלי בעוצמת החלבון במהלך עקומת פרוטחרדה צריך לשמש לניסוי התלות במינון.
      1. לכמת את להקות חלבון היעד השונים באמצעות תוכנה ניתוח תמונה. כמו ביצירת עקומת התלות במינון, לנרמל נתונים מניתוח תמונה על ידי מייחס את ערכי עוצמת הלהקה המקבילה הלהקה הפחות מתעכל ל 100%.
      2. החלת ניתוח רגרסיה לא לינארית בניתוח הסטטיסטי ותוכנת הציור לנתונים המנורמלות. תחילה, פתח את התוכנה, בחר את סוג הטבלה והגרף כ-XY, והזן 3 שכפול ערכים בעמודות משנה זה לצד זה.
      3. לאחר מכן, הזן את הנתונים המתאימים בשטח שמתחת ל-x ו-y. למשתנה ' x ', יש להזין ריכוזים שונים של המולקולה הקטנה; ' y ' כולל את הנתונים המנורמל המתאימים לעוצמת הרצועה היחסית.
      4. המרה של ערכי x באמצעות X = Log (X). לבסוף, להעסיק רגרסיה לא לינארית, וליישם גירוי במינון תגובה באמצעות "Log (אגוניסט) לעומת תגובה — מדרון משתנה (ארבעה פרמטרים)" משוואה.

תוצאות

תרשים הזרימה של הניסוי מתואר באיור 1. התוצאה של כתמים כחולים Coomassie מוצג באיור 2. הדגירה עם המולקולה הקטנה מקנה הגנה מפני פרוטפוליזיס. שלוש להקות שנראות כהגנה על ידי דגירה עם rapamycin על השליטה ברכב נמצאים. התוצאות הצפויות מניסוי עקומת פרוטחרדה מוצגים

Discussion

חצים מאפשר זיהוי מטרות מולקולה קטנה על ידי ניצול ההשפעה המגנה של כריכת חלבון נגד השפלה. חצים אינו דורש כל שינוי כימי או השתק של המולקולה הקטנה²⁶. זה מאפשר מולקולות קטנות לשמש כדי לקבוע מטרות החלבון המחייב שלהם ישירה. קריטריוני הערכה סטנדרטיים לשיטת החצים הקלאסיים כוללים כתמים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100X Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line	ATCC	CRL-3216	DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Cell scraper	Thermo Fisher	179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution	Bio-Rad	1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 6.0	statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.52	image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent	Thermo Fisher	78501
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	R21-040-CV
Pronase	Roche	PRON-RO	10 mg/ml
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	S7920
Sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	450243
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	221368
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422