Um ensaio de estabilidade de alvo responsivo de afinidade de drogas semiquantitativa (DARTS) para o estudo da interação Rapamycin/mTOR

Resumo

Neste estudo, aprimoramos as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade protéica e Estimando a afinidade das interações proteína-ligand. As interações podem ser plotadas em duas curvas: uma curva proteolítica e uma curva de dependência de dose. Nós usamos a interação de mTOR-Rapamycin como um caso exemplar.

Resumo

A estabilidade do alvo responsivo da afinidade da droga (dardos) é um método robusto para a deteção de alvos pequenos novos da proteína da molécula. Pode ser usado para verificar interações pequenas conhecidas da molécula-proteína e encontrar alvos potenciais da proteína para produtos naturais. Comparado com outros métodos, DARTS usa moléculas nativas, não modificadas, pequenas e é simples e fácil de operar. Neste estudo, aprimoramos ainda mais as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade protéica e Estimando a afinidade das interações proteína-ligand. As interações proteína-ligantes podem ser plotadas em duas curvas: uma curva proteolítica e uma curva de dependência de dose. Nós usamos a interação de mTOR-Rapamycin como um exemplo exemplar para o estabelecimento de nosso protocolo. A partir da curva proteolítica, vimos que a proteólise do mTOR por soros foi inibida pela presença de rapamicina. A curva dose-dependência nos permitiu estimar a afinidade de ligação da rapamicina e do mTOR. Este método é susceptível de ser um método poderoso e simples para identificar com precisão novas proteínas-alvo e para a otimização do engajamento alvo de drogas.

Introdução

Identificar proteínas-alvo de pequenas moléculas é essencial para a compreensão mecanicista e o desenvolvimento de potenciais fármacos terapêuticos^1,2,3. A cromatografia de afinidade, como método clássico para identificar as proteínas-alvo de pequenas moléculas, produziu bons resultados^4,5. No entanto, este método tem limitações, em que a modificação química de pequenas moléculas geralmente resulta em especificidade ou afinidade de ligação reduzida ou alterada. Para superar essas limitações, várias novas estratégias foram recentemente desenvolvidas e aplicadas para identificar os alvos de pequenas moléculas sem a modificação química das pequenas molécula. Estes métodos diretos para a identificação do alvo de moléculas pequenas Label-Free incluem a estabilidade de alvo responsiva da afinidade da droga (dardos)⁶, estabilidade das proteínas das taxas de oxidação (SPROX)⁷, ensaio térmico celular do deslocamento (cetsa)^{8 ,9}, e perfil térmico do proteoma (TPP)¹⁰. Estes métodos são altamente vantajosos porque usam moléculas pequenas naturais, não modificadas e confiam somente em interações diretas da ligação para encontrar proteínas do alvo¹¹.

Entre esses novos métodos, dardos é uma metodologia comparativamente simples que pode ser facilmente adotada pela maioria dos laboratórios^12,13. O DARTS depende do conceito de que as proteínas ligadas ao ligand demonstram suscetibilidade modificada à degradação enzimática em relação às proteínas não acopladas. A nova proteína alvo pode ser detectada pelo exame da faixa alterada em gel de SDS-PAGE através de cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS/MS). Esta abordagem tem sido implementada com sucesso para identificação de alvos previamente desconhecidos de produtos naturais e drogas^{14,15,16,17,18, 19}. também é poderoso como um meio de tela ou validar a ligação de compostos a uma proteína específica^20,21. Neste estudo, apresentamos uma melhoria no experimento, monitorando as mudanças na estabilidade protéica com pequenas moléculas e identificando afinidades vinculativas de proteínas ligantes. Utilizamos a interação mTOR-rapamicina como exemplo para demonstrar nossa abordagem.

Protocolo

1. coletar e lyse células

1. Cresça as células 293T usando o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina e 1% de antibióticos. Incubar culturas a 37 ° c 5% CO₂.
   Nota: o estado de crescimento das células pode afectar a estabilidade dos experimentos subsequentes.
2. Expandir células na cultura até atingir 80 \ u201290% confluência.
3. Misturar 345 μL de reagente de lise celular (ver a tabela de materiais) com 25 μL de cocktail inibidor da protease 20x, 25 μL de fluoreto de sódio a 1 M, 50 μl de 100 mm β-glicerofosfato, 50 μL de pirofosfato de sódio a 50 mm e 5 μL de ortovanadato de sódio a 200 mm. Mantenha o tampão de Lise refrigerado no gelo.
   Nota: outros tampões do lysis com vários detergentes (por exemplo, Triton X-100 ou NP-40) podem ser usados com os dardos contanto que forem não-desnaturando. As proteínas da membrana ou as proteínas nucleares podem ser extraídas adicionando 0,4% Triton X-100 ou 0,4% NP-40 ao lysate da pilha.
4. Lave as células duas vezes com soro fisiológico com tampão de fosfato frio (PBS).
5. Use um raspador de células para coletar as células em uma quantidade apropriada de tampão de lise celular e transferir as células lisando em um tubo de 1,5 mL.
   Nota: o número de células necessárias para cada experimento de dardos variará com base na quantidade de proteína que pode ser extraída de várias linhas celulares. Em geral, a concentração proteica do lisado utilizado é entre 4 \ u20126 μg/μL. A placa de 1 10 cm de 293T Cells em 85 \ u201290% confluency, lysed com 300 μl do tampão do lysis conduz tipicamente a um lisado com uma concentração da proteína de ~ 5 μg/μl.
6. Misture bem o tampão de Lise/células lisando e incubar o tubo no gelo por 10 min.
7. Centrifugue o tubo a 18.000 × g durante 10 min a 4 ° c.
8. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e mantenha-o refrigerado no gelo.
9. Realize um ensaio de BCA para aproximar a concentração proteica de lisados.

2. Incubar proteínas lisados com a pequena molécula

1. Dividir 99 μL de lisados em dois tubos de 1,5 mL.
2. Faça uma concentração de estoque inicial de 10 mM de molécula pequena. Ao executar dardos, um pode começar com uma concentração mais elevada da molécula pequena (5 \ u201210x o valor de a) para assegurar a ligação óptima.
   1. Adicione 1 μL de solvente que a pequena molécula é solúvel em ou 1 μL de pequenas moléculas de soluções de ações para cada alíquota de lisado. Incubar o lisado da pilha com as soluções para 30 \ u201260 min na temperatura ambiente com agitação.
3. No gelo, estabeleça diluições seriadas (1:200, 1:400, 1:800 e 1:1600) de solução de soros recém-descongelada em 1x TNC (para 1 ml de tampão TNC 10x, misture 300 μL de água ultrapura com 100 μl de cloreto de sódio a 5 m, 100 μl de cloreto de cálcio de 1 m e 500 μL de 1 M de Tris-HCl, pH 8,0).
4. Examine uma ampla amplitude de proporções de soros: proteína (por exemplo, abrangendo de 1:100 a 1:2000) para garantir a observabilidade do efeito passo-sábio da Soros no alvo (s).
   Nota: para calcular as concentrações de soros (exemplo): 5 μg/μL de concentração proteica x 20 μL de amostra = 100 μg de proteína. Para uma soros: relação proteína de 1:100 precisamos de 0,5 μg/μl (100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL) soros solução. Este experimento pode ter que ser repetido várias vezes para obter uma faixa adequada de proporções de Pronase: proteína.

3. Realize a proteólise

Nota: para proteólise, as etapas são realizadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário

1. Após a incubação com a pequena molécula, divida cada alíquota em 20 amostras de μL.
2. Adicionar 2 μl da gama de soluções soros em cada amostra em intervalos específicos (a cada 30 s). Use um volume igual de 1x buffer TNC para estabelecer uma amostra de controle não digerido.
3. Após 5 \ u201220 min, interromper a digestão através da adição de 2 μL de coquetel de inibidor de protease 20x frio a cada 30 s. Misture bem e incubar no gelo por 10 min.
4. Diluir amostras com o volume adequado de 5x SDS-PAGE buffer de carga e ferver a 95 ° c por 5 min.
5. Realize a próxima porção do experimento ou armazene a amostra de proteína a − 80 ° c.

4. quantificação e análise

1. Após dardos, realize a coloração do azul de Coomassie de acordo com o protocolo previamente publicado²².
2. As bandas de proteínas manchadas devem ser muito claras após destaining. Derrame fora a solução usada do senhor e adicione a solução fresca do ácido acético de 1% para cobrir o gel. Coloque o gel a luz para observar as bandas com diferenças significativas entre os grupos com (grupo de amostra) ou sem (grupo controle) a pequena molécula.
3. Cortar as duas bandas correspondentes do gel com um instrumento estéril e executar LC-MS/MS imediatamente.
   Nota: LC-MS/MS precisa de ser feito o mais cedo possível porque as proteínas no gel degradarão continuamente.
4. Digerir as bandas, extrair peptídeos e realizar a análise LC-MS/MS²³.
   1. Para analisar os dados de LC-MS/MS, primeiro identifique todas as proteínas na banda individual. Em segundo lugar, use o fósforo do espectro do peptide (PSM) para representar a abundância de cada proteína.
      Nota: PSM fornece o número total de seqüências de peptídeos identificados para a proteína, incluindo aqueles redundante identificado. Em geral, a frequência com que um peptídeo é identificado/seqüenciado pode ser usado como uma estimativa aproximada de quão abundante é a proteína na amostra. As proteínas enriquecidas no grupo amostral sobre o grupo controle são proteínas de interesse.
5. Procure os anticorpos primários das proteínas seleccionadas. Realize Western blot para verificar se a pequena molécula pode se ligar diretamente às proteínas alvo potenciais²⁴.
   1. Carregue quantidades iguais de proteína nos poços de um gel de SDS-PAGE de 8%, juntamente com um marcador de peso molecular adequado. Executar o gel para 30 min em 80 V, em seguida, ajustar a tensão para 120 V e continuar a correr para 1 \ u20122 h.
6. Quantifique as diferentes bandas de proteínas alvo usando o software de processamento e análise de imagens (consulte a tabela de materiais).
7. Analise os dados e desenhe as curvas.
   1. Determinação da curva proteolítica para uma proteína alvo
      1. A relação Pronase: proteína é variada ao realizar a proteólise. Normalize dados da análise de imagem atribuindo os valores de intensidade de banda correspondentes às bandas não digeridas a 100%.
      2. Use a análise de regressão não linear da análise estatística e do software de desenho para traçar uma curva de dados normalizados para a intensidade da banda relativa e as proporções de Pronase: proteína.
      3. Primeiro, abra o software, selecione o tipo de tabela e gráfico como XY e permita 3 valores de replicação em Subcolunas lado a lado. Em seguida, insira os dados correspondentes no espaço abaixo de x e y. x, introduza os números 0, 1, 2, 3, 4, 5 (como os suportes de lugar correspondentes Pronase: relações da proteína).
      4. Na coluna y, insira os dados normalizados para intensidades de banda relativas. Execute "regressão não linear" e implemente uma "dose-resposta-estimulação" usando a equação "log (agonista) versus resposta — inclinação variável (quatro parâmetros)".
      5. Converta as anotações do eixo X na curva para as proporções de Pronase: protein correspondentes.
   2. Determinação da curva dose-dependência para uma proteína alvo
      Nota: para a análise da dose-dependência, a molaridade da molécula pequena é diferido através das amostras. A relação de Pronase: proteína estável deve ser informada pela análise de dados de proteólise. A relação Pronase: proteína que apresentou diferença máxima na intensidade da proteína alvo durante a curva proteolítica deve ser utilizada para o experimento de dependência de dose.
      1. Quantifique as diferentes bandas de proteínas alvo usando um software de análise de imagem. Como na geração da curva da dose-dependência, normalizar dados da análise da imagem atribuindo os valores da intensidade da faixa que correspondem à faixa menos digerida a 100%.
      2. Aplique a análise de regressão não linear dentro da análise estatística e do software de desenho aos dados normalizados. Primeiro, abra o software, selecione o tipo de tabela e gráfico como XY e insira 3 valores de replicação em Subcolunas lado a lado.
      3. Em seguida, insira os dados correspondentes no espaço abaixo de x e y. Para a variável ' x ', insira diferentes concentrações da pequena molécula; ' y ' inclui os dados normalizados correspondentes para a intensidade da banda relativa.
      4. Transforme valores x usando X = log (X). Finalmente, empregar a regressão não-linear, e implementar uma estimulação dose-resposta usando o "log (agonista) versus resposta — inclinação variável (quatro parâmetros)" equação.

Resultados

O fluxograma do experimento é delineado na Figura 1. O resultado da coloração azul de Coomassie é mostrado na Figura 2. A incubação com a pequena molécula confere proteção contra proteólise. Três bandas que parecem ser protegidas por incubação com rapamicina sobre o controle do veículo são encontradas. Os resultados esperados do experimento de curva proteolítica são mostrados na Figura 3. Como prova de princípio, e...

Discussão

O DARTS permite a identificação de alvos pequenos da molécula explorando o efeito protetor da ligação da proteína de encontro à degradação. DARDOS não requer qualquer modificação química ou imobilização da pequena molécula²⁶. Isto permite que as moléculas pequenas sejam usadas para determinar seus alvos de ligação direta da proteína. Os critérios de avaliação padrão para o método clássico dos dardos incluem a mancha do gel, a espectrometria maciça e o western blotting

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100X Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell line	ATCC	CRL-3216	DMEM medium with 10% FBS
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23225
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Cell scraper	Thermo Fisher	179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution	Bio-Rad	1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 6.0	statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1.52	image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis Reagent	Thermo Fisher	78501
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	R21-040-CV
Pronase	Roche	PRON-RO	10 mg/ml
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	S7920
Sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	450243
Sodium pyrophosphate	Sigma-Aldrich	221368
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	adjust to pH 8.0
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422