АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании мы расширили возможности анализа данных эксперимента DARTS, отслеживая изменения в стабильности белка и оценивая сродство белково-лигандовых взаимодействий. Взаимодействия могут быть построены на две кривые: протеолитическая кривая и кривая доза-зависимости. Мы использовали mTOR-rapamycin взаимодействия в качестве образцового случая.

Аннотация

Препарат Affinity Responsive Target Stability (DARTS) является надежным методом обнаружения новых малых целей белка молекулы. Он может быть использован для проверки известных небольших молекулно-белковых взаимодействий и для поиска потенциальных целей белка для натуральных продуктов. По сравнению с другими методами, DARTS использует родные, неизмененные, маленькие молекулы и прост и прост в эксплуатации. В этом исследовании мы еще больше расширили возможности анализа данных эксперимента DARTS, отслеживая изменения в стабильности белка и оценивая сродство белково-лигандовых взаимодействий. Взаимодействия белково-лигандов могут быть построены на две кривые: протеолитическая кривая и кривая доза-зависимости. Мы использовали взаимодействие mTOR-rapamycin в качестве образцового аргумента для создания нашего протокола. Из протеолитической кривой мы увидели, что протеолиз mTOR pronase тормозится наличием рапамицина. Кривая доза-зависимость позволила оценить связывающее сродство рапамицина и mTOR. Этот метод, вероятно, будет мощным и простым методом для точного определения новых целевых белков и для оптимизации целевого взаимодействия с наркотиками.

Введение

Выявление малых молекул целевых белков имеет важное значение длямеханистического понимания и развития потенциальных терапевтических препаратов 1,2,3. Хроматография сродства, как классический метод определения целевых белков малых молекул, дала хорошие результаты4,5. Однако, этот метод имеет ограничения, в том, что химическая модификация малых молекул часто приводит к снижению или измененной связывания специфичности или сродства. Для преодоления этих ограничений недавно было разработано и применено несколько новых стратегий для выявления малых молекулных целей без химической модификации малых молекул. Эти прямые методы для целевой идентификации этикетки свободных малых молекул включают препарат сродство реагировать целевой стабильности (DARTS)6, стабильность белков от ставок окисления (SPROX)7, клеточный тепловой анализ (CETSA)8 ,9, и теплового протеома профилирования (TPP)10. Эти методы являются весьма выгодными, поскольку они используют природные, неизмененные небольшие молекулы и полагаться только на прямые связывающие взаимодействия, чтобы найти целевые белки11.

Среди этих новых методов, DARTS является сравнительно простой методологии, которая может быть легко принята в большинстве лабораторий12,13. DARTS зависит от концепции, что лиганд-связанных белков продемонстрировать модифицированную восприимчивость к ферментативной деградации по отношению к несвязанных белков. Новый целевой белок может быть обнаружен путем изучения измененной полосы в геле SDS-PAGE с помощью жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS/MS). Этот подход был успешно реализован для выявления ранее неизвестных целей натуральных продуктов и лекарств14,15,16,17,18, 19. Он также является мощным в качестве средства для проверки или проверки связывания соединений с конкретным белком20,21. В этом исследовании мы представляем улучшение эксперимента путем мониторинга изменений в стабильности белка с небольшими молекулами и выявления белка-лиганд связывания сходства. Мы используем mTOR-rapamycin взаимодействия в качестве примера, чтобы продемонстрировать наш подход.

протокол

1. Собирать и лиза клетки

  1. Выращивайте 293T-клетки с помощью модифицированной среды «Орел» (DMEM) с 10% сывороткой крупного рогатого скота, глутамином 2 мМ и 1% антибиотиками. Инкубировать культуры при 37 градусах Цельсия под 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние роста клеток может повлиять на стабильность последующих экспериментов.
  2. Расширяйте клетки в культуре до достижения 80-u201290% слияния.
  3. Смешайте 345 л реагента лизации клеток (см. Таблицу Материалов)с 25 qL 20-x кислогоингового коктейля, 25 л 1 М фтора натрия, 50 мЛ 100 мм и глицерофосфат, 50 мл 50 мм пирофосфата натрия и 5 мл. Держите буфер лисиса охлажденным на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие буферы лиза с различными моющими средствами (например, Triton X-100 или NP-40) могут быть использованы с DARTS до тех пор, пока они не денатурируют. Мембранные белки или ядерные белки могут быть извлечены путем добавления 0,4% Triton X-100 или 0,4% NP-40 в клеточный лизат.
  4. Вымойте клетки дважды с холодной фосфат-буферной сосуд (PBS).
  5. Используйте клеточный скребок для сбора клеток в соответствующем количестве буфера лиза клетки и переноса лизинирующих клеток в трубку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток, необходимых для каждого эксперимента DARTS будет варьироваться в зависимости от того, сколько белка может быть извлечено из различных клеточных линий. В целом, концентрация белка в используемом лисате находится между 4 х u20126 мкг/Л. Одна 10-сантиметровая пластина из 293T-клеток при флюенции 85 кв201290%, лисизированная с 300 злис-буфером лиза, как правило, приводит к концентрации белка с концентрацией белка в 5 мкг/л.
  6. Смешайте лисис буфер / лизинируя клетки хорошо и инкубировать трубку на льду в течение 10 минут.
  7. Центрифуга трубки на 18000 г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  8. Перенесите супернатант в новую трубку 1,5 мл и держите охлажденным на льду.
  9. Выполните анализ BCA, чтобы приблизить концентрацию белка в лисатах.

2. Инкубировать лисатпрома с малой молекулой

  1. Разделите 99 л лисатов на две трубки длиной 1,5 мл.
  2. Сделать стартовую концентрацию запасов 10 мМ небольшой молекулы. При выполнении DARTS, можно начать с более высокой концентрации небольшой молекулы (5'u201210x ec50 значение), чтобы обеспечить оптимальное связывание.
    1. Добавьте либо 1 зл растворителя, что небольшая молекула растворима в или 1 л малых растворов запасов молекулы для каждого aliquot из lysate. Инкубировать клеточный лисат с растворами в течение 30 х u201260 мин при комнатной температуре с встряхиванием.
  3. На льду установите серийные разбавления (1:200, 1:400, 1:800 и 1:1600) свежеразмороженного раствора проназе в 1x ТНК (за 1 мл 10-х буфера ТНК, смешайте 300 л сверхчистой воды с 100 мл хлорида 5 М натрия, 100 мл. , и 500 л из 1 M Tris-HCl, рН 8.0).
  4. Изучите широкоширное соотношение проназе: белков (например, охватывающие от 1:100 до 1:2000), чтобы гарантировать наблюдаемость пошагового эффекта проназе на цель (ы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета концентрации проназе (пример): 5 мкг/Л концентрации белка х 20 л образца 100 мкг белка. Для проназе: коэффициент белка 1:100 нам нужно 0,5 мкг/л (100 мкг, 100 й2 йл) pronase раствор. Этот эксперимент, возможно, придется повторить несколько раз, чтобы получить подходящий диапазон pronase: белковые соотношения.

3. Выполните протеолиза

ПРИМЕЧАНИЕ: Для протеолиза, шаги выполняются при комнатной температуре, если иное не отмечено

  1. После инкубации с небольшой молекулой, разделить каждый aliquot на 20 образцов Л.
  2. Добавьте 2 злицы диапазона проназе решений в каждом образце через определенные промежутки времени (каждые 30 с). Используйте равный объем буфера TNC 1x для создания непереваренных контрольных образцов.
  3. После 5'u201220 мин, остановить пищеварение путем добавления 2 л холодного 20x протеазы ингибитор коктейль каждые 30 с. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 10 минут.
  4. Разбавить образцы с соответствующим объемом 5x SDS-PAGE погрузки буфера и кипятить при 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
  5. Проведите следующую часть эксперимента или храните образец белка при 80 градусах Цельсия.

4. Количественная оценка и анализ

  1. После DARTS, выполнить Coomassie синий окрашивание в соответствии с ранее опубликованным протоколом22.
  2. Окрашенные белковые полосы должны быть очень четкими после дестиназания. Налейте использованный раствор дестана и добавьте свежий 1% уксусной кислоты раствор для покрытия геля. Положите гель под свет для того чтобы наблюдать полосы с значительно разницами между группами с (группой образца) или без (группы управления) малая молекула.
  3. Вырежьте две соответствующие полосы из геля с помощью стерильного инструмента и немедленно выполните LC-MS/MS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: LC-MS/MS необходимо сделать как можно скорее, потому что белки в геле будут постоянно ухудшаться.
  4. Дайджест полос, экстракт пептидов и выполнять АНАЛИЗ LC-MS/MS23.
    1. Для анализа данных LC-MS/MS сначала определите все белки в отдельной полосе. Во-вторых, используйте пептидный спектр матча (PSM) для представления обилия каждого белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PSM обеспечивает общее количество идентифицированных пептидных последовательностей для белка, в том числе выявляемых. В целом, как часто пептид идентифицируется / секвенированный может быть использован в качестве приблизительной оценки того, насколько обильный белок в образце. Белки, обогащенные в группе образцов над контрольной группой, представляют интересуемые белки.
  5. Закупай первичные антитела выбранных белков. Выполните западное пятно, чтобы убедиться, что небольшая молекула может связываться непосредственно с потенциальными белками цели24.
    1. Загрузите одинаковое количество белка в скважины 8% гель SDS-PAGE, а также соответствующий молекулярный маркер веса. Выполнить гель в течение 30 минут при 80 В, затем отрегулировать напряжение до 120 В и продолжить работать на 1'u20122 ч.
  6. Количественная оценка различных целевых белковых полос с использованием программного обеспечения для обработки изображений и анализа (см. Таблицу Материалов).
  7. Проанализируйте данные и нарисуйте кривые.
    1. Определение протеолитической кривой для целевого белка
      1. Соотношение проназе:белка изменяется при выполнении протеолиза. Нормализация данных анализа изображений путем отнесения значений интенсивности полосы, соответствующих непереваренных диапазонам, до 100%.
      2. Используйте нелинейный регрессионный анализ статистического анализа и составление программного обеспечения для составления кривой нормализованных данных для относительной интенсивности полос и коэффициентов pronase:protein.
      3. Во-первых, откройте программное обеспечение, выберите тип таблицы и графика как XY и допускайте 3 значения репликации в бок о бок подколоннах. Затем введите соответствующие данные в пространстве ниже x и y. В соответствии с x, вввод номера 0, 1, 2, 3, 4, 5 (как держатели мест соответствующих pronase: белковые соотношения).
      4. В столбце y введите нормализованные данные для относительной интенсивности полосы. Выполните "Нелинейную регрессию" и реализуйте уравнение "Доза-ответ-стимуляция" с помощью уравнения "Log (агонист) против ответа-Variable slope (четыре параметра)" уравнение.
      5. Преобразуйте аннотации X-оси в кривой в соответствующие соотношения pronase:protein.
    2. Определение кривой дозы-зависимости для целевого белка
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа дозы-зависимости, моляритость небольшой молекулы отличается между образцами. Стабильный коэффициент pronase:protein должен быть основан на анализе данных протеолиза. Соотношение pronase:protein, которое показало максимальную разницу в интенсивности целевого белка во время протеолитической кривой, должно быть использовано для эксперимента по доза-зависимости.
      1. Количественная оценка различных целевых белковых полос с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Как и в генерации кривой доза-зависимости, нормализуем данные из анализа изображений, приписывая значения интенсивности полосы, соответствующие наименее усваемой полосе, до 100%.
      2. Примените нелинейный регрессионный анализ в рамках статистического анализа и составление программного обеспечения к нормализованным данным. Во-первых, откройте программное обеспечение, выберите тип таблицы и графика как XY и введите 3 значения репликации в бок о бок подколонны.
      3. Затем введите соответствующие данные в пространстве ниже x и y. Для переменной 'x', ввод различных концентраций небольшой молекулы; 'y' включает в себя соответствующие нормализованные данные относительной интенсивности полос.
      4. Преобразование значений x с помощью X и Log (X). Наконец, используйте нелинейную регрессию и реализуем стимуляцию дозы-реакции с помощью уравнения "Log (агонист) против ответа -Variable slope (четыре параметра)" уравнение.

Результаты

Диаграмма потока эксперимента изложена на рисунке 1. Результат синего окрашивания Coomassie показан на рисунке 2. Инкубация с небольшой молекулой обеспечивает защиту от протеолиза. Три полосы, которые, как представляется, защищены инкубации с рапамицином на?...

Обсуждение

DARTS позволяет идентифицировать небольшие молекулы целей, используя защитный эффект связывания белка против деградации. DARTS не требует каких-либо химических модификаций или иммобилизации небольшой молекулы26. Это позволяет использовать небольшие молекулы для определения ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана NIH научно-исследовательских грантов R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, а также ДОР научно-исследовательский грант W81XWH-16-1-0482.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100X Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340Dilute to 20X with ultrapure water
293T cell lineATCCCRL-3216DMEM medium with 10% FBS
Acetic acidSigma-AldrichA6283
BCA Protein Assay KitThermo Fisher23225
Calcium chlorideSigma-AldrichC1016
Cell scraperThermo Fisher179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining SolutionBio-Rad1610436
Dimethyl sulfoxide(DMSO)Sigma-AldrichD2650
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 6.0statistical analysis and drawing software
Hydrochloric acidSigma-AldrichH1758
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.52image processing and analysis software
M-PER Cell Lysis ReagentThermo Fisher78501
Phosphate-buffered saline (PBS)CorningR21-040-CV
PronaseRochePRON-RO10 mg/ml
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653
Sodium fluorideSigma-AldrichS7920
Sodium orthovanadateSigma-Aldrich450243
Sodium pyrophosphateSigma-Aldrich221368
Trizma baseSigma-AldrichT1503adjust to pH 8.0
β-glycerophosphateSigma-AldrichG9422

Ссылки

  1. Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).
  2. O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. Chemical genetics. Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).
  3. McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions. Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).
  4. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).
  5. Sleno, L., Emili, A. Proteomic methods for drug target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).
  6. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  7. Strickland, E. C., et al. Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).
  8. Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
  9. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  10. Savitski, M. M., et al. Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science. 346 (6205), 1255784 (2014).
  11. Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification. Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).
  12. Pai, M. Y., et al. Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification. Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).
  13. Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).
  14. Xu, L., et al. Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility. Nature Communications. 9 (1), 2454 (2018).
  15. Lim, H., et al. A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes. Nature Communications. 9 (1), 1438 (2018).
  16. Schulte, M. L., et al. Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models. Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).
  17. Skrott, Z., et al. Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4. Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).
  18. Zhang, C., et al. Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).
  19. Chin, R. M., et al. The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR. Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).
  20. Robinson, T. J., et al. High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors. Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).
  21. Aghajan, M., et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).
  22. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  23. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  24. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  25. Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).
  26. Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. Identification of direct protein targets of small molecules. ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).
  27. Park, Y. D., et al. Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening. MBio. 7 (4), (2016).
  28. Qu, Y., et al. Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer. Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

150mTOR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены