Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

Özet

Protein bağlayıcı mikrodizi (PBM) deneyleri biyokimyasal tahlillerle birleşince, şablon DNA üzerinde RNA astarlarını sentezleyen bir enzim olan DNA primazının bağlayıcı ve katalitik özelliklerini birbirine bağlar. Yüksek iş itrifli primase profilleme (HTPP) olarak tanımlanan bu yöntem, çeşitli enzimlerin DNA bağlayıcı desenlerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Özet

DNA primazı, DNA replikasyonu sırasında DNA polimeraz tarafından gecikmeli iplikçikteki Okazaki parçalarının DNA sentezini başlatan kısa RNA astarları sentezler. Prokaryotik DnaG benzeri primazların DNA'ya bağlanması belirli bir trinükleotid tanıma dizisinde gerçekleşir. Okazaki parçalarının oluşumunda önemli bir adımdır. DNA primazlarının DNA tanıma dizilimini belirlemek için kullanılan konvansiyonel biyokimyasal araçlar sadece sınırlı bilgi sağlar. Yüksek iş gücü mikrodizi tabanlı bağlayıcı test ve ardışık biyokimyasal analizler kullanılarak, 1) spesifik bağlayıcı bağlamın (tanıma alanının yan dizileri) DNA primazının şablonuna bağlanma gücünü etkilediği gösterilmiştir. DNA, ve 2) DNA primase daha güçlü bağlanması daha uzun RNA astarları verir, enzimin daha yüksek prosesini gösterir. Bu yöntem PBM ve primaz aktivite testi birleştirir ve yüksek iş itfa primase profilleme (HTPP) olarak belirlenmiş ve dna primaz tarafından benzeri görülmemiş zaman ve ölçeklenebilirlik belirli dizi tanıma karakterizasyonu sağlar.

Giriş

HTPP, DNA primazının enzimatik aktivitesini etkileyen DNA şablonlarının belirli özelliklerini istatistiksel olarak belirlemek için biyokimyasal analizle birlikte DNA bağlayıcı mikrodizi teknolojisini(Şekil 1)kullanır. Bu nedenle HTPP, bu alanda bilgi sıçramasını kolaylaştıran teknolojik bir platform sağlamaktadır. Primaz tanıma sitelerini belirlemek için kullanılan klasik araçlar büyük miktarda veri verme yeteneğine sahip değildir, oysa HTPP bunu yapar.

PBM, transkripsiyon faktörlerinin DNA^1,2'yebağlanma tercihlerini belirlemek için rutin olarak kullanılan bir tekniktir; ancak proteinlerin DNA'ya zayıf/geçici bağlanmasının saptanması için uygun değildir. Sekiz baz çiftinden oluşan tüm olası dizilere ortalama protein bağlama özgüllüğü hakkında bilgi sağlayan evrensel PBM'nin aksine, HTPP benzersiz dizi öğelerinden oluşan tek iplikli DNA şablonlarının kitaplığına dayanır. Bu tür DNA dizisi elemanları on binlerce kısa (birkaç on bp) genomik dizinin yanı sıra genomda bulunan ve farklı ortalama GC içeriğine sahip olan bazı DNA tekrarlayan dizi elementlerinde zenginleştirilmiş hesaplamalı olarak tasarlanmış DNA dizilerini içerir. . Böyle bir yüksek iş ilişkisi yaklaşımı, sistematik, nicel ve hipotez odaklı bir şekilde, ilkel bağlama ve enzimatik aktivitesi için önemli olan diziile ilgili özelliklerin belirlenmesine olanak sağlar³. Özellikle, primase-DNA bağlama tercihleri arasındaki önemli bağlantı, (spesifik üç nükleotit bağlama siteleri çevreleyen DNA dizileri tarafından modüle) ve primase prosesivite bu enzimatik sistem için tespit edilmiştir⁴.

Yeni teknoloji kapsamlı 5^{çalışılmıştır}T7 DNA primase için bile primase tanıma siteleri anlayışımızı yeniden ziyaret etmek için uygulanmıştır. Özellikle, t7 DNA primase DNA tanıma siteleri gibi klasik kavramların yeniden incelenmesi (yaklaşık 40 yıl önce tespit edildi ⁶) protein-DNA bağlayıcı mikrodizi (PBM) ile ilgili özellikleri daha önce görülmemiş bir anlayış yol açmıştır bu tanıma sitelerinin yan sırası³. T7 DNA primazının (5'-GTC-3') üç nükleotid tanıma bölgesini çevreleyen sekansların rastgele olması beklenmektedir. Bunun yerine, TG açısından zengin yan dizilerin T7 DNA primazının daha uzun RNA astarlarını sentezleme şansını artırdığını ve proseste bir artış olduğunu gördük.

Proteinlerin DNA bağlayıcı özelliklerini in vitro incelemek için kullanılabilecek diğer yöntemler arasında elektroforetik hareketlilik değişim testi (EMSA)⁷, DNase I ayak izi⁸, yüzey plazmon rezonans (SPR)⁹ve Güneybatı blotting ¹⁰. Ancak bunlar, düşük iş verme yöntemleridir, sadece az sayıda DNA dizisinin araştırılması için geçerlidir. Buna ek olarak, bu tekniklerden bazılarının (örneğin, EMSA) hassasiyeti ve hassasiyeti düşüktür. Diğer taraftan, in vitro selection^11, PBM'ye benzer şekilde, çok sayıda bağlama dizisinin tanımlanmasında kullanılabilecek bir tekniktir. Ancak, düşük yakınlık dizileri genellikle in vitro seçimi nin çoğu uygulamasında dışlanır; bu nedenle, bu yaklaşım tüm kullanılabilir diziler için karşılaştırmalı bağlama verileri elde etmek için uygun değildir. Evrensel PBM^1,2 esas olarak prokaryotlar ve ökaryotlar dan transkripsiyon faktörlerin bağlayıcı özellikleri yanı sıra belirli faktörler (örneğin, bazı ligands varlığı, kofactors, vb) karakterize etmek için kullanılır bu etkileşimi etkiler¹².

HTPP, ciltleme sırası bağlamı hakkında bilgi sağlamak için eşi görülmemiş yüksek iş letiye istatistiksel gücü yüksek hassasiyetle birleştirerek PBM uygulamasını DNA işleme enzimlerine genişletir. Bu tür veriler, mevcut diğer tekniklerin yukarıda belirtilen teknik sınırlamaları nedeniyle primases ve ilgili enzimler (DNA'ya zayıf/geçici bağlayıcılığı olan) için henüz elde edilmemiştir.

Protokol

1. Mikrodizi tasarımı

NOT: DNA probları, iki değişken yan bölge arasında yer alan T7 DNA primazının (GTC) tanıma bölgesinden oluşan özel 36 nükleotit dizilerini temsil eder ve ardından cam bir^slayt3'ebağlı sabit 24 nükleotit dizisi bulunur. 4 x 180.000 mikrodizi formatı kullandık, bu da her DNA dizisinin altı kopyada tespit ini sağladı, slaytta rastgele dağıtıldı.

1. Bilinen tanıma dizilerine sahip primases için DNA kitaplığı tasarımı
   1. Her dizinin 60 nükleotitten oluştuğundan emin olun. İlk 24 nükleotiti sabit tutun (cam kaydıraä a bayılacak). Değişken bölgeler aşağıdaki genel forma sahip olmalıdır: (N)₁₆GTC(N)_17; N istenilen nükleotiti temsil eder.
   2. Belirli bir bilimsel soruyu ele alacak şekilde yan bölgeyi tasarlayın (tasarımın bir örneği aşağıdaki metinde sunulmuştur). Yan bölgeler, yinelenen öğeler veya belirli simetri gibi belirli özellikleri içerecek şekilde tasarlanabilir.
      NOT: İki veya üç spesifik nükleotitten oluşan farklı yan dizilerden oluşan sekiz kategori oluşturduk: T ve G (grup 1); T ve C (grup 2); C ve A (grup 3); A ve G (grup 4); G, C ve T (grup 5); C, T ve A (grup 6); G, A ve T (grup 7); G, A ve C (grup 8). Her grup için 2.000 farklı dizi tasarlandı. Her grup farklı türleri ve dizi tekrarları farklı sayılarda diziler alt grupları vardı.
   3. Negatif kontrol dizileri kümesi (belirli bağlama sitesi eksik)⁴. Bu tür dizilerin varlığı, deneyde belirli bağlamanın oluşumunu doğrulamaya olanak tanır.
2. Bilinmeyen tanıma dizileri ile primases için DNA kitaplığı Tasarımı
   1. Tanıma sırası bilinmiyorsa, istenilen organizmanın (bakteri, mantar, vb.) genomundan dizileri (daha önce bahsedilen belirli özelliklere sahip olsun veya olmasın) seçerek DNA kitaplığını oluşturun.
3. Mikrodizi slayt tasarımı
   1. Ticari bir tedarikçiden özel slaytlar (örn. 4x180K, AMADID #78366) satın alın (daha fazla ayrıntı için Bkz. Malzemeler Tablosu). Her çoğaltmanın slaytta rasgele seçilmiş bir noktaya eklenmesi gereken altı çoğaltma halinde her sırayı sırala.

2. Primaz DNA bağlama deneyi

NOT: PBM'den bir gün önce (veya en az 2 saat önce) bloke çözeltisini hazırlayın [fosfat tamponsal salininde %2 w/v yağsız süt (PBS)] ve manyetik karıştırıcı üzerinde karıştırın. Kullanmadan önce, çözeltiyi 0,45 μM filtre ile filtreleyin. DNA iplikçiklerine bağlanan primase bağlanmayı saptamak için aşağıdaki sırada birkaç adım yapılmalıdır.

1. Engelleme yordamı
   1. PBS'de %0,01 v/v Triton X-100 ile Coplin kavanozundaki mikrodizi slaytını önceden ıslayın (laboratuvar rotatöründe 125 rpm'de 5 dk).
   2. Conta kaydırasını (coverslip olarak da adlandırılır) su ve etanol ile kısa bir süre yıkayın ve basınçlı hava kullanarak kurulayın.
   3. Çelik hibridizasyon odasının (PBM odası) alt kısmını conta kaydırağı yukarı bakacak şekilde monte edin (ticari etiket yukarı bakacak şekilde). Montajla ilgili daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu'nabakın.
   4. Pipet blokaj çözeltisi (%2 w/v skim süt PBS) her odaya.
   5. Coplin kavanozundaki mikrodizi slaytını çıkarın, ardından DNA olmayan tarafı kurulayın (DNA şirket etiketiyle aynı tarafta olmalıdır) ve ince bir silme kullanarak kenarlar. Mikrodiziyi yavaşça conta kaydırağına yerleştirin, kabarcıklardan kaçının (şirket etiketi aşağı bakacak şekilde). Hemen monte ve çelik hibridizasyon odası cihazları sıkın. Oda sıcaklığında 1 saat (RT) için kuluçka.
   6. 800 mL taze PBS ile bir boyama kabını ("PBS" çanak) doldurun. PBS'de ikinci bir boyama kabını ("WASH" çanak) 800 mL taze hazırlanmış %0,5 v/v Tween-20 ile doldurun.
   7. PBM odasını sökün ve mührü kırmamaya dikkat edin, mikrodizili slayt kapaklı "sandviçi" çıkarın. Slide ve coverslip arasına forceps yerleştirerek WASH çanak su altında sökmek.
   8. Su altında mikrodizi slayt çalkalayın ve hızlı bir Coplin kavanoza aktarın.
   9. PBS'de %0,1 v/v Tween-20 ile bir kez yıkayın (laboratuvar rotatöründe 125 rpm'de 5 dk).
   10. PBS'de %0,01 v/v Triton X-100 ile bir kez yıkayın (laboratuvar rotatöründe 125 rpm'de 2 dk).
   11. Kaydırağı hızlıca PBS içeren bir Coplin kavanozuna aktarın.
2. Protein bağlanması
   1. PBM odasını daha önce açıklandığı gibi birleştirin (adım 2.1.2-2.1.3).
   2. 5 μM T7 DNA primaz içeren pipet protein bağlayıcı karışımı, 30 mM Tris-HCl pH 7.5, 6.5 mM MgCl_2,30 mM K-glutamat, 6 mM dithiothreitol (DTT), 65 μM ribonükleozit trifosfat (rNTP), %2 w/v yağsız süt, 100 ng/μL büyükbaş serum albumin (BSA), 50 ng/μL somon DNA testisleri ve 0.02% v / v Triton X-100 (TX-100) conta slayt her odasına (kauçuk kenarlarıdokunmadan ve kabarcıklar tanıtmadan).
   3. Mikrodizikızmasını pbs kabına batırarak kısa bir süre durulayın, bu da fazla deterjanı slaytların yüzeyinden temizler. Slaytın DNA olmayan yüzeylerini ince bir silme ile silin.
   4. Bir odadan diğerine sızıntıyı önlemek için dikkatli olmak için, yavaş yavaş conta slayt üzerine mikrodizi slayt (aşağı bakan) indirin. Kabarcıkları tanıtmadan PBM oda cihazlarını hemen monte edin ve sıkın. Kabarcıklar oluşursa, çelik hazneye sert bir yüzeye hafifçe dokunarak çıkarılabilirler.
   5. Oda sıcaklığında 30 dakika (RT) kuluçka.
3. Floresan antikor eki
   1. PBM odasını sökün ve mührü kırmamaya dikkat edin, mikrodizili slayt kapaklı "sandviçi" çıkarın. Wash kabında forceps kullanarak su altında sökülür. Su altında kaydırağı çalkalayın ve hızlı bir şekilde PBS içeren bir Coplin kavanoza aktarın.
   2. PBM odasını daha önce açıklandığı gibi conta kaydırağı yla birleştirin (2.1.2-2.1.3. adım).
   3. Alexa 488 konjuge antikor (bağlayıcı tampon 10 ng / μL) conta slayt ekleyin.
   4. Daha önce olduğu gibi PBS çanak daldırma tarafından slayt kısa bir süre durulayın, sonra yavaş yavaş PBS slayt kaldırmak, DNA olmayan yüzeyi silin ve conta slayt üzerine bakan aşağı yerleştirin.
   5. Foto-beyazlatma azaltmak için karanlıkta RT 30 dakika kuluçka (floresan prob ışığa duyarlıdır).
   6. Wash çanak içinde su altında coverslip kaldırarak, PBM odası ve coverslip daha önce olduğu gibi sökmek.
   7. Slaytları PBS kabına batırarak kısa bir süre durulayın. Slaytları basınçlı hava ile kurulayın. Tçalışmaya hazır olana kadar bir slayt kutusunda karanlıkta saklayın.
4. Mikrodizi slaytını taramak
   1. 495 nm uyarma ve 519 nm emisyon ile mikrodizi tarayıcı (Malzeme Tablosubakın) kullanarak çip tarayın ve medyan floresan yoğunluğu toplamak.

3. Mikrodizi veri analizi

NOT: Tüm veri işleme MATLAB özel yazılı komut dosyaları kullanılarak yapıldı.

1. Wilcoxon sıralama toplamı test p-değeri kullanarak ilk PBM veri işleme gerçekleştirin daha önce açıklandığı gibi⁴.
2. Daha fazla analiz için her DNA dizisi için bağlayıcı yoğunluğun ortanca değerini kullanın.
3. Daha sonra, tek yönlü ANOVA p-değerleri kullanarak, dna kütüphane tasarım bölümünde yukarıda açıklandığı gibi, DNA sondaları farklı gruplar için elde edilen primase-DNA bağlayıcı yoğunlukları gözlenen farklılıklarıistatistiksel önemi karşılaştırın³.

4. T7 DNA primazı ile katalize edilen şablon ait RNA sentezi

1. Denaturing poliakrilamid jel hazırlanması
   1. 100 mL jel karışımı hazırlamak için, 62.5 mL%40 akrilamid-bisacrylamid (19:1), 42 g üre, 1.1 g Tris baz (2-Amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propanediol), 0.55 g borik asit ve 0.4 mL 0.5 M etilediaminemineetik asit (EDTA çözeltisi) birleştirir.
   2. Karışımı 14 mL aliquots (16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm bir jel için gerekli miktar) bölün ve 1 aya kadar 4 °C ışıktan korunun.
   3. Bir denaturing poliakrilamid jel hazırlamak için, 4 μL TEMED ve 40 μL 10% w / v amonyum persülfat 14 mL önceden hazırlanmış karışımı ekleyin, döküm ve RT en az 2 saat polimerize bırakmak. Jel 4 °C'de bir gün saklanabilir.
2. Numune hazırlama
   NOT: Reaktifleri, reaksiyon karışımını ve numuneleri buz üzerinde tutun.
   1. On reaksiyon için gerekli reaksiyon karışımını hazırlamak için 11 μL 5x aktivite tamponu (200 mM Tris-HCl, pH = 7.5; 50 mM dithiothreitol, 250 mM potasyum glutamat, 50 mM MgCl₂), 5.5 μL nükleotit tri-fosfat (NTPs) ve 5.5l radiolabeled ribonnucleottide [örneğin, ATP, (α-32P) 3000 Ci/mmol].
      NOT: Tüm miktarlar, olası pipetleme hataları nedeniyle %10 artırılmıştır. Radyoetiketli ribonükleotidler radyoaktif sinyalin gücüne göre seyreltilmelidir (ilk seyreltme genellikle 1:10 veya daha fazladır).
   2. Reaksiyon karışımının 2 μL'sini on PCR tüpüne aktarın.
   3. İlgili PCR tüpüne 1 μL 100 μM DNA şablonu ekleyin ve aşağı doğru döndürün.
   4. 2 μL 16 μM T7 DNA primaz ekleyin, aşağı spin, yavaşça karıştırın ve tekrar aşağı spin.
   5. 20 dakika RT'de reaksiyon uyguluyor.
   6. 5 μL'lik söndürme çözeltisi (%95 formamid, 20 mM EDTA, %0,05 w/v ksilen cyanol ve bromofenol mavisi) ekleyerek reaksiyonu durdurun ve aşağı doğru döndürün.
3. RNA ürünlerinin elektroforez ile poliakrilamid jelden ayrılması ve müteakip sinyal tespiti
   1. Jeli 1 saat (10 mA, 600 V) 1x TBE tampon (90 mM Tris-borat, 2 mM EDTA) için önceden çalıştırın.
   2. Her numunenin 2 μL'ine kadar yükleyin ve 1x TBE tamponunda (90 mM Tris-borat, 2 mM EDTA) elektroforez (20 mA, 1100 V) gerçekleştirin.
   3. Jeli 80 °C'de 2 saat vakum altında kurutun.
   4. Fosfor görüntüleme plakasını, radyoaktif sinyalin gücüne bağlı olarak birkaç saat boyunca bir gece boyunca radyoaktif jele maruz bırakın.
   5. Fosforimager kullanarak sinyali (fotouyarılmış parlaklık) kaydedin (bkz. Malzeme Tablosu).

Sonuçlar

Primase bağlama alanlarının haritalanmasındaki bu teknolojik ilerleme, klasik aletler kullanılarak gözlemlemek imkansız olmasa da, zor olan DNA bağlama özelliklerinin elde edilmesine olanak sağlar. Daha da önemlisi, HTPP primase bağlayıcı sitelerin geleneksel anlayış yeniden ziyaret sağlar. Özellikle HTPP, bilinen 5'-GTC-3 tanıma dizilerine ek olarak bağlayıcı özellikleri ortaya çıkarır ve bu da T7 DNA primazının fonksiyonel aktivitelerinde değişikliklere yol...

Tartışmalar

PBM yöntemi transkripsiyon faktörlerinin bağlayıcı özelliklerini araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır ve düşük afinite ile DNA'ya bağlanan DNA primazgibi DNA işleme enzimlerine de uygulanabilir. Ancak, deneysel prosedürlerin bazı değişiklikler gereklidir. Mikrodizi deneyi birkaç adım içerir: DNA kütüphanesinin tasarımı, çipin hazırlanması, protein hedefinin bağlanması, floresan etiketleme ve tarama. Deterjan içeren solüsyonlar ile uzun yıkamalar zayıf/geçici bağlanma modu ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution	Merck	1006401000
95% formamide	Sigma-Aldrich	F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody	Qiagen	35310
Ammonuium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol	Perkin Elmer	NEG003H250UC
Boric acid, granular	Glentham Life Sciences	GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA)	Roche	10735094001
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-25G
DNA microarray	Agilent		4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Acros Organics	AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager	FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack	Thermo Scientific	12869995	If several slides are used
Lab rotator	Thermo Scientific	88880025
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	63064-500G
Microarray Hybridization Chamber	Agilent	G2534A	https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A)	Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Potassium glutamate	Alfa Aesar	A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)	New England BioLabs	N0466S
Salmon testes DNA	Sigma-Aldrich	D1626-1G
Skim milk powder	Sigma-Aldrich	70166-500G
Staining dish	Thermo Scientific	12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Bio-Rad	1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)	Sigma-Aldrich	93362-500G
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
Urea	Sigma-Aldrich	U6504-1KG
Xylene cyanol	Alfa Aesar	B21530