Riconoscimento della sequenza del DNA da parte del primase del DNA utilizzando la profilazione primasise ad alto valore a più velocità

Riepilogo

Gli esperimenti di microarray di legame proteico (PBM) combinati con saggi biochimici collegano le proprietà di legame e catalitiche del primasico del DNA, un enzima che sintetizza i primer dell'RNA sul DNA del modello. Questo metodo, designato come profilazione dei primasi ad alto consumo (HTPP), può essere utilizzato per rivelare modelli di legame del DNA di una varietà di enzimi.

Abstract

I sinteti del DNA sintetizzano brevi primer di RNA che avviano la sintesi del DNA di frammenti di Okazaki sul filamento in ritardo dalla polimerasi del DNA durante la replicazione del DNA. Il legame di primati prokaryotic come DnaG al DNA avviene in una specifica sequenza di riconoscimento trinucleotide. È un passo fondamentale nella formazione dei frammenti di Okazaki. Gli strumenti biochimici convenzionali che vengono utilizzati per determinare la sequenza di riconoscimento del DNA del primato del DNA forniscono solo informazioni limitate. Utilizzando un saggio di legame ad alto consumo basato su microarray e analisi biochimiche consecutive, è stato dimostrato che 1) il contesto di legame specifico (sequenze di fianco del sito di riconoscimento) influenza la forza di legame del DNA primase al suo modello DNA, e 2) un legame più forte dei primati al DNA produce primer di RNA più lunghi, indicando una maggiore proiettività dell'enzima. Questo metodo combina PBM e analisi dell'attività di primasia ed è designato come profilatura del primato ad alta velocità (HTPP) e consente la caratterizzazione del riconoscimento di sequenza specifica da parte del primato del DNA in tempi e scalabilità senza precedenti.

Introduzione

HTPP utilizza la tecnologia di microarray di legame del DNA combinata con l'analisi biochimica (Figura 1) per identificare statisticamente caratteristiche specifiche dei modelli di DNA che influenzano l'attività enzimatica del primato del DNA. Pertanto, HTPP fornisce una piattaforma tecnologica che facilita un salto di conoscenza nel campo. Gli strumenti classici utilizzati per determinare i siti di riconoscimento primase non hanno la capacità di produrre enormi quantità di dati, mentre HTPP lo fa.

PBM è una tecnica abitualmente utilizzata per determinare le preferenze di legame dei fattori di trascrizione al DNA^1,2; tuttavia, non è adatto per il rilevamento di un legame debole/transitorio delle proteine al DNA. A differenza del PBM universale che fornisce informazioni sulla specificità media di legame delle proteine a tutte le possibili sequenze costituite da otto coppie di basi, HTPP si basa sulla libreria di modelli di DNA a filamento singolo che comprendono elementi di sequenza unici. Tali elementi della sequenza del DNA coinvolgono decine di migliaia di brevi (poche decine di bp), così come sequenze di DNA progettate computazionalmente arricchite in alcuni elementi della sequenza ripetitiva del DNA presenti nel genoma, che possiedono diversi contenuti GC medi . Un approccio ad alta velocità consente la determinazione, in modo sistematico, quantitativo e basato sull'ipotesi, delle proprietà correlate alla sequenza che sono importanti per l'associazione primasite e la sua attività ezimatica^{3 .} In particolare, è stato identificato l'importante legame tra le preferenze di legame primase-DNA (modulato da sequenze di DNA che fiancheggiano specifici siti di legame trinucleotide) e la processiesi primasipera per questo sistema enzimatico⁴.

La nuova tecnologia è stata applicata per rivedere la nostra comprensione dei siti di riconoscimento dei primati anche per il primato del DNA T7 che è stato ampiamente studiato⁵. In particolare, il riesame di concetti classici, come i siti di riconoscimento del DNA del DNA T7 primase (che sono stati determinati quasi quattro decenni fa ⁶) utilizzando il microarray legante proteina-DNA (PBM) ha portato a una comprensione senza precedenti delle caratteristiche relative la sequenza di fianco di questi siti di riconoscimento³. Ci si aspettava che le sequenze che fiancheggiano il sito di riconoscimento tri-nucleotide del primato del DNA T7 (5'-GTC-3') saranno casuali. Invece, abbiamo scoperto che le sequenze di fianco ricche di TG aumentano le probabilità che il DNA T7 sintetizza i primer più lunghi dell'RNA indicando un aumento della processizia.

Altri metodi che possono essere utilizzati per studiare le proprietà di legame del DNA delle proteine in vitro includono l'analisi elettroforica del cambio di mobilità (EMSA)⁷, DNase I che ingeri⁸, risonanza del plasmon (SPR)⁹e blotting Southwestern ¹⁰. Si tratta, tuttavia, di metodi a bassa produttività applicabili solo allo studio di un piccolo numero di sequenze di DNA. Inoltre, la precisione e la sensibilità di alcune di queste tecniche (ad esempio, EMSA) è bassa. D'altra parte, la selezione in vitro¹¹ è una tecnica che, analogamente al PBM, può essere utilizzata per l'identificazione di numerose sequenze di rilegatura. Tuttavia, le sequenze di bassa affinità sono solitamente escluse nella maggior parte delle applicazioni di selezione in vitro; pertanto, questo approccio non è adatto per ottenere dati di associazione comparativi per tutte le sequenze disponibili. L'universale PBM^1,2 è utilizzato principalmente per caratterizzare le specificità vincolanti dei fattori di trascrizione da procarioti ed eucarioti, nonché fattori specifici (ad esempio, la presenza di alcuni leganti, cofattori, ecc.) che possono influenzano questa interazione¹².

HTPP espande l'applicazione PBM agli enzimi di elaborazione del DNA combinando una potenza statistica ad alta velocità senza precedenti con alta precisione per fornire informazioni sul contesto della sequenza di rilegatura. Tali dati non sono ancora stati ottenuti per i primati e gli enzimi correlati (che hanno un legame debole/transitorio al DNA) a causa delle suddette limitazioni tecniche di altre tecniche disponibili.

Protocollo

1. Progettazione di microarray

NOTA: le sonde di DNA rappresentano sequenze personalizzate a 36 nucleotidi, costituite dal sito di riconoscimento per il primato del DNA T7 (GTC) situato tra due regioni di fiancheggiamento variabili, seguito da una costante sequenza di 24 nucleotidi contesa a una diapositiva di vetro³. Abbiamo usato un formato microarray 4 x 180,000, che ha permesso l'avvistamento di ogni sequenza di DNA in sei repliche, distribuite in modo casuale sulla diapositiva.

1. Progettazione della libreria del DNA per i primati con sequenze di riconoscimento note
   1. Assicurarsi che ogni sequenza sia composta da 60 nucleotidi. Mantenere costanti i primi 24 nucleotidi (da attaccare allo scivolo di vetro). Le regioni variabili devono avere la seguente forma generale: (N)₁₆GTC(N)₁₇; dove N rappresenta qualsiasi nucleotide desiderato.
   2. Progettare la regione di fianco per affrontare una specifica questione scientifica (un esempio del disegno o modello è presentato nel testo seguente). Le regioni di fianco possono essere progettate per contenere caratteristiche specifiche come gli elementi di ripetizione o la simmetria specifica.
      NOTA: Abbiamo creato otto categorie di diverse sequenze di fiancheggiamento composte da due o tre nucleotidi specifici: T e G (gruppo 1); T e C (gruppo 2); C e A (gruppo 3); A e G (gruppo 4); G, C e T (gruppo 5); C, T e A (gruppo 6); G, A e T (gruppo 7); G, A e C (gruppo 8). Per ogni gruppo sono state progettate 2.000 sequenze diverse. Ogni gruppo aveva sottogruppi di sequenze con diversi tipi e diversi numeri di ripetizioni di sequenze.
   3. Includere un set di sequenze di controllo negative (senza il sito di associazione specifico)⁴. La presenza di tali sequenze consente di convalidare l'occorrenza di un'associazione specifica nell'esperimento.
2. Progettazione della libreria del DNA per i primati con sequenze di riconoscimento sconosciute
   1. Se la sequenza di riconoscimento è sconosciuta, creare la libreria del DNA selezionando le sequenze (con o senza caratteristiche specifiche menzionate in precedenza) dal genoma dell'organismo desiderato (batteri, funghi, ecc.).
3. Progettazione di microarray slide
   1. Acquistare diapositive personalizzate (ad esempio, 4x180K, AMADID #78366) da un fornitore commerciale (per ulteriori dettagli vedere Tabella dei materiali). Ordinare ogni sequenza in sei repliche, in cui ogni replica deve essere collegata a un punto selezionato casualmente sulla diapositiva.

2. Esperimento di legame del DNA primase

NOTA: il giorno prima (o almeno 2 h) il PBM, preparare la soluzione di blocco [2% w/v skim latte in salina buffer fosfato (PBS)] e mescolare su una agitazione magnetica. Prima dell'uso, filtrare la soluzione con un filtro da 0,45 M. Per rilevare il legame di primasio ai filamenti di DNA, è necessario eseguire diversi passaggi nell'ordine seguente.

1. Procedura di blocco
   1. Pre-bagnato il vetrino microarray in un barattolo Coplin con 0.01% v/v Triton X-100 in PBS (5 min a 125 rpm su un rotatore di laboratorio).
   2. Lavare brevemente lo scivolo della guarnizione (noto anche come coverslip) con acqua ed etanolo e secco con aria compressa.
   3. Assemblare la parte inferiore della camera di ibridazione in acciaio (camera PBM) con lo scivolo della guarnizione rivolto verso l'alto (etichetta commerciale rivolta verso l'alto). Per ulteriori informazioni sull'assieme, fare riferimento alla Tabella dei materiali.
   4. Soluzione di blocco pipet (2% w/v skim latte in PBS) in ogni camera.
   5. Rimuovere il vetrino microarray dal barattolo Coplin, quindi asciugare il lato non DNA (il DNA dovrebbe essere sullo stesso lato dell'etichetta aziendale) e i bordi utilizzando una salvietta fine. Posizionare lentamente il microarray sullo scivolo della guarnizione, evitando le bolle (etichetta aziendale rivolta verso il basso). Immediatamente assemblare e stringere apparato camera di ibridazione in acciaio. Incubare per 1 h a temperatura ambiente (RT).
   6. Riempire un piatto di colorazione (il piatto "PBS") con 800 mL di PBS fresco. Riempire un secondo piatto di colorazione (il piatto "WASH") con 800 mL di 0,5% appena preparato 0,5% v/v Tween-20 in PBS.
   7. Svitare la camera PBM e rimuovere il microarray slide-coverslip "sandwich", facendo attenzione a non rompere la guarire. Smontarlo sott'acqua nel piatto WASH posizionando pinze tra il vetrino e il coperchio.
   8. Agitare il microarray sott'acqua e trasferirlo rapidamente in un barattolo Coplin.
   9. Lavare una volta con lo 0,1% v/v Tween-20 in PBS (5 min a 125 giri/m su un rotatore di laboratorio).
   10. Lavare una volta con 0,01% v/v Triton X-100 in PBS (2 min a 125 giri/m su un rotatore di laboratorio).
   11. Trasferire rapidamente la diapositiva in un barattolo Coplin contenente PBS.
2. Rilegatura proteica
   1. Assemblare la camera PBM come descritto in precedenza (passaggi da 2.1.2–2.1.3).
   2. Miscela di legame della proteina pipetta contenente 5 30 mM Tris-HCl pH 7,5, 6,5 mM MgCl₂, 30 mM K-glutamate, 6 mM dithiothreitol (DTT), 65M ribonucleoside tripospfata (rNTP), 2% w/v latte scremato, 100 ng/L -L - Album di siero bovino (BSA), 50 testiti di salmone DNA, e 0.02% v/v Triton X-100 (TX-100) in ogni camera dello scivolo guarnizione (senza toccare i lati di gomma e senza introdurre bolle).
   3. Risciacquare brevemente il microarray immergendolo nel piatto PBS, che rimuove il detergente in eccesso dalla superficie dei vetrini. Pulire le superfici non-DNA del vetrino con una salvietta fine.
   4. Abbassare lentamente il vetrino microarray (rivolto verso il basso) sul vetrino guarnizione, facendo attenzione a prevenire perdite da una camera all'altra. Immediatamente assemblare e stringere l'apparato della camera PBM senza introdurre bolle. Se le bolle si formano, possono essere rimosse toccando delicatamente la camera d'acciaio contro una superficie dura.
   5. Incubare per 30 min a temperatura ambiente (RT).
3. Attacco anticorpale fluorescente
   1. Svitare la camera PBM e rimuovere il microarray slide-coverslip "sandwich", facendo attenzione a non rompere la guarire. Smontare sott'acqua nel piatto WASH utilizzando le pinze. Agitare lo scivolo sott'acqua e trasferirlo rapidamente in un barattolo Coplin contenente PBS.
   2. Assemblare la camera PBM con slitta come descritto in precedenza (passaggi 2.1.2–2.1.3).
   3. Aggiungere l'anticorpo anti-coniugato di Alexa 488 (10 ng/L nel buffer di rilegatura) allo scivolo della guarnizione.
   4. Sciacquare brevemente la diapositiva immergendola nel piatto PBS come prima, quindi rimuovere lentamente il vetrino da PBS, pulire la superficie non DNA e posizionarla rivolta verso il basso sul vetrino.
   5. Incubare 30 min a RT al buio (sonda fluorescenza è sensibile alla luce) per ridurre il foto-sbiancamento.
   6. Smontare la camera PBM e la coverslip come prima, rimuovendo il coperchio sott'acqua nella teglia WASH.
   7. Sciacquare brevemente i vetrini immergendoli nel piatto PBS. Asciugare i vetrini con aria compressa. Conservare al buio in una scatola di scorrimento fino a quando non è pronto per la scansione.
4. Scansione del vetrino microarray
   1. Eseguire la scansione del chip utilizzando lo scanner microarray (fare riferimento a Table of Materials) con l'eccitazione di 495 nm e l'emissione di 519 nm e raccogliere l'intensità mediana di fluorescenza.

3. Analisi dei dati microarray

NOTA: tutta l'elaborazione dei dati è stata eseguita utilizzando script scritti personalizzati in MATLAB.

1. Eseguire l'elaborazione iniziale dei dati PBM utilizzando il valore p del test della somma di classificazione Wilcoxon come descritto in precedenza⁴.
2. Utilizzare il valore mediano dell'intensità di legame per ogni sequenza di DNA per ulteriori analisi.
3. Successivamente, utilizzando i valori p ANOVA unidirezionali, confrontare la significatività statistica delle differenze osservate nelle intensità di legame primase-DNA ottenute per diversi gruppi di sonde di DNA, come spiegato in precedenza nella sezione³di progettazione della libreria del DNA .

4. Sintesi dell'RNA mirata a modelli catalizzata da primati del DNA T7

1. Preparazione del gel di denaclamide denatura
   1. Per preparare 100 mL di miscela di gel, unire 62,5 mL del 40% di acrilammide-bisacrismide (19:1), 42 g di urea, 1,1 g di base di Tris (2-Amino-2-(idrossimethyl)-1,3-propdiolo), 0,55 g di acido borico e 0,4 mL di 0,5 M di acidi etilenediamineditraace (EDTA) soluzione.
   2. Dividere la miscela in 14 mLs (la quantità necessaria per un gel aliquota di 16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm) e tenerli protetti dalla luce a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.
   3. Per preparare un gel di denacritiforo poliacrilamide, aggiungere 4 -L di TEMED e 40 -L di 10% w/v persulfato di ammonio a 14 mL della miscela precedentemente preparata, lanciarla e lasciarla polimerizzare per almeno 2 h a RT. Il gel può essere conservato per un giorno a 4 gradi centigradi.
2. Preparazione del campione
   NOTA: Tenere i reagenti, la miscela di reazione e i campioni sul ghiaccio.
   1. Per preparare la miscela di reazione necessaria per dieci reazioni combinare 11 luna di 5x buffer di attività (200 mMM Tris-HCl, pH - 7,5; 50 mM dithiothreitol, 250 miamo di glutammato di potassio, 50 mM MgCl₂), 5,5 di 2,5 mm di miscela di nucleo tritide-fosfato (NTP) e 5,5 di ribonucleotide radioetichettato [ad es. ATP, (z-32P) 3000 Ci/mmol].
      NOTA: tutti gli importi sono stati aumentati del 10% a causa di possibili errori di pipettaggio. I ribonucleotidi radioetichettati devono essere diluiti in base alla potenza del segnale radioattivo (la diluizione iniziale è di solito 1:10 o più).
   2. Trasferire 2 Ll della miscela di reazione a dieci tubi PCR.
   3. Aggiungere il modello di DNA a 100 M al tubo PCR corrispondente e ruotare verso il basso.
   4. Aggiungete 2 -L di 16M: T7 dna primase, girate verso il basso, mescolate delicatamente e girate di nuovo verso il basso.
   5. Incubare la reazione a RT per 20 min.
   6. Fermare la reazione aggiungendo 5 L di soluzione di spegnimento (95% formamide, 20 mM EDTA, 0,05% w/v xilene cyanol e blu bromofenolo), mescolare e girare verso il basso.
3. Separazione dei prodotti RNA mediante elettroforesi attraverso il gel di denaclammide disfacilmide e il successivo rilevamento del segnale
   1. Pre-eseguire il gel per 1 h (10 mA, 600 V) in 1x tampone TBE (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA).
   2. Caricare fino a 2 l di ogni campione ed eseguire l'elettroforesi (20 mA, 1100 V) in 1x tampone TBE (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA).
   3. Asciugare il gel per 2 h a 80 gradi sotto vuoto.
   4. Esporre la piastra di imaging del fosforo in gel radioattivo per alcune ore durante la notte, a seconda della forza del segnale radioattivo.
   5. Registrare il segnale (luminescenza fotostimolata) utilizzando il fosforoimmagine (vedere Tabella dei materiali).

Risultati

Questo progresso tecnologico per la mappatura dei siti di legame dei primasi permette l'ottenimento di proprietà leganti dna difficili, se non impossibili, da osservare utilizzando strumenti classici. Ancora più importante, HTPP consente di rivisitare la comprensione tradizionale dei siti di legame primasei. In particolare, L'HTPP rivela specificità vincolanti oltre alle note sequenze di riconoscimento 5'-GTC-3', che portano a cambiamenti nelle attività funzionali del primato del DNA ...

Discussione

Il metodo PBM è stato ampiamente utilizzato per studiare le proprietà di legame dei fattori di trascrizione e può essere applicato anche agli enzimi di elaborazione del DNA, come il primato del DNA, che si legano al DNA con bassa affinità. Tuttavia, sono necessarie alcune modifiche delle procedure sperimentali. L'esperimento di microarray prevede diversi passaggi: progettazione della libreria del DNA, preparazione del chip, legame del bersaglio proteico, etichettatura fluorescente e scansione. Le lievi fasi di lavagg...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution	Merck	1006401000
95% formamide	Sigma-Aldrich	F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody	Qiagen	35310
Ammonuium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol	Perkin Elmer	NEG003H250UC
Boric acid, granular	Glentham Life Sciences	GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA)	Roche	10735094001
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-25G
DNA microarray	Agilent		4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Acros Organics	AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager	FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack	Thermo Scientific	12869995	If several slides are used
Lab rotator	Thermo Scientific	88880025
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	63064-500G
Microarray Hybridization Chamber	Agilent	G2534A	https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A)	Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Potassium glutamate	Alfa Aesar	A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)	New England BioLabs	N0466S
Salmon testes DNA	Sigma-Aldrich	D1626-1G
Skim milk powder	Sigma-Aldrich	70166-500G
Staining dish	Thermo Scientific	12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-Rad	1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma-Aldrich	93362-500G
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
Urea	Sigma-Aldrich	U6504-1KG
Xylene cyanol	Alfa Aesar	B21530