זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

Summary

מיקרו-מערך מחייב חלבון (pbm) ניסויים בשילוב עם בחני יוכימיים מקשר את תכונות הכריכה והקטליטי של ה-dna primase, אנזים שעושה שילוב של ה-RNA התחל ב-dna תבנית. שיטה זו, המיועדת כprimase ליצירת פרופיל בתפוקה גבוהה (HTPP), יכולה לשמש לחשיפת דפוסי איגוד DNA של מגוון אנזימים.

Abstract

דנ א primase מגדלים קצרים RNA התחל ליזום סינתזה של דנ א של קטעי וקאזאקי על סטרנד בפיגור על ידי DNA פולימראז במהלך שכפול DNA. הכריכה של הprimases של prokaryotic בדומה ל-DNA מתרחשת ברצף זיהוי טריאוקלאוטית מסוים. זהו צעד מרכזי ביצירת קטעים של וקאזאקי. כלים ביוכימיים קונבנציונליים המשמשים כדי לקבוע את רצף זיהוי ה-DNA של primase DNA לספק רק מידע מוגבל. באמצעות שיטת האיגוד המבוסס על מיקרוarray עם תפוקה גבוהה וניתוחים ביוכימיים עוקבים, הוכח כי 1) ההקשר המחייב הספציפי (רצפי מעבר של אתר הזיהוי) משפיע על חוזק הכריכה של ה-DNA הprimase לתבנית שלו DNA, ו 2) מחייב חזק יותר של primase לתשואות ה-DNA התחל עוד RNA, המציין מעבד גבוה יותר של האנזים. שיטה זו משלבת PBM ו primase הפעילות והוא מיועד כprimase התפוקה גבוהה (HTPP), והוא מאפשר אפיון של זיהוי רצף ספציפי על ידי primase DNA בזמן ומדרגיות חסר תקדים.

Introduction

HTPP עושה שימוש בטכנולוגיה מיקרו מחייב DNA בשילוב עם ניתוח ביוכימיים (איור 1) כדי סטטיסטית לזהות תכונות ספציפיות של תבניות DNA המשפיעות על הפעילות האנזימטית של primase DNA. לכן, HTPP מספק פלטפורמה טכנולוגית המאפשרת קפיצת ידע בתחום. הכלים הקלאסיים המשמשים לקביעת אתרי זיהוי primase אין להם את היכולת להניב כמות מסיבית של נתונים, בעוד HTPP עושה.

Pbm היא טכניקה המשמשת באופן שגרתי כדי לקבוע את ההעדפות קשירה של גורמי תמלול ל-DNA^1,2; עם זאת, הוא אינו מתאים לזיהוי של מחייב חלש/ארעי של חלבונים ל-DNA. בניגוד PBM אוניברסלי המספק מידע על ממוצע כריכת חלבון ספציפיות לכל הרצפים האפשריים המורכב של שמונה זוגות בסיס, HTPP מבוסס על הספריה של יחיד תקועים תבניות DNA הכוללת אלמנטים רצף ייחודי. אלה אלמנטים רצף DNA כרוך עשרות אלפים קצרים (עשרות מעטים של bp) רצפים גנומית, כמו גם רצפי DNA מעוצב מעוצבים מועשר ב-DNA מסוימים רצף החוזר רכיבים הנמצאים בגנום, אשר בעלי תוכן GC ממוצע שונים . גישה בעלת תפוקה גבוהה כזו מאפשרת נחישות, באופן שיטתי, כמותי ומונחה השערות, המאפיינים הקשורים ברצף החשובים לאיגוד הprimase ופעילותה האנזימטית³. בפרט, את הקשר החשוב בין primase-DNA העדפות איגוד, (מאופנן על ידי רצפי DNA האגפים מסוימים שלושה נוקלאוטיד אתרים מחייב) ו primase מעבד זוהה עבור מערכת זו אנזימטית⁴.

הטכנולוגיה החדשה הוחל לחזור על ההבנה שלנו של אתרי זיהוי primase אפילו עבור ה-DNA T7 primase כי כבר למד בהרחבה⁵. במיוחד, בחינת מחדש של מושגים קלאסיים, כגון אתרי זיהוי דנ א של T7 DNA primase (אשר נקבעו כמעט ארבעה עשורים לפני ⁶) באמצעות חלבון-dna המחייב מיקרוarray (pbm) הוביל תובנה חסרת תקדים לתוך תכונות הקשורות את הרצף האגף של אתרי ההוקרה האלה³. זה היה צפוי הרצפים החוצה אתר הכרה tri-נוקלאוטיד של T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') יהיה אקראי. במקום זאת, מצאנו כי רצפים של TG-עשיר האגפים להגדיל את הסיכויים של T7 DNA primase לסנתז עוד RNA התחל להצביע על עלייה בתהליך.

שיטות אחרות אשר ניתן להשתמש כדי ללמוד את המאפיינים של כריכת ה-DNA של חלבונים בתוך מבחנה כוללים את היכולת לנוע בתנועה אלקטרופלוטית (EMSA)⁷, dnase I footprinting דפסה⁸, משטח-פלמון תהודה (spr)⁹, ומדרום מערב בלוק ¹⁰. אלה הם, עם זאת, שיטות תפוקה נמוכה ישים רק כדי לחקור מספר קטן של רצפי DNA. בנוסף, הדיוק והרגישות של חלק מהשיטות האלה (למשל, EMSA) נמוך. מצד שני, בחירה מחוץ גופית¹¹ היא טכניקה, בדומה pbm, ניתן להשתמש לזיהוי רצפים מחייב רבים. עם זאת, רצפי אהדה נמוכים בדרך כלל אינם נכללים ברוב היישומים של בחירת חוץ גופית; לפיכך, גישה זו אינה מתאימה לקבלת נתונים מחייבים השוואתיים עבור כל הרצפים הזמינים. ה-pbm האוניברסלי^1,2 משמש בעיקר כדי לאפיין את הקשירה של גורמי שעתוק prokaryotes ו eukaryotes, כמו גם גורמים ספציפיים (למשל, נוכחות של ליגטים מסוימים, קופטים, וכו ') שעשויים ישפיע על האינטראקציה הזאת¹².

HTPP מרחיב את היישום PBM לאנזימים עיבוד ה-DNA על ידי שילוב של עוצמה סטטיסטית בתפוקה גבוהה תקדים עם דיוק גבוהה כדי לספק מידע על ההקשר רצף כריכה. נתונים אלה עדיין לא הושגו עבור primases ואנזימים הקשורים (כי יש כריכה חלשה/ארעית ל-DNA) בשל מגבלות טכניות כאמור של טכניקות זמינות אחרות.

Protocol

1. עיצוב מיקרוarray

הערה: בדיקות דנ א מייצגות מותאם אישית 36-נוקלאוטיד רצפים, המורכב של אתר הזיהוי עבור T7 DNA primase (GTC) ממוקם בין שני אזורים משתנה האגפים, ואחריו רצף של 24-נוקלאוטיד קבוע קשור לשקופית זכוכית³. השתמשנו בתבנית מיקרוarray של 4 x 180,000, אשר אפשרה איתור של כל רצף דנ א בשש משכפל, שהופץ באופן אקראי על השקופית.

1. עיצוב ספריית ה-DNA עבור primases עם רצפי הוקרה ידועים
   1. ודא שכל רצף מורכב מ-60 נוקלאוטידים. שמור את הראשון 24 נוקלאוטידים קבוע (להיות מוצמד לשקופית הזכוכית). על אזורים משתנים להיות בעלי הטופס הכללי הבא: (N)₁₆GTC (n)₁₇; כאשר N מייצג את כל הנוקלאוטיד הרצוי.
   2. מעצבים את האזור האגף כדי לטפל בשאלה מדעית ספציפית (דוגמה לעיצוב מוצגת בטקסט הבא). האזורים האגפים עשויים להיות מיועדים להכיל תכונות ספציפיות, כגון רכיבי החזרה או סימטריה ספציפית.
      הערה: יצרנו שמונה קטגוריות של רצפים שונים המורכבים משתיים או שלוש נוקלאוטידים מסוימים: T ו-G (קבוצה 1); T ו-C (קבוצה 2); C ו-A (קבוצה 3); A ו-G (קבוצה 4); G, C ו-T (קבוצה 5); C, T ו-A (קבוצה 6); G, A ו-T (קבוצה 7); G, A ו-C (קבוצה 8). 2,000 רצפים שונים עוצבו עבור כל קבוצה. כל קבוצה היו קבוצות משני של רצפים עם סוגים שונים ומספרים שונים של רצף חוזר.
   3. כלול ערכה של רצפי בקרה שליליים (חסר אתר האיגוד הספציפי)⁴. הנוכחות של רצפים כאלה מאפשרת לאמת את ההתרחשות של איגוד ספציפי בניסוי.
2. עיצוב של ספריית DNA עבור primases עם רצפי הכרה לא ידוע
   1. אם רצף הזיהוי אינו ידוע, צור את ספריית ה-DNA על-ידי בחירת הרצפים (עם או בלי תכונות ספציפיות שהוזכרו קודם לכן) מן הגנום של האורגניזם הרצוי (חיידקים, פטריות, וכו ').
3. עיצוב שקופית מיקרוarray
   1. רכישת שקופיות מותאמות אישית (לדוגמה, 4x180K, AMADID #78366) מספק מסחרי (לפרטים נוספים ראו טבלת חומרים). סדר כל רצף בשישה משכפל, כאשר כל שכפול צריך להיות מוצמד לנקודה שנבחרה באופן אקראי בשקופית.

2. ניסוי מחייב DNA Primase

הערה: ביום שלפני (או לפחות 2 h לפני) PBM, להכין את פתרון חסימת [2% w/v חלב רזה בתמיסת פוספט מאגר (PBS)] ולערבב אותו על מערבב מגנטי. לפני השימוש, סנן את הפתרון באמצעות מסנן μM 0.45. כדי לזהות את הכריכה הprimase לגדילי ה-DNA, יש לבצע מספר צעדים בסדר הבא.

1. חסימת פרוצדורה
   1. מראש השקופית מיקרוarray בצנצנת Coplin עם 0.01% v/v טריטון X-100 ב-PBS (5 דקות ב 125 rpm על מסובבי המעבדה).
   2. לשטוף בקצרה את שקופית gasket (המכונה גם coverslip) עם מים אתנול ויבש באמצעות אוויר דחוס.
   3. להרכיב חלק תחתון של הכלאה פלדה קאמרית (תא PBM) עם שקופית gasket פונה כלפי מעלה (תווית מסחרית פונה למעלה). לפרטים נוספים בנושא ההרכבה, עיין בטבלת החומרים.
   4. Pipet פתרון חסימה (2% w/v חלב רזה ב-PBS) לכל תא.
   5. הסר את שקופית המיקרו-מערך מצנצנת הקופלין, ולאחר מכן ייבש את הצד הלא-DNA (הדנ א אמור להיות באותו צד כמו התווית של החברה) והקצוות באמצעות ניגוב דק. הניחו באיטיות את המיקרו-מערך בשקופית האטם, הימנעות מבועות (תווית החברה פונה כלפי מטה). התאספו מיד ותהדקו. מכשירים קאמריים היברידיזציה דגירה של 1 h בטמפרטורת החדר (RT).
   6. ממלאים מנה אחת מכתים (המנה "PBS") עם 800 mL של PBS טרי. למלא את המנה השנייה מכתים (את "לשטוף" צלחת) עם 800 mL של טרי מוכן 0.5% v/v רצף-20 ב PBS.
   7. להוציא את החדר PBM ולהסיר את שקופיות microarray שקופית "סנדוויץ", מטפל לא לשבור את החותם. לפרק אותו מתחת למים בצלחת לשטוף ידי הצבת מלקחיים בין שקופית לבין coverslip.
   8. טלטל את שקופית המיקרו-מערך מתחת למים והעבר במהירות לצנצנת של קופלין.
   9. לשטוף פעם אחת עם 0.1% v/v רצף-20 ב-PBS (5 דקות ב 125 סל ד על מסובבי המעבדה).
   10. לשטוף פעם אחת עם 0.01% v/v טריטון X-100 ב-PBS (2 דקות ב 125 rpm על מסובבי המעבדה).
   11. העבר במהירות את השקופית לצנצנת של Coplin המכילה את ה-PBS.
2. כריכת חלבונים
   1. הכנס את תא Pbm כפי שתואר קודם (שלבים 2.1.2 – 2.1.3).
   2. התערובת מחייבת חלבון פיפטה המכיל 5 μm T7 DNA primase, 30 mm טריס-HCl pH 7.5, 6.5 mm mgcl₂, 30 מ"מ K-גלוטמט, 6 מ"מ מילימטר (dtt), 65 μm ribonucleoside צידה טריפוספט (rntp), 2% w/v חלב רזה, 100 ng/μl סרום שור (bsa), 50 ng/μl האשכים סלמון DNA, ו 0.02% v/v טריטון X-100 (TX-100) לתוך כל חדר של שקופית gasket (מבלי לגעת הצדדים גומי ומבלי להציג בועות).
   3. שטוף את שקופית המיקרו-מערך לזמן קצר על-ידי טבילה בה בצלחת ה-PBS, המסירה כביסה עודפת ממשטח השקופיות. נגב את המשטחים שאינם דנ א של השקופית עם מחיקה נאה.
   4. הנמך באיטיות את שקופית המיקרו-מערך (כלפי מטה) אל שקופית האטם, והיזהר ממניעת דליפה מתא אחד למשנהו. מיד להרכיב ולהדק את מנגנון הקאמרית PBM מבלי להציג בועות. אם בועות לעשות טופס, הם יכולים להיות מוסרים על ידי הקשה בעדינות על תא פלדה נגד משטח קשה.
   5. דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. נוגדן פלורסנט
   1. להוציא את החדר PBM ולהסיר את שקופיות microarray שקופית "סנדוויץ", מטפל לא לשבור את החותם. לפרק מתחת למים בצלוחית לשטוף באמצעות מלקחיים. טלטל את השקופית מתחת למים והעבר במהירות לצנצנת Coplin המכילה את ה-PBS.
   2. להרכיב את חדר PBM עם שקופית gasket כמתואר בעבר (שלבים 2.1.2 – 2.1.3).
   3. הוסף אלקסה 488-מצודת נגד הנוגדן שלו (10 ng/μL במאגר הכריכה) לשקופית gasket.
   4. לשטוף את השקופית לזמן קצר על ידי טבילה אותה בצלחת PBS כמו לפני, ולאחר מכן להסיר את השקופית מ-PBS לאט, לנגב את משטח שאינו DNA ולמקם אותו כלפי מטה על שקופית gasket.
   5. דגירה 30 דקות ב RT בחושך (בדיקה הזריחה הוא רגיש קל) כדי להקטין את התמונה הלבנת.
   6. פרק את התא PBM ואת coverslip כמו קודם, הסרת שמיכות מתחת למים בצלחת לשטוף.
   7. שטוף את השקופיות לזמן קצר על-ידי טבילה בהן בצלחת ה-PBS. ייבש את השקופיות באוויר דחוס. אחסן באפלה בתיבה שקופית עד שהוא מוכן לסריקה.
4. סריקת שקופית המיקרו-מערך
   1. סריקת השבב באמצעות סורק microarray (להתייחס לטבלה של חומרים) עם עירור של 495 ננומטר ופליטה של 519 nm ולאסוף את עוצמת הקרינה החציוני.

3. ניתוח נתונים במיקרו-מערך

הערה: כל עיבוד הנתונים בוצע באמצעות סקריפטים כתובים מותאמים אישית ב-MATLAB.

1. בצע עיבוד נתונים הראשונית PBM באמצעות Wilcoxon דירוג סכום מבחן p-ערך כפי שמתואר בעבר⁴.
2. השתמש בערך החציון של עוצמת האיגוד עבור כל רצף DNA לצורך ניתוח נוסף.
3. לאחר מכן, באמצעות אחד הכיוון היחיד ANOVA p-ערכים, להשוות את המשמעות הסטטיסטית של ההבדלים הנצפים בעוצמות primase-DNA איגוד מושגת עבור קבוצות שונות של בדיקות דנ א, כפי שהוסבר לעיל ב העיצוב ספריית ה-DNA סעיף³.

4. תבנית בימוי RNA סינתזה מזרז על ידי T7 DNA primase

1. הכנת בלמינל ג'ל פוליאקרילאמיד
   1. כדי להכין 100 ml של ג'ל תערובת, לשלב 62.5 ml של 40% אקרילאמיד-ביסאקרילאמיד (19:1), 42 g של אוריאה, 1.1 g של טריס בסיס (2-אמינית -2-(הידרוקסימתיל)-1, 3-propanediol), 0.55 g של חומצה חומצת, ו0.4 mL של 0.5 M ethylenediגנול חומצה (edta) הפתרון.
   2. חלק את התערובת לתוך 14 מ"ל (הסכום הדרוש עבור ג'ל אחד של 16.5 ס"מ x 26 ס"מ x 0.03 ס"מ) ולשמור אותם מוגנים מפני אור ב 4 ° c עד 1 חודש.
   3. כדי להכין 1 הרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל, להוסיף 4 μl של temed ו-40 μl של 10% w/v אמוניום פרסולפט ל 14 מ ל של התערובת בעבר הוכנו, להטיל אותו, ולהשאיר אותו פולימלזציה עבור לפחות 2 h ב RT. הג ניתן לשמור ליום אחד ב -4 ° c.
2. הכנה לדוגמא
   הערה: שמור את הריאגנטים, תערובת התגובה, ודגימות על קרח.
   1. כדי להכין את תערובת התגובה הנדרשת עבור עשרה תגובות לשלב 11 μL של מאגר פעילות 5x (200 mM טריס-HCl, pH = 7.5; 50 מ"מ dithiothreitol, 250 מילימטר אשלגן, 50 MgCl₂), 5.5 μl של התערובת 2.5 mm של נוקלאוטיד tri-פוספט (ntps), ו 5.5 μl של מקור הקרינה [לדוגמה, ATP, (α-32P) 3000 Ci/ממול].
      הערה: כל הסכומים הוגדלה ב-10% עקב שגיאות מסוימות אפשריות. בהתאם לעוצמת האות הרדיואקטיבית (הדילול הראשוני הוא בדרך כלל 1:10 או יותר).
   2. העברה 2 μL של תערובת התגובה לעשר צינורות ה-PCR.
   3. הוסף 1 μL של 100 μM תבנית DNA לצינור ה-PCR המתאים והספין למטה.
   4. הוסף 2 μL של 16 μM T7 DNA primase, לסובב למטה, לערבב בעדינות, ו להסתחרר שוב.
   5. מודקון את התגובה ב RT עבור 20 דקות.
   6. להפסיק את התגובה על ידי הוספת 5 μl של הפתרון מקוצ'ינג (95% מתוך הטופס, 20 מ"מ edta, 0.05% w/v קסילן ו ברומרופנול כחול), לערבב, ו ספין למטה.
3. הפרדת מוצרי RNA על ידי אלקטרופורזה באמצעות העברת ג'ל פוליאקרילמיד וזיהוי אותות שלאחר מכן
   1. Pre-הפעל את ג'ל עבור 1 h (10 mA, 600 V) במאגר 1x TBE (90 mM טריס-borate, 2 מ"מ EDTA).
   2. לטעון עד 2 μL של כל מדגם ולבצע אלקטרופורזה (20 mA, 1100 V) ב 1x מאגר TBE (90 mM טריס-borate, 2 מ"מ EDTA).
   3. מייבשים את הג ב-80 ° c בואקום.
   4. לחשוף את לוחית הדימות זרחן כדי ג'ל רדיואקטיבי למשך כמה שעות עד הלילה, בהתאם לחוזק של אות רדיואקטיבי.
   5. הקלט את האות (צילום מגורה) באמצעות פוספוריד (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

מקדמה טכנולוגית זו למיפוי אתרי הכריכה הprimase מאפשרת קבלת תכונות מחייבות של דנ א, הקשות, אם לא בלתי אפשריות, להתבונן בכלים הקלאסיים. חשוב יותר, HTPP מאפשר המחודשת של ההבנה המסורתית של אתרי איגוד primase. באופן ספציפי, HTPP חושף את מחייב specificities בנוסף ידוע 5 '-GTC-3 ' רצפי זיהוי, אשר מוביל ?...

Discussion

שיטת PBM נעשה שימוש נרחב כדי לחקור את מאפייני הכריכה של שעתוק גורמים והוא יכול גם להיות מוחל על אנזימים עיבוד DNA, כגון primase DNA, כי לאגד DNA עם זיקה נמוכה. עם זאת, יש צורך בשינויים מסוימים בהליכים ניסיוניים. הניסוי המיקרו-מערך כרוך במספר שלבים: עיצוב ספריית ה-DNA, הכנת השבב, איגוד מטרת החלבון, תיוג פל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution	Merck	1006401000
95% formamide	Sigma-Aldrich	F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody	Qiagen	35310
Ammonuium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol	Perkin Elmer	NEG003H250UC
Boric acid, granular	Glentham Life Sciences	GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA)	Roche	10735094001
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-25G
DNA microarray	Agilent		4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Acros Organics	AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager	FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack	Thermo Scientific	12869995	If several slides are used
Lab rotator	Thermo Scientific	88880025
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	63064-500G
Microarray Hybridization Chamber	Agilent	G2534A	https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A)	Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Potassium glutamate	Alfa Aesar	A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)	New England BioLabs	N0466S
Salmon testes DNA	Sigma-Aldrich	D1626-1G
Skim milk powder	Sigma-Aldrich	70166-500G
Staining dish	Thermo Scientific	12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-Rad	1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma-Aldrich	93362-500G
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
Urea	Sigma-Aldrich	U6504-1KG
Xylene cyanol	Alfa Aesar	B21530