Ein semi-quantitativer Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Assay zur Untersuchung der Rapamycin/mTOR-Interaktion

Zusammenfassung

In dieser Studie haben wir die Datenanalysefunktionen des DARTS-Experiments verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwacht enden und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzen. Die Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin-Interaktion als beispielhaften Fall genutzt.

Zusammenfassung

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) ist eine robuste Methode zum Nachweis neuartiger Proteinziele für kleine Moleküle. Es kann verwendet werden, um bekannte kleine Molekül-Protein-Wechselwirkungen zu überprüfen und potenzielle Proteinziele für natürliche Produkte zu finden. Im Vergleich zu anderen Methoden verwendet DARTS native, unveränderte, kleine Moleküle und ist einfach und einfach zu bedienen. In dieser Studie haben wir die Datenanalysefähigkeiten des DARTS-Experiments weiter verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwachten und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzten. Die Protein-Ligand-Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin Interaktion als beispielhaftes Argument für die Erstellung unseres Protokolls genutzt. Aus der proteolytischen Kurve sahen wir, dass die Proteolyse von mTOR durch Pronase durch das Vorhandensein von Rapamycin gehemmt wurde. Die Dosis-Abhängigkeits-Kurve ermöglichte es uns, die Bindungsaffinität von Ramamycin und mTOR abzuschätzen. Diese Methode ist wahrscheinlich eine leistungsfähige und einfache Methode zur genauen Identifizierung neuartiger Zielproteine und zur Optimierung des Wirkstoffzielengagements.

Einleitung

Die Identifizierung kleiner Molekül-Zielproteine ist für das mechanistische Verständnis und die Entwicklung potenzieller therapeutischer Medikamente^{wesentlich 1,2,3}. Die Affinitätschromatographie als klassische Methode zur Identifizierung der Zielproteine kleiner Moleküle hat gute Ergebnisse erbracht^4,5. Diese Methode hat jedoch Grenzen, da die chemische Modifikation kleiner Moleküle oft zu einer reduzierten oder veränderten Bindungsspezifität oder Affinität führt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden kürzlich mehrere neue Strategien entwickelt und angewendet, um die kleinen Molekülziele ohne chemische Modifikation der kleinen Moleküle zu identifizieren. Diese direkten Methoden zur Zielidentifikation von etikettenfreien kleinen Molekülen umfassen die wirkstoffaffinitätsresponsive Zielstabilität (DARTS)⁶, Stabilität von Proteinen aus Oxidationsraten (SPROX)⁷, zellulärer thermischer Schichtassay (CETSA)^{8 ,9}und thermische proteom profiling (TPP)¹⁰. Diese Methoden sind sehr vorteilhaft, da sie natürliche, unveränderte kleine Moleküle verwenden und sich nur auf direkte Bindungswechselwirkungen verlassen, um Zielproteine zu finden¹¹.

Unter diesen neuen Methoden ist DARTS eine vergleichsweise einfache Methode, die leicht von den meisten Labors übernommen werden kann^12,13. DARTS hängt von dem Konzept ab, dass Ligandengebundene Proteine eine modifizierte Anfälligkeit für enzymatische Degradation im Vergleich zu ungebundenen Proteinen aufweisen. Das neue Zielprotein kann durch Untersuchung des veränderten Bandes im SDS-PAGE-Gel durch flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) nachgewiesen werden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für die Identifizierung von bisher unbekannten Zielen von Naturprodukten und Medikamenten^{14,15,16,17,18} , ¹⁹. Es ist auch leistungsfähig als Mittel, um die Bindung von Verbindungen an ein bestimmtes Protein zu überprüfen oder zu validieren^20,21. In dieser Studie stellen wir eine Verbesserung des Experiments dar, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität mit kleinen Molekülen überwachen und Protein-Ligand-Bindungsaffinitäten identifizieren. Wir verwenden mTOR- rapamycin Interaktion als Beispiel, um unseren Ansatz zu demonstrieren.

Protokoll

1. Sammeln und Lyse-Zellen

1. Wachsen Sie 293T-Zellen mit Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum, 2 mM Glutamin und 1% Antibiotika. Inkubationskulturen bei 37 °Cunter 5% CO2 .
   HINWEIS: Der Wachstumszustand der Zellen kann die Stabilität nachfolgender Experimente beeinflussen.
2. Erweitern Sie Zellen in der Kultur bis zum Erreichen des Zusammenflusses von 80 bis 201290%.
3. Mischen Sie 345 l Zelllysereagenz (siehe Materialtabelle) mit 25 l 20x Protease-Inhibitor-Cocktail, 25 l 1 M Natriumfluorid, 50 l mit 100 mM-Glyzerophosphat, 50 l 50 ml Natriumpyrophosphat und 5 l 200 mM Natriumorthovanadate. Den Lysepuffer gekühlt auf Eis halten.
   HINWEIS: Andere Lysepuffer mit verschiedenen Reinigungsmitteln (z. B. Triton X-100 oder NP-40) können mit DARTS verwendet werden, solange sie nicht denaturing sind. Membranproteine oder Kernproteine können extrahiert werden, indem 0,4% Triton X-100 oder 0,4% NP-40 in das Zelllysat hinzugefügt werden.
4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kalter Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
5. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen in einer geeigneten Menge Zelllysepuffer zu sammeln und die Lysing-Zellen in ein 1,5 ml-Rohr zu übertragen.
   HINWEIS: Die Anzahl der Zellen, die für jedes DARTS-Experiment benötigt werden, hängt davon ab, wie viel Protein aus verschiedenen Zelllinien extrahiert werden kann. Im Allgemeinen liegt die Proteinkonzentration des verwendeten Lysats zwischen 4 und 20126 g/l. Eine 10-cm-Platte mit 293T-Zellen bei 85-u201290%-Konfluenz, lysiert mit 300 l Lysepuffer, führt typischerweise zu einem Lysat mit einer Proteinkonzentration von 5 g/l.
6. Mischen Sie die Lysepuffer/Lysing-Zellen gut und inkubieren Sie die Röhre auf Eis für 10 min.
7. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 18.000 g für 10 min bei 4 °C.
8. Den Überstand in ein neues 1,5 ml Rohr geben und auf Eis gekühlt halten.
9. Führen Sie einen BCA-Test durch, um die Proteinkonzentration von Lysaten anzunähern.

2. Inkubieren Sie Proteinlysate mit dem kleinen Molekül

1. Die Lysate mit 99 °L in zwei 1,5 ml-Rohre aufteilen.
2. Machen Sie eine Anfangsstoffkonzentration von 10 mM kleinen Molekül. Bei der Durchführung von DARTS kann man mit einer höheren Konzentration des kleinen Moleküls (5-u201210x des EC50-Wertes) beginnen, um eine optimale Bindung zu gewährleisten.
   1. Fügen Sie entweder 1 l Lösungsmittel hinzu, dass das kleine Molekül in kleinen Molekül-Stammlösungen löslich ist, oder 1 l kleiner Molekül-Stammlösungen zu jedem Aliquot von Lysat. Zelle mit den Lösungen für 30-u201260 min bei Raumtemperatur mit Schütteln bebrüten.
3. Auf Eis serielle Verdünnungen (1:200, 1:400, 1:800 und 1:1600) frisch aufgetauter Pronaselösung in 1x TNC (für 1 ml 10x TNC-Puffer, Mischen Sie 300 l Reinstwasser mit 100 l 5 M Natriumchlorid, 100 l und 500 l von 1 M Tris-HCl, pH 8,0).
4. Untersuchen Sie eine breite Breite der Pronase:Protein-Verhältnisse (z. B. von 1:100 bis 1:2000), um die beobachtungsweise Wirkung der Pronase auf die Ziel(en) zu gewährleisten.
   ANMERKUNG: Zur Berechnung der Pronase-Konzentrationen (Beispiel): 5 -g/l-Proteinkonzentration x 20-L-Probe = 100 g Protein. Für ein Pronase:Protein-Verhältnis von 1:100 benötigen wir eine Pronase-Lösung von 0,5 g/l (100 g bei 100 x 2 ,L). Dieses Experiment muss möglicherweise mehrmals wiederholt werden, um einen geeigneten Bereich von Pronase:Protein-Verhältnissen zu erhalten.

3. Proteolyse durchführen

ANMERKUNG: Bei der Proteolyse werden die Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben

1. Teilen Sie nach der Inkubation mit dem kleinen Molekül jedes Aliquot in 20 L-Proben auf.
2. Fügen Sie in jeder Probe in bestimmten Intervallen (alle 30 s) 2 L des Spektrums der Pronase-Lösungen hinzu. Verwenden Sie ein gleiches Volumen von 1x TNC-Puffer, um eine unverdaute Kontrollprobe einzurichten.
3. Nach 5-u201220 min die Verdauung durch Zugabe von 2 l kalten 20x Protease-Hemmer-Cocktail alle 30 s stoppen. Gut mischen und 10 min auf Eis brüten.
4. Proben mit dem entsprechenden Volumen von 5x SDS-PAGE Ladepuffer verdünnen und bei 95 °C 5 min kochen.
5. Führen Sie den nächsten Teil des Experiments durch oder lagern Sie die Proteinprobe bei 80 °C.

4. Quantifizierung und Analyse

1. Führen Sie nach DARTS Coomassie blaue Färbung nach dem zuvor veröffentlichten Protokoll²²durch.
2. Die gefärbten Proteinbänder sollten nach dem Entsalzen sehr klar sein. Gießen Sie die verwendete Destain-Lösung ab und fügen Sie frische 1% Essigsäurelösung hinzu, um das Gel zu bedecken. Setzen Sie das Gel unter das Licht, um die Bänder mit signifikanten Unterschieden zwischen Gruppen mit (Probengruppe) oder ohne (Kontrollgruppe) das kleine Molekül zu beobachten.
3. Schneiden Sie die beiden entsprechenden Bänder aus dem Gel mit einem sterilen Instrument und führen Sie LC-MS/MS sofort auf.
   HINWEIS: LC-MS/MS muss so schnell wie möglich durchgeführt werden, da die Proteine im Gel kontinuierlich abgebaut werden.
4. Verdauen Sie die Bänder, extrahieren Sie Peptide und führen Sie die LC-MS/MS-Analyse²³durch.
   1. Um LC-MS/MS-Daten zu analysieren, identifizieren Sie zunächst alle Proteine im einzelnen Band. Zweitens verwenden Sie Peptidspektrum-Match (PSM), um die Fülle jedes Proteins darzustellen.
      HINWEIS: PSM liefert die Gesamtzahl der identifizierten Peptidsequenzen für das Protein, einschließlich der redundant identifizierten. Im Allgemeinen kann die Art und Weise, wie oft ein Peptid identifiziert/sequenziert wird, als grobe Schätzung der Fülle des Proteins in der Probe verwendet werden. Proteine, die in der Probengruppe über die Kontrollgruppe angereichert sind, sind Proteine von Interesse.
5. Beschaffen Sie die primären Antikörper der ausgewählten Proteine. Führen Sie einen westlichen Blot durch, um zu überprüfen, ob das kleine Molekül direkt an die potenziellen Zielproteine binden kann²⁴.
   1. Laden Sie gleiche Mengen an Protein in die Brunnen eines 8% SDS-PAGE Gels, zusammen mit einem geeigneten Molekulargewichtsmarker. Führen Sie das Gel 30 min bei 80 V aus, stellen Sie dann die Spannung auf 120 V ein und fahren Sie weiter für 1-u20122 h.
6. Quantifizieren Sie die verschiedenen Zielproteinbänder mit Bildverarbeitungs- und Analysesoftware (siehe Materialtabelle).
7. Analysieren Sie die Daten und zeichnen Sie die Kurven.
   1. Bestimmung der proteolytischen Kurve für ein Zielprotein
      1. Das Pronase:Protein-Verhältnis wird bei der Proteolyse variiert. Normalisieren Sie Daten aus der Bildanalyse, indem Sie die Bandintensitätswerte, die den unverdauten Bändern entsprechen, 100 % zuordnen.
      2. Verwenden Sie die nichtlineare Regressionsanalyse der statistik- und zeichnungssoftware, um eine Kurve normalisierter Daten für relative Bandintensität und Pronase:Protein-Verhältnisse darzustellen.
      3. Öffnen Sie zunächst die Software, wählen Sie den Tabellentyp und das Diagramm als XY aus und lassen Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten zu. Geben Sie dann die entsprechenden Daten in den Bereich unter x und y ein. Geben Sie unter x die Zahlen 0, 1, 2, 3, 4, 5 ein (als Platzhalter entsprechende Pronase:Protein-Verhältnisse).
      4. Geben Sie in der y-Spalte die normalisierten Daten für relative Bandintensitäten ein. Führen Sie "Nichtlineare Regression" durch und implementieren Sie eine "Dosis-Response-Stimulation" mit der Gleichung "Log (Agonist) versus Response —Variable Neigung (vier Parameter)".
      5. Konvertieren Sie die Anmerkungen der X-Achse in der Kurve in die entsprechenden Pronase:Protein-Verhältnisse.
   2. Bestimmung der Dosis-Abhängigkeits-Kurve für ein Zielprotein
      HINWEIS: Für die Dosis-Abhängigkeits-Analyse ist die Molarität des kleinen Moleküls in den Proben unterschiedlich. Das stabile Pronase:Protein-Verhältnis sollte durch DieAnalyse von Proteolysedaten informiert werden. Das Pronase:Protein-Verhältnis, das den maximalen Unterschied in der Zielproteinintensität während der proteolytischen Kurve zeigte, sollte für das Dosisabhängigkeitsexperiment verwendet werden.
      1. Quantifizieren Sie die verschiedenen Zielproteinbänder mit einer Bildanalysesoftware. Wie bei der Generierung der Dosis-Abhängigkeits-Kurve normalisieren Sie Daten aus der Bildanalyse, indem Sie die Bandintensitätswerte, die dem am wenigsten verdauten Band entsprechen, 100 % zuordnen.
      2. Wenden Sie die nichtlineare Regressionsanalyse innerhalb der Statistik- und Zeichnungssoftware auf die normalisierten Daten an. Öffnen Sie zunächst die Software, wählen Sie den Tabellentyp und das Diagramm als XY aus, und geben Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander anseitigen Unterspalten ein.
      3. Geben Sie dann die entsprechenden Daten in den Bereich unter x und y ein. Geben Sie für die Variable "x" unterschiedliche Konzentrationen des kleinen Moleküls ein; 'y' enthält die entsprechenden normalisierten Daten für die relative Bandintensität.
      4. Transformieren Sie x-Werte mit X = Log(X). Verwenden Sie schließlich die nichtlineare Regression, und implementieren Sie eine Dosis-Wirkungs-Stimulation mit der Gleichung "Log (Agonist) versus Response –Variable Neigung (vier Parameter)".

Ergebnisse

Das Flussdiagramm des Experiments ist in Abbildung 1dargestellt. Das Ergebnis der Blauen Färbung von Coomassie ist in Abbildung 2dargestellt. Die Inkubation mit dem kleinen Molekül bietet Schutz gegen Proteolyse. Es werden drei Bänder gefunden, die durch Inkubation mit Rapamycin über fahrzeugkontrolle geschützt zu sein scheinen. Die erwarteten Ergebnisse aus dem proteolytischen Kurvenexperiment sind in Abbildung 3dargestellt. A...

Diskussion

DARTS ermöglicht die Identifizierung kleiner Molekülziele, indem die schützende Wirkung der Proteinbindung gegen Abbau genutzt wird. DARTS erfordert keine chemische Modifikation oder Immobilisierung des kleinen Moleküls²⁶. Dadurch können kleine Moleküle verwendet werden, um ihre direkten Bindungsproteinziele zu bestimmen. Zu den Standardbewertungskriterien für die klassische DARTS-Methode gehören Gelfärbung, Massenspektrometrie und Western Blotting^12,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100X Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line	ATCC	CRL-3216	DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Cell scraper	Thermo Fisher	179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution	Bio-Rad	1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 6.0	statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.52	image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent	Thermo Fisher	78501
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	R21-040-CV
Pronase	Roche	PRON-RO	10 mg/ml
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	S7920
Sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	450243
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	221368
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422