DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling

Zusammenfassung

Proteinbindende Mikroarray -Experimente (PBM) in Kombination mit biochemischen Assays verknüpfen die Bindungs- und katalytischen Eigenschaften von DNA-Primase, einem Enzym, das RNA-Primer auf Vorlagen-DNA synthetisiert. Diese Methode, die als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet wird, kann verwendet werden, um DNA-bindende Muster einer Vielzahl von Enzymen zu offenbaren.

Zusammenfassung

DNA-Primase synthetisiert kurze RNA-Primer, die die DNA-Synthese von Okazaki-Fragmenten auf dem laggierenden Strang durch DNA-Polymerase während der DNA-Replikation initiieren. Die Bindung von prokaryotischen DnaG-ähnlichen Primasen an die DNA erfolgt in einer bestimmten Trinukleotid-Erkennungssequenz. Es ist ein entscheidender Schritt bei der Bildung von Okazaki-Fragmenten. Herkömmliche biochemische Werkzeuge, die zur Bestimmung der DNA-Erkennungssequenz von DNA-Primase verwendet werden, liefern nur begrenzte Informationen. Anhand eines mikroarraybasierten Bindungstests mit hohem Durchsatz und aufeinander folgenden biochemischen Analysen wurde gezeigt, dass 1) der spezifische Bindungskontext (flankierende Sequenzen der Erkennungsstelle) die Bindungsfestigkeit der DNA-Primase an ihre Schablone beeinflusst. DNA und 2) eine stärkere Bindung von Primase an die DNA ergibt längere RNA-Primer, was auf eine höhere Prozessivität des Enzyms hindeutet. Diese Methode kombiniert PBM und Primase Aktivität Assay und wird als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet, und es ermöglicht die Charakterisierung der spezifischen Sequenzerkennung durch DNA-Primase in beispielloser Zeit und Skalierbarkeit.

Einleitung

HTPP nutzt die DNA-bindende Mikroarray-Technologie in Kombination mit biochemischer Analyse (Abbildung 1), um spezifische Merkmale von DNA-Vorlagen, die die enzymatische Aktivität von DNA-Primase beeinflussen, statistisch zu identifizieren. Daher bietet HTPP eine technologische Plattform, die einen Wissenssprung auf diesem Gebiet erleichtert. Die klassischen Werkzeuge, die verwendet werden, um Primase-Erkennungs-Sites zu bestimmen, haben nicht die Fähigkeit, eine riesige Datenmenge zu liefern, während HTPP dies tut.

PBM ist eine Technik, die routinemäßig verwendet wird, um die Bindungspräferenzen von Transkriptionsfaktoren an DNA^1,2zu bestimmen; es ist jedoch nicht geeignet, eine schwache/transiente Bindung von Proteinen an die DNA zu erkennen. Im Gegensatz zum universellen PBM, das Informationen über die durchschnittliche Proteinbindungsspezifität zu allen möglichen Sequenzen aus acht Basenpaaren liefert, basiert HTPP auf der Bibliothek einsträngiger DNA-Vorlagen, die einzigartige Sequenzelemente enthalten. Solche DNA-Sequenzelemente umfassen Zehntausende kurze (wenige Dutzend bp) genomische Sequenzen sowie computerisch gestaltete DNA-Sequenzen, die in bestimmten DNA-Wiederholungssequenzelementen angereichert sind, die im Genom vorhanden sind und unterschiedliche durchschnittliche GC-Gehalte aufweisen. . Ein solcher Ansatz mit hohem Durchsatz ermöglicht die systematische, quantitative und hypothesengesteuerte Bestimmung der sequenzbezogenen Eigenschaften, die für die Primasebindung und ihre enzymatische Aktivität wichtig sind³. Insbesondere wurde für dieses enzymatische System^diewichtige Verbindung zwischen Primase-DNA-Bindungspräferenzen (moduliert durch DNA-Sequenzen, die bestimmte Trinukleotid-Bindungsstellen flankieren) und der Primase-Prozessivität identifiziert 4 .

Die neue Technologie wurde angewendet, um unser Verständnis von Primase-Erkennungsstellen auch für die T7 DNA Primase zu überprüfen, die ausgiebig untersucht wurde⁵. Insbesondere die erneute Untersuchung klassischer Konzepte, wie DNA-Erkennungsstellen von T7-DNA-Primase (die vor fast vier Jahrzehnten bestimmt wurden ⁶) mit Protein-DNA-bindendem Mikroarray (PBM) hat zu beispiellosen Erkenntnissen in Merkmalen geführt, die mit die flankierende Reihenfolge dieser Erkennungsstellen³. Es wurde erwartet, dass die Sequenzen, die die Trinukleotid-Erkennungsstelle von T7 DNA Primase (5'-GTC-3') flankieren, zufällig sein werden. Stattdessen fanden wir heraus, dass TG-reiche Flankensequenzen die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass T7-DNA-Primse längere RNA-Primer synthetisieren, was auf eine Erhöhung der Prozessivität hindeutet.

Andere Methoden, die verwendet werden können, um DNA-bindende Eigenschaften von Proteinen in vitro zu untersuchen, sind der elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstest (EMSA)⁷, DNase I Footprinting⁸, Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)⁹und Southwestern Blotting ¹⁰. Dabei handelt es sich jedoch um Methoden mit geringem Durchsatz, die nur zur Untersuchung einer kleinen Anzahl von DNA-Sequenzen gelten. Darüber hinaus ist die Genauigkeit und Empfindlichkeit einiger dieser Techniken (z. B. EMSA) gering. Andererseits ist die In-vitro-Auswahl¹¹ eine Technik, die ähnlich wie PBM zur Identifizierung zahlreicher Bindungssequenzen eingesetzt werden kann. Jedoch, niedrige Affinität Sequenzen sind in der Regel in den meisten Anwendungen der In-vitro-Auswahl ausgeschlossen; Daher ist dieser Ansatz nicht geeignet, vergleichende Verbindliche Daten für alle verfügbaren Sequenzen zu erhalten. Das universelle PBM^1,2 wird hauptsächlich verwendet, um die Bindungsspezifitäten von Transkriptionsfaktoren von Prokaryoten und Eukaryoten sowie spezifische Faktoren (z. B. Vorhandensein bestimmter Liganden, Kofaktoren usw.) zu charakterisieren, die diese Interaktion beeinflussen¹².

HTPP erweitert die PBM-Anwendung auf DNA-verarbeitungsenzyme, indem beispiellose statistische Leistung mit hohem Durchsatz mit hoher Präzision kombiniert wird, um Informationen über den Bindungssequenzkontext bereitzustellen. Solche Daten wurden für Primas und verwandte Enzyme (die eine schwache/transiente Bindung an die DNA haben) aufgrund der oben genannten technischen Beschränkungen anderer verfügbarer Techniken noch nicht gewonnen.

Protokoll

1. Design von Mikroarray

HINWEIS: DNA-Sonden stellen benutzerdefinierte 36-Nukleotid-Sequenzen dar, die aus der Erkennungsstelle für T7 DNA primase (GTC) bestehen, die sich zwischen zwei variablen Flankenbereichen befindet, gefolgt von einer konstanten 24-Nukleotid-Sequenz, die an einen Glasschlitten gebunden ist³. Wir verwendeten ein 4 x 180.000 Mikroarray-Format, das es ermöglichte, jede DNA-Sequenz in sechs Replikationen zu erkennen, die zufällig auf der Folie verteilt wurden.

1. Entwurf einer DNA-Bibliothek für Primasen mit bekannten Erkennungssequenzen
   1. Stellen Sie sicher, dass jede Sequenz aus 60 Nukleotiden besteht. Halten Sie die ersten 24 Nukleotide konstant (an der Glasrutsche befestigt). Variable Regionen sollten die folgende allgemeine Form haben: (N)₁₆AGB(N)₁₇; wobei N ein beliebiges Nukleotid darstellt.
   2. Entwerfen Sie den flankierenden Bereich, um eine bestimmte wissenschaftliche Frage zu beantworten (ein Beispiel für das Design wird im folgenden Text dargestellt). Die flankierenden Bereiche können so konzipiert sein, dass sie bestimmte Features wie die Wiederholungselemente oder die spezifische Symmetrie enthalten.
      ANMERKUNG: Wir haben acht Kategorien verschiedener Flankensequenzen erstellt, die aus zwei oder drei spezifischen Nukleotiden bestehen: T und G (Gruppe 1); T und C (Gruppe 2); C und A (Gruppe 3); A und G (Gruppe 4); G, C und T (Gruppe 5); C, T und A (Gruppe 6); G, A und T (Gruppe 7); G, A und C (Gruppe 8). Für jede Gruppe wurden 2.000 verschiedene Sequenzen entworfen. Jede Gruppe hatte Untergruppen von Sequenzen mit unterschiedlichen Typen und unterschiedlichen Anzahl von Sequenzwiederholungen.
   3. Schließen Sie einen Satz negativer Regelsequenzen ein (ohne die spezifische Bindungssite)⁴. Das Vorhandensein solcher Sequenzen ermöglicht es, das Auftreten einer spezifischen Bindung im Experiment zu validieren.
2. Entwurf einer DNA-Bibliothek für Primasen mit unbekannten Erkennungssequenzen
   1. Wenn die Erkennungssequenz unbekannt ist, erstellen Sie die DNA-Bibliothek, indem Sie die Sequenzen (mit oder ohne spezifische Merkmale, die bereits erwähnt wurden) aus dem Genom des gewünschten Organismus (Bakterien, Pilze usw.) auswählen.
3. Design von Mikroarray-Dia
   1. Kaufen Sie benutzerdefinierte Folien (z. B. 4x180K, AMADID #78366) von einem kommerziellen Lieferanten (weitere Informationen finden Sie in der Tabelle der Materialien). Ordnen Sie jede Sequenz in sechs Replikationen an, wobei jede Replikation an einen zufällig ausgewählten Punkt auf der Folie angefügt werden soll.

2. Primase DNA-Bindungsexperiment

HINWEIS: Am Vortag (oder mindestens 2 h vor) die PBM, bereiten Sie die Blockierenlösung [2% w/v Magermilch in Phosphatpuffer-Saline (PBS)] und rühren Sie sie auf einem magnetischen Rührer. Filtern Sie vor der Verwendung die Lösung mit einem 0,45-M-Filter. Um die Primasebindung an die DNA-Stränge zu erkennen, sollten mehrere Schritte in der folgenden Reihenfolge ausgeführt werden.

1. Sperrverfahren
   1. Vorbefeuchten des Mikroarray-Dias in einem Coplin-Glas mit 0,01% v/v Triton X-100 in PBS (5 min bei 125 Rpm auf einem Laborrotator).
   2. Waschen Sie den Dichtungsschlitten (auch als Deckelrutsch bezeichnet) kurz mit Wasser und Ethanol und trocknen Sie ihn mit Druckluft.
   3. Unterteil der Stahlhybridisationskammer (PBM-Kammer) mit der Dichtungsrutsche nach oben montieren (kommerzielles Etikett nach oben). Weitere Informationen zur Baugruppe finden Sie in der Tabelle der Materialien.
   4. Pipet-Blockierlösung (2% w/v Magermilch in PBS) in jede Kammer.
   5. Entfernen Sie das Mikroarray-Dia aus dem Coplin-Glas, dann trocknen Sie die Nicht-DNA-Seite (die DNA sollte auf der gleichen Seite wie das Firmenetikett sein) und Kanten mit einem feinen Wisch. Legen Sie das Mikroarray langsam auf die Dichtungsrutsche und vermeiden Sie Blasen (Firmenetikett nach unten). Sofort stahlmischungskammergeräte montieren und straffen. 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
   6. Füllen Sie eine Färbeschale (die "PBS" Schale) mit 800 ml frische PBS. Füllen Sie eine zweite Färbeschale (die "WASH" Schale) mit 800 ml frisch zubereitet0,5% v/v Tween-20 in PBS.
   7. Lösen Sie die PBM-Kammer und entfernen Sie den Microarray-Slide-Coverslip "Sandwich", wobei darauf geachtet wird, die Dichtung nicht zu brechen. Zerlegen Sie es unter Wasser in der WASH Schale, indem Sie Zangen zwischen dem Schiebe- und dem Deckelschlupf platzieren.
   8. Schütteln Sie die Mikroarray-Rutsche unter Wasser und übertragen Sie sie schnell in ein Coplin-Glas.
   9. Einmal mit 0,1% v/v Tween-20 in PBS waschen (5 min bei 125 Rpm auf einem Laborrotator).
   10. Einmal mit 0,01% v/v Triton X-100 in PBS waschen (2 min bei 125 Rpm auf einem Laborrotator).
   11. Übertragen Sie die Folie schnell in ein Coplin-Glas, das PBS enthält.
2. Proteinbindung
   1. Montieren Sie die PBM-Kammer wie zuvor beschrieben (Schritte 2.1.2–2.1.3).
   2. Pipettenprotein-Bindungsgemisch mit 5 M T7-DNA-Primase, 30 mM Tris-HCl pH 7,5, 6,5 mM MgCl₂, 30 mM K-Glutamat, 6 mM Dithiothreitol (DTT), 65 m Ribonukleosidtriphosphat (rNTP), 2% w/v Magermilch, 100 ng/L Rinderserumalbumin (BSA), 50 ng/L Lachshoden DNA und 0,02% v/v Triton X-100 (TX-100) in jede Kammer der Dichtung gleiten (ohne die Gummiseiten berühren und ohne Blasen einleiten).
   3. Spülen Sie den Mikroarray-Dia kurz, indem Sie ihn in die PBS-Schale tauchen, wodurch überschüssiges Reinigungsmittel von der Oberfläche der Dias entfernt wird. Wischen Sie die Nicht-DNA-Oberflächen des Dias mit einem feinen Wischabwischen ab.
   4. Senken Sie langsam den Mikroarray-Schlitten (nach unten) auf die Dichtungsrutsche, wobei Sie darauf achten, Leckagen von einer Kammer zur anderen zu verhindern. Sofort stellen und festigen PBM-Kammergerät ohne Blasen ein. Wenn sich Blasen bilden, können sie durch sanftes Antippen der Stahlkammer gegen eine harte Oberfläche entfernt werden.
   5. 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
3. Fluoreszierende Antikörper-Befestigung
   1. Lösen Sie die PBM-Kammer und entfernen Sie den Microarray-Slide-Coverslip "Sandwich", wobei darauf geachtet wird, die Dichtung nicht zu brechen. Unter Wasser in der WASH Schale mit Zangen zerlegen. Schütteln Sie die Rutsche unter Wasser und übertragen Sie sie schnell in ein Coplin-Glas, das PBS enthält.
   2. Montieren Sie die PBM-Kammer mit Dichtungsschlitten wie zuvor beschrieben (Schritte 2.1.2–2.1.3).
   3. Fügen Sie Alexa 488-konjugierter Anti-His-Antikörper (10 ng/L im Bindungspuffer) in den Dichtungsschlitten ein.
   4. Spülen Sie die Folie kurz, indem Sie sie wie zuvor in pbS-Schale tauchen, dann entfernen Sie den Schlitten langsam von PBS, wischen Sie die Nicht-DNA-Oberfläche ab und legen Sie sie nach unten auf dichtungsschlitten.
   5. Inkubieren Sie 30 min bei RT im Dunkeln (Fluoreszenzsonde ist lichtempfindlich), um die Photobleichung zu reduzieren.
   6. Zerlegen Sie die PBM-Kammer und Abdeckungsrutsche wie zuvor, entfernen Sie den Deckelrutsch unter Wasser in der WASH-Schale.
   7. Spülen Sie die Dias kurz, indem Sie sie in die PBS-Schale tauchen. Trocknen Sie die Dias mit Druckluft. Im Dunkeln in einer Folienbox aufbewahren, bis sie zum Scannen bereit ist.
4. Scannen des Microarray-Dias
   1. Scannen Sie den Chip mit Einem Mikroarray-Scanner (siehe Tabelle der Materialien) mit einer Anregung von 495 nm und einer Emission von 519 nm und erfassen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität.

3. Mikroarray-Datenanalyse

HINWEIS: Die gesamte Datenverarbeitung wurde mit benutzerdefinierten geschriebenen Skripten in MATLAB durchgeführt.

1. Führen Sie die anfängliche PBM-Datenverarbeitung mit Wilcoxon-Rangsummentest p-Wert durch, wie zuvor^{beschrieben 4}.
2. Verwenden Sie den Medianwert der Bindungsintensität für jede DNA-Sequenz für die weitere Analyse.
3. Als nächstes vergleichen Sie anhand der einwegigen ANOVA-p-Werte die statistische Signifikanz der beobachteten Unterschiede in den Primase-DNA-Bindungsintensitäten, die für verschiedene Gruppen von DNA-Sonden erhalten wurden, wie oben im DNA-Bibliotheksdesignabschnitt³erläutert.

4. Vorlagengesteuerte RNA-Synthese katalysiert durch T7 DNA Primase

1. Herstellung von denaturierendem Polyacrylamid-Gel
   1. Zur Herstellung von 100 ml Gelgemisch 62,5 ml 40% Acrylamid-Bisacrylamid (19:1), 42 g Harnstoff, 1,1 g Tris-Basis (2-Amino-2-(Hydroxymethyl)-1,3-Propandiol), 0,55 g Borsäure und 0,4 ml 0,5 M Ethylendiamintetraacetic(EDTA) Lösung.
   2. Teilen Sie die Mischung in 14 ml Aliquots (die menge für ein Gel von 16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm) und halten Sie sie vor Licht bei 4 °C für bis zu 1 Monat geschützt.
   3. Um ein denaturierendes Polyacrylamid-Gel zuzubereiten, fügen Sie 4 l TEMED und 40 l 10 % w/v Ammoniumpersulfat auf 14 ml des zuvor hergestellten Gemisches auf, gießen Sie es und lassen Sie es mindestens 2 h bei RT polymerisieren. Das Gel kann für einen Tag bei 4 °C aufbewahrt werden.
2. Probenvorbereitung
   HINWEIS: Bewahren Sie die Reagenzien, Reaktionsmischungen und Proben auf Eis auf.
   1. Zur Vorbereitung des für zehn Reaktionen erforderlichen Reaktionsgemischs kombinieren Sie 11 l 5x Aktivitätspuffer (200 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 50 mM Dithiothreitol, 250 mM Kaliumglutamat, 50 mM MgCl₂), 5,5 l 2,5 mM Gemisch aus Nukleotidtriphosphat (NPS) und 5,5 radioaktiv markiertes Ribonukleotid [z.B. ATP, (-32P) 3000 Ci/mmol].
      HINWEIS: Alle Beträge wurden aufgrund möglicher Pipettierfehler um 10 % erhöht. Radioaktivmarkierte Ribonukleotide sollten entsprechend der Stärke des radioaktiven Signals verdünnt werden (die anfängliche Verdünnung ist in der Regel 1:10 oder mehr).
   2. Übertragen Sie 2 l des Reaktionsgemisches auf zehn PCR-Röhren.
   3. Fügen Sie der entsprechenden PCR-Röhre 1 l von 100 -M DNA-Vorlage hinzu und drehen Sie sich nach unten.
   4. Fügen Sie 2 L von 16 'M T7 DNA Primase, spin down, mischen sie sanft, und drehen Sie wieder nach unten.
   5. Inkubieren Sie die Reaktion bei RT für 20 min.
   6. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 5 l Abschrecklösung (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% w/v Xylolcyanol und Bromphenolblau) hinzufügen, mischen und ausgliedern.
3. Trennung von RNA-Produkten durch Elektrophorese durch Denaturierung von Polyacrylamid-Gel und anschließende Signaldetektion
   1. Das Gel für 1 h (10 mA, 600 V) im 1x TBE Puffer (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA) vorlaufen.
   2. Laden Sie bis zu 2 l jeder Probe und führen Sie Elektrophorese (20 mA, 1100 V) in 1x TBE Puffer (90 mM Tris-Borate, 2 mM EDTA).
   3. Trocknen Sie das Gel für 2 h bei 80 °C unter einem Vakuum.
   4. Setzen Sie die Phosphorbildplatte für einige Stunden bis über Nacht radioaktiven Gel aus, abhängig von der Stärke des radioaktiven Signals.
   5. Zeichnen Sie das Signal (photostimulierte Lumineszenz) mit Phosphorimager auf (siehe Tabelle der Materialien).

Ergebnisse

Dieser technologische Fortschritt für die Kartierung der Primase-Bindungsstellen ermöglicht die Erlangung von DNA-Bindungseigenschaften, die mit klassischen Werkzeugen schwer, wenn nicht gar unmöglich zu beobachten sind. Noch wichtiger ist, dass HTPP die Überprüfung des traditionellen Verständnisses von Primase-Bindungsstellen ermöglicht. Insbesondere zeigt HTPP neben bekannten 5'-GTC-3'-Erkennungssequenzen verbindliche Spezifitäten auf, was zu Veränderungen der funktionellen Akt...

Diskussion

Die PBM-Methode wurde weit verbreitet, um bindungseigenschaften von Transkriptionsfaktoren zu untersuchen und kann auch auf DNA-Verarbeitungsenzyme wie DNA-Primase angewendet werden, die an DNA mit geringer Affinität binden. Es sind jedoch bestimmte Änderungen der Versuchsverfahren erforderlich. Das Mikroarray-Experiment umfasst mehrere Schritte: Entwurf der DNA-Bibliothek, Vorbereitung des Chips, Bindung des Proteinziels, fluoreszierende Kennzeichnung und Scannen. Milde Waschschritte sind entscheidend, da die langen W...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution	Merck	1006401000
95% formamide	Sigma-Aldrich	F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody	Qiagen	35310
Ammonuium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol	Perkin Elmer	NEG003H250UC
Boric acid, granular	Glentham Life Sciences	GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA)	Roche	10735094001
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-25G
DNA microarray	Agilent		4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Acros Organics	AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager	FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack	Thermo Scientific	12869995	If several slides are used
Lab rotator	Thermo Scientific	88880025
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	63064-500G
Microarray Hybridization Chamber	Agilent	G2534A	https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A)	Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Potassium glutamate	Alfa Aesar	A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)	New England BioLabs	N0466S
Salmon testes DNA	Sigma-Aldrich	D1626-1G
Skim milk powder	Sigma-Aldrich	70166-500G
Staining dish	Thermo Scientific	12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-Rad	1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma-Aldrich	93362-500G
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
Urea	Sigma-Aldrich	U6504-1KG
Xylene cyanol	Alfa Aesar	B21530