라파마이신/mTOR 상호 작용을 연구하기 위한 반정량적 약물 선호도 반응 형 표적 안정성(DARTS) 분석

요약

이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질-리간드 상호작용의 친화성을 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 향상시켰습니다. 상호 작용은 두 개의 곡선으로 플롯 될 수있다: proteolytic 곡선과 용량 의존 곡선. 우리는 모범사례로 mTOR-rapamycin 상호 작용을 사용했습니다.

초록

약물 선호도 반응형 표적 안정성(DARTS)은 신규한 소분자 단백질 표적을 검출하는 강력한 방법입니다. 그것은 알려진된 작은 분자-단백질 상호 작용을 확인 하 고 천연 제품에 대 한 잠재적인 단백질 목표를 찾는 데 사용할 수 있습니다. 다른 방법에 비해 DARTS는 기본, 수정되지 않은 작은 분자를 사용하며 간단하고 작동하기 쉽습니다. 이 연구에서는 단백질 안정성의 변화를 모니터링하고 단백질-리간드 상호작용의 친화성을 추정하여 DARTS 실험의 데이터 분석 기능을 더욱 향상시켰습니다. 단백질-리간드 상호작용은 단백질 용해 곡선과 용량 의존 곡선의 두 가지 곡선으로 플롯될 수 있습니다. 우리는 우리의 프로토콜의 설립을위한 예시 사례로 mTOR- 라파마이신 상호 작용을 사용했다. 프로테올리화 곡선으로부터 우리는 pronase에 의한 mTOR의 프로테오리시스가 라파마이신의 존재에 의해 억제되었다는 것을 보았다. 용량 의존성 곡선은 라파마이신 및 mTOR의 결합 친화성을 추정할 수 있게 해 주었으며, 이를 통해 우리는 라파마이신및 mTOR의 결합친화도를 추정할 수 있게 하였다. 이 방법은 신규표적 단백질을 정확하게 식별하고 약물 표적 참여의 최적화를 위한 강력하고 간단한 방법이 될 가능성이 높습니다.

서문

소분자 표적 단백질을 식별하는 것은 잠재적인 치료 약물의 기계학적이해 및 개발에 필수적이다 1,^2,3. 친화성 크로마토그래피는 소분자의 표적 단백질을 식별하는 고전적인 방법으로서, 좋은^{결과를4,5.} 그러나, 이 방법은 소분자의 화학적 변형이 종종 감소되거나 변형된 결합 특이성 또는 친화도를 초래한다는 점에서 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 몇몇 새로운 전략은 최근에 작은 분자의 화학적 변형 없이 작은 분자 표적을 확인하기 위하여 개발되고 적용되었습니다. 라벨없는 소분자의 표적 식별을 위한 이러한 직접적인 방법은 약물 친화성반응형 표적 안정성(DARTS) 6, 산화율(SPROX)^7,세포열시프션 분석법(CETSA) 8을 포함한다. ^,9, 및 열 프로테오메 프로파일링 (TPP)¹⁰. 이들 방법은 자연적이고 수정되지 않은 소분자를 사용하고 표적 단백질(11)을찾기 위해 직접 결합 상호작용에만 의존하기 때문에 매우 유리하다.

이러한 새로운 방법 중, DARTS는 대부분의 실험실에서 쉽게 채택 할 수있는 비교적 간단한 방법론이다^12,13. DARTS는 리간드 결합 단백질이 언바운드 단백질에 비해 효소 분해에 대한 변형된 감수성을 입증한다는 개념에 의존합니다. 새로운 표적 단백질은 액체 크로마토그래피 질량 분석법 (LC-MS/MS)을 통해 SDS-PAGE 젤의 변경된 밴드를 검사하여 검출할 수 있습니다. 이 방법은 성공적으로 천연 물 및 약물의 이전에 알려지지 않은 대상의 식별을 위해 구현되었습니다^{14,15,16,17,18, 19}. 또한 특정 단백질^20,21에화합물의 결합을 스크리크 또는 검증하는 수단으로강력하다. 본 연구에서는, 우리는 작은 분자를 가진 단백질 안정성에 있는 변경을 감시하고 단백질 리간드 결합 친화도를 확인하 여 실험에 개선을 제시합니다. 우리는 우리의 접근을 설명하기 위하여 보기로 mTOR- rapamycin 상호 작용을 이용합니다.

프로토콜

1. 세포를 수집하고 포액

1. Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 사용하여 10 % 태아 소 혈청, 2 mM 글루타민 및 1 % 항생제를 사용하여 293T 세포를 성장시다. 37°C에서 5% CO2 미만의배양물.
   참고: 세포의 성장 상태는 후속 실험의 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다.
2. 80\u201290% 합류에 도달할 때까지 배양에서 세포를 확장합니다.
3. 345 μL의 세포 용해 시약 (재료 표참조) 20x 프로테아제 억제제 칵테일 25 μL, 불소 나트륨 1개 중 25 μL, 100 mM β-글리세로포스페이트 50 μL, 50 mM 의 50 μL 의 50 μL 또는 50 mmmmmmmmmm. 얼음에 진정 된 라시스 버퍼를 유지 합니다.
   참고: 다양한 세제(예: 트리톤 X-100 또는 NP-40)가 있는 기타 용해 완충제는 변성되지 않는 한 DARTS와 함께 사용할 수 있습니다. 막 단백질 또는 핵 단백질은 세포 용해액에 0.4% 트리톤 X-100 또는 0.4% NP-40을 첨가하여 추출될 수 있다.
4. 차가운 인산염 완충식염수(PBS)로 세포를 두 번 세척합니다.
5. 세포 스크레이퍼를 사용하여 적절한 양의 세포 용해 완충액으로 세포를 수집하고 용해 세포를 1.5 mL 튜브로 옮김을 전달합니다.
   참고: 각 DARTS 실험에 필요한 세포의 수는 다양한 세포주에서 추출할 수 있는 단백질의 양에 따라 달라집니다. 일반적으로, 사용된 용해물의 단백질 농도는 4\u20126 μg/μL 사이이다. 85\u201290% 동률에서 293T 세포의 10cm 플레이트 1개, 용해 완충액300 μL로 용해되어 전형적으로 ~5 μg/μL의 단백질 농도를 가진 용해액을 초래한다.
6. 용해 완충 / 용해 세포를 잘 혼합하고 10 분 동안 얼음에 튜브를 인큐베이션.
7. 4 °C에서 10 분 동안 18,000 × g에서 튜브를 원심 분리합니다.
8. 상급체를 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 얼음에 차갑게 유지하십시오.
9. BCA 분석기를 수행하여 단백질 농도를 근사화합니다.

2. 단백질이 작은 분자로 인큐베이션됩니다.

1. 99 μL의 매해를 두 개의 1.5 mL 튜브로 분할합니다.
2. 10mM 소분자의 시작 재고 농도를 확인합니다. DARTS를 수행할 때, 최적의 결합을 보장하기 위해 소분자(EC50 값 5\u201210x)의 고농도로 시작할 수 있다.
   1. 소분자가 용해되는 용매 의 1 μL 또는 용해물의 각 aliquot에 작은 분자 스톡 용액의 1 μL을 추가합니다. 세포가 흔들림과 실온에서 30\u201260 분 동안 용액으로 용해됩니다.
3. 얼음에, 1 x TNC에 갓 해동 된 프로나제 용액의 직렬 희석 (1 :200, 1:400, 1:800 및 1:1600)을 확립하십시오 (10x TNC 버퍼의 1 mL의 경우, 염화 나트륨 100 μL, 100 μl의 염화나트륨 100 μL, 100 μl의 염화칼슘 100μL을 혼합하십시오. , 1 M Tris-HCl, pH 8.0의 500 μL.
4. 광범위한 프로나제:단백질 비율(예: 1:100에서 1:2000까지)을 검사하여 타겟에 대한 프로나제의 단계적 효과 관찰 가능성을 보장합니다.
   참고: 프로나제 농도(예): 5 μg/μL 단백질 농도 x 20 μL 샘플 = 100 μg 단백질. pronase:1:100의 단백질 비율을 위해 우리는 0.5 μg/μL (100 μg ∞ 100 ∞ 2 μL) 프론나아제 용액이 필요합니다. 본 실험은 적절한 범위의 프로나제:단백질 비를 얻기 위해 여러 번 반복되어야 할 수도 있다.

3. 프로테오리시스 수행

참고: 프로테오용해의 경우, 별도의 언급이 없는 한 실온에서 단계가 수행됩니다.

1. 작은 분자로 배양 한 후, 각 aliquot를 20 μL 샘플로 나눕니다.
2. 특정 간격(30s마다)에 각 샘플에 2 μL의 pronase 솔루션을 추가합니다. 동일한 볼륨의 1x TNC 버퍼를 사용하여 소화되지 않은 제어 샘플을 설정합니다.
3. 5\u201220 분 후, 차가운 20 x 프로테아제 억제제 칵테일 2 μL을 추가하여 소화를 중단하십시오.
4. 5x SDS-PAGE 로딩 버퍼의 적절한 부피로 샘플을 희석하고 95°C에서 5분간 끓입니다.
5. 실험의 다음 부분을 수행하거나 단백질 샘플을 -80°C에 저장합니다.

4. 정량화 및 분석

1. DARTS 후, 이전에 게시 된 프로토콜^(22)에따라 Coomassie 파란색 염색을 수행합니다.
2. 염색된 단백질 밴드는 탈지 후 매우 명확해야 합니다. 사용된 데스테인 용액을 붓고 신선한 1% 아세트산 용액을 첨가하여 젤을 덮습니다. 겔을 빛 아래에 두어 소분자(샘플 그룹)를 가진 그룹 들 또는(대조군)이 없는 그룹 들 사이에 유의한 차이를 가진 밴드를 관찰한다.
3. 멸균 기구로 젤에서 두 개의 해당 밴드를 잘라내고 LC-MS/MS를 즉시 수행합니다.
   참고: LC-MS/MS는 젤의 단백질이 지속적으로 저하되기 때문에 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.
4. 밴드를 다이제스트하고, 펩티드를 추출하고,LC-MS/MS 분석(23)을 수행한다.
   1. LC-MS/MS 데이터를 분석하려면 먼저 개별 대역의 모든 단백질을 식별합니다. 둘째, 펩타이드 스펙트럼 일치(PSM)를 사용하여 각 단백질의 풍부를 나타낸다.
      참고: PSM은 중복으로 확인된 단백질을 포함하는 단백질에 대한 확인된 펩티드 서열의 총 개수를 제공한다. 일반적으로, 얼마나 자주 펩티드가 확인되고/서열화되는지는 단백질이 샘플에서 얼마나 풍부한지에 대한 대략적인 추정치로서 사용될 수 있다. 대조군에 걸쳐 샘플 군에서 농축된 단백질은 관심 있는 단백질이다.
5. 선택된 단백질의 1 차적인 항체를 조달합니다. 작은 분자가 잠재적인 표적 단백질(24)에 직접결합할 수 있는지 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행한다.
   1. 적절한 분자량 마커와 함께 8% SDS-PAGE 젤의 우물에 동일한 양의 단백질을 로드합니다. 80V에서 30분 동안 젤을 실행한 다음 전압을 120V로 조정한 다음 1\u20122 h로 계속 실행합니다.
6. 이미지 처리 및 분석 소프트웨어를 사용하여 상이한 표적 단백질 대역을 정량화합니다(재료 표참조).
7. 데이터를 분석하고 곡선을 그립니다.
   1. 표적 단백질에 대한 단백질 용해 곡선의 결정
      1. 프로나제:단백질 비는 단백질 을 단백질 화 할 때 다양합니다. 소화되지 않은 밴드에 해당하는 밴드 강도 값을 100%로 인식하여 이미지 분석에서 데이터를 정규화합니다.
      2. 통계 분석 및 그리기 소프트웨어의 비선형 회귀 분석을 사용하여 상대 대역 강도 및 단백질 비율에 대한 정규화된 데이터의 곡선을 플로팅합니다.
      3. 먼저 소프트웨어를 열고 테이블 및 그래프 유형을 XY로 선택하고 나란히 있는 하위 열에서 3개의 복제 값을 허용합니다. 그런 다음 x 및 y 아래의 공간에 해당 데이터를 입력합니다. x에서, 숫자 0, 1, 2, 3, 4, 5를 입력한다(장소 홀더로 해당 프로나제:단백질 비).
      4. y 열에 상대 밴드 강도에 대한 정규화된 데이터를 입력합니다. "비선형 회귀"를 수행하고 "로그(agonist) 대 응답-가변 경사(4개의 매개변수)" 방정식을 사용하여 "투여량-응답-자극"을 구현합니다.
      5. 곡선의 X축 주석을 해당 프로나제:단백질 비율로 변환합니다.
   2. 표적 단백질에 대한 용량 의존성 곡선의 결정
      참고 : 용량 의존성 분석을 위해, 작은 분자의 몰은 샘플에 걸쳐 다르다. 안정한 pronase: 단백질 비율은 단백질 분석 데이터의 분석에 의해 통보되어야 합니다. 프로나제:단백질 방출 곡선 동안 표적 단백질 강도의 최대 차이를 보인 단백질 비는 용량 의존성 실험에 사용되어야 한다.
      1. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 상이한 표적 단백질 대역을 정량화합니다. 투여량 의존곡선의 생성과 마찬가지로, 최소 소화된 대역에 해당하는 밴드 강도 값을 100%로 기여하여 이미지 분석에서 데이터를 정규화합니다.
      2. 통계 분석 및 그리기 소프트웨어 내에서 비선형 회귀 분석을 정규화된 데이터에 적용합니다. 먼저 소프트웨어를 열고 테이블 및 그래프 유형을 XY로 선택한 다음 나란히 있는 하위 열에 3개의 복제 값을 입력합니다.
      3. 그런 다음 x 및 y 아래의 공간에 해당 데이터를 입력합니다. 'x' 변수의 경우, 소분자의 상이한 농도를 입력하는; 'y'는 상대 대역 강도에 대한 상응하는 정규화된 데이터를 포함한다.
      4. X = 로그(X)를 사용하여 x 값을 변환합니다. 마지막으로, 비선형 회귀를 사용하고 "로그(agonist) 대 응답-가변 경사(4개의 매개변수)" 방정식을 사용하여 용량-응답 자극을 구현합니다.

결과

실험의 플로우 차트는 그림1에 설명되어 있습니다. 쿠마시 블루 염색의 결과는 그림2에 나와 있습니다. 작은 분자를 가진 배양은 proteolysis에 대하여 보호를 부여합니다. 차량 제어를 통해 라파마이신으로 인큐베이션하여 보호되는 것으로 보이는 3개의 밴드가 발견되었습니다. 프로테오리틱 곡선 실험의 예상 결과는 그림3에 나와 ...

토론

DARTS는 열화에 대한 단백질 결합의 보호 효과를 이타함으로써 작은 분자 표적을 식별할 수 있습니다. DARTS는 소분자(26)의 어떠한 화학적 변형 이나 고정을 필요로 하지 않는다. 이것은 작은 분자가 그들의 직접적인 결합 단백질 표적을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 고전 DARTS 방법에 대한 표준 평가 기준은 겔 염색, 질량 분석 법 및 서부 블로팅^12,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100X Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line	ATCC	CRL-3216	DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Cell scraper	Thermo Fisher	179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution	Bio-Rad	1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 6.0	statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.52	image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent	Thermo Fisher	78501
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	R21-040-CV
Pronase	Roche	PRON-RO	10 mg/ml
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	S7920
Sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	450243
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	221368
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422