שימוש בעלי כניסה ויראלי וניתוח עגינה מולקולרית לזיהוי מועמדים אנטי-ויראליים A16

Summary

מטרת הפרוטוקול היא להמחיש את הנושא השונה המתייחס לערך ויראלי שניתן להשתמש בו כדי לזהות מעכבי כניסה ויראלית של מועמד.

Abstract

אנטי וירוס מספר כי המכונה לבחון כניסה ויראלית הם רלוונטיים להבחין באיזה שלב הסוכנים העריכו הם יעילים ביותר, ולאפשר זיהוי של מועמד ויראלי כניסה מעכבי. כאן, אנו מציגים את הגישות הנסיוניות לזיהוי מולקולות קטנות המסוגל לחסום את הזיהום על ידי וירוס שאינו עטוף A16 (CVA16) דרך המיקוד חלקיקי וירוס או צעדים ספציפיים בכניסה ויראלי מוקדם. Assays כולל ניתוח זמן של תרופות בתוספת התרופה, שיטת הכריכה המבוססת על הזרמת cy, ושיטת הפעלה ויראלית. אנו גם להציג פרוטוקול עגינה מולקולרית ניצול וירוס מקפיסיד חלבונים כדי לנבא שאריות פוטנציאליים ממוקדות על ידי תרכובות אנטי ויראליות. מספר זה אמור לסייע בזיהוי של סוכני אנטי וירוס מועמדים הפועלים על כניסה ויראלית. כיוונים עתידיים יכולים לחקור את המעכבי האפשריות לפיתוח סמים נוסף.

Introduction

יד, כף הרגל, ומחלת הפה (hfmd) היא מחלה הנגרמת בדרך כלל על ידי הנגיף A16 (CVA16) ו מעיים 71 (EV71) אצל ילדים צעירים. לאחרונה מעבר לאזור אסיה-פסיפיק, הייתה הפיכה משמעותית של HFMD המושרה ב-CVA16. בעוד הסימפטומים יכולים להיות מתון, סיבוכים חמורים יכולים להתרחש המשפיעים על המוח והלב, עם הרוגים פוטנציאליים^1,2. כיום, אין טיפולים אנטי ויראליים מורשה או חיסונים זמינים עבור CVA16, ולכן יש צורך דחוף לפתח אסטרטגיות אנטי ויראליות כדי לרסן התפרצויות עתידיות ואת הסיבוכים הקשורים.

CVA16 הוא וירוס שאינו עטוף אשר מורכב capsaמישור המורכב מפנטאמרס כי כל אחד מכיל 4 חלבונים מבניים כלומר VP1, VP2, VP3, ו VP4. המקיף כל ציר חמש מתקפל בפנטעאמר הוא אזור ' קניון ' המראה כדיכאון והוא מציין את תפקידה בכריכת הקולטן³. בחלק התחתון של הקניון הזה נמצא כיס הידרופובי באזור VP1 המכיל ליגוגיה שומני טבעי, ספיגוסינוס (SPH). קולטנים סלולריים, כגון האדם P בסלטין גליקופרוטאין ליגנד 1 (psgl-1) ו מחלקת הקולטן הנבלות חבר B 2 (SCARB2), הוצעו לשחק תפקיד בכריכה ויראלית על ידי העברת ליגאס זה והתוצאות שינויים בקונפורמה לקפיסידה וה הוצאה בעקבות הגנום הנגיפי לתוך התא המארח^4,5,6. זיהוי מעכבי אפשריים החוסמים את האירועים הרצופים בתהליך הכניסה הנגיפי יכול לספק אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות נגד זיהום CVA16.

ניתן לגזור את השלבים במחזור החיים של הווירוס באמצעות גישות נסיוניות כמטרות כדי לסייע בזיהוי סוכני אנטי-וירוס ספציפיים למצב. ניתוח של זמן של סמים בנוסף בוחן את האפקט של טיפול בסמים בתקופות שונות במהלך הזיהום הנגיפי, כולל טרום כניסה (הוסיף לפני זיהום וירוס), כניסה (הוסיף במקביל לזיהום וירוס), ולאחר הזנה (נוסף בעקבות זיהום וירוס)⁷. ההשפעה יכולה להיות מוערך באמצעות בדיקת רובד סטנדרטי על ידי כימות הפלאק ויראלי שנוצרו בכל תנאי הטיפול. הזרימה של שיטת הכריכה הנגיפית המבוססת על cy, קובעת אם הסם מונע החזקה ויראלית לתאים מארחים. זה מושגת על ידי העברת הטמפרטורה מ 37 ° c, שבו רוב של זיהומים הנגיף האנושי להתרחש, עד 4 ° c, שם הריטונים מסוגלים לאגד את משטח התא מארח אך אינם יכולים להיכנס לתאים⁷. התא חלקיקי קרום וירוס מאוגד הם לאחר מכן כימות באמצעות מכתים חיסוני נגד אנטיגנים ויראלי המוערך על ידי cy, לנסות הזרימה. הבדיקה הנגיפית של ההפעלה מצד שני מסייעת להעריך את האינטראקציות הפיזיות הפוטנציאליות של התרופה עם חלקיקי וירוס בחינם, להגן או לנטרל את הריטונים, או לגרום לצבירות או ליצירת שינויים שיגרמו להם להפוך לבלתי פעילים עבור אינטראקציות עוקבות עם משטח התא של המחשב המארח במהלך ההדבקה^8,9. בניסוי זה, מותר הנגיף הנגיפי הראשון לדגירה עם התרופה לפני היותו מדולל כדי נכייל את התרופה לפני הדבקה של התא המארח מונרוייר וביצוע שיטת הפלאק סטנדרטי⁸. לבסוף, עגינה מולקולרית הוא כלי רב עוצמה כדי לנבא את האתרים הפוטנציאליים אינטראקציה הסמים על פני השטח והריאון, כולל גליקורופנים נגיפי מפני וירוסים עטופים והחלבונים capsid ויראלי מווירוסים שאינם עטופים, באמצעות חישובים אלגוריתמים. זה עוזר לספק מטרות באופן מדויק של מצב התרופה של הפעולה ומספקים מידע שימושי שיכול להיות מאומת נוסף על ידי במורד הזרם.

לאחרונה העסקנו את השיטות המתוארות לעיל כדי לזהות תרכובות אנטי ויראליות שחסמו ביעילות את הזיהום על ידי CVA16⁹שאינם עטופים. להלן, הפרוטוקולים המפורטים ששימשו לשימוש מתוארים ודנים.

Protocol

הערה: כל תרבות התא וזיהומים וירוס חייב להתבצע בקולטי בטיחות מוסמכים המתאימים לרמת הבטיחות ביולוגית של הדגימות המטופלות. שני tannin מחלקה של חומצה מולקולות chebulagic קטנה (CHLA) ו punic, כי נצפו ביעילות לחסום CVA16 זיהום⁹, משמשים כדוגמאות של סוכני מעכבות המועמדים. עבור עקרונות בסיסיים בטכניקות וירולוגיה, הפצת וירוסים, קביעת titer וירוס, ומושגים של יחידות יצירת פלאק (PFU) או ריבוי של זיהום (מוי), הקורא הוא התייחסות¹⁰.

1. תרבות התא, הכנת וירוס, הכנה מורכבת, ורעילות מורכבת

1. בתאי השרירים האנושיים (RD) הם תאים מארחים מתירני לזיהום CVA16¹¹. לגדל את התאים RD ב 10 מ ל של מדיום שונה של הנשר של דולבקה (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי (FBS), 200 U/mL פניצילין G, 200 μg/mL סטרפטומיצין, ו 0.5 μg/mL אמפוריטיצין B ב-T-75 מבחנות ב 37 ° c ב 5% ושות₂
2. הכן CVA16 על ידי הפצת הווירוס בתאי RD ולקבוע סיכוייו נגיפי ב pfu/mL. עבור פרוטוקול ממוטב, עיין בהפניה¹¹.
3. הכינו את תרכובות הבדיקה ואת הבקרות באמצעות ממיסים שלהם: למשל, לפזר CHLA ו פוג ב diמתיל סולפוקסיד (DMSO). עבור כל שלבי ההדבקה, המדיום הבזלי היה מורכב DMEM ועוד 2% FBS ו אנטיביוטיקה.
   הערה: הריכוז הסופי של DMSO בטיפולים מורכבים שווה או מתחת 0.25% בניסויים; 0.25% DMSO כלול כטיפול בשליטה שלילית באספרא להשוואה.
4. לבצע את השימוש הרעילות ציטובית של תרכובות הבדיקה על התאים הRD באמצעות הכדאיות תא לקביעת מגיב כגון XTT (2, 3-bis [2-מתיונין-4-ניטרו-5-sulfophenyl] -5-פנילאמינו)-2H-טטרזויום הידרוקסיד). לפרוטוקול מפורט, אנא התייחס להפניה¹². קבע את ריכוזי הרעלים של תרכובות הבדיקה באמצעות תוכנה אנליטית כגון מנסרה גראפד על פי פרוטוקול היצרן. ריכוזי סמים שאינם משפיעים באופן משמעותי על הכדאיות התאית (≥ 95% תאים בעלי יכולת) משמשים לשארית המחקר.

2. זמן התרופה-שיטת החיבור

1. כדי להעריך את השפעת התרופות על תאים מארחים לפני זיהום נגיפי (טיפול מקדים)
   1. התאים זרעים RD ב 12-לוחות היטב בצפיפות הזריעה של 2 x 10⁵ תאים/טוב. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c בחממה בעלת 5%₂ לקבלת מונאולייר.
   2. לטפל בתאי RD עם תרכובות מבחן בריכוזים שאינם ציטוטוקסיים (נקבע משלב 1.4) ב 1 מ ל של נפח מדיה בסיס עבור 1 h או 4 h.
   3. לשטוף את התאים עם 1-2 mL של PBS לפני הוספת 50 PFU/טוב של וירוס בינוני בסיס (הנפח הסופי של האיתרשת הוא 300 μL) עבור 1 h. רוק את הצלחת כל 15 דקות.
   4. בעקבות הזיהום, לשטוף את monolayers שוב באמצעות PBS, ואז שכבת עם 1 mL של מדיה בסיס המכיל 0.8% מתילתאית לדגירה נוספת ב 37 ° צ' ב 5% CO₂ חממה.
   5. לאחר 72 h של דגירה, להסיר את התקשורת שכבת-על ולשטוף את הבארות באמצעות 2 מ"ל של PBS.
   6. תקן את הבארות באמצעות 0.5 mL של 37% פורמלדהיד עבור 15 דקות.
   7. הסר את הסופרנטנט ושטוף שוב באמצעות ה-PBS.
   8. הכתם את הבארות באמצעות 0.5 mL של 0.5% קריסטל הפתרון הסגול. ואז להסיר את הפתרון הכתם בתוך 2 דקות ולשטוף את הבארות עם זרם עדין של מים לפני ייבוש האוויר.
   9. לספור את הפלאק ויראלי על ידי הצבת צלחת על תיבת אור לבן. חישוב האחוז (%) CVA16 זיהום כדלקמן: (מתכוון של _{וירוס פלאק + תרופה} /ממוצע של _{וירוס פלאק + dmso שליטה}) × 100%.
2. כדי להעריך את ההשפעה של הוספת התרופות והווירוס בו (תוספת משותפת)
   1. התאים זרעים RD ב 12-לוחות היטב בצפיפות הזריעה של 2 x 10⁵ תאים/טוב. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c בחממה בעלת 5%₂ לקבלת מונאולייר.
   2. לטפל בתאי RD עם תרכובות המבחן בריכוזים המתאימים ו-50 PFU/טוב של CVA16 (הנפח הסופי של האינות1 הוא 300 μL) בו עבור 1 h. רוק את הצלחת כל 15 דקות.
   3. לשטוף תאים עם 1 מ ל של PBS ולאחר מכן כיסוי עם 1-2 mL של המדיה הבזליים המכיל 0.8% מתילתאית לדגירה נוספת ב 37 ° c ב 5% שיתוף חממה₂ .
   4. כתם נגיפי שלטים עם גביש סגול לאחר 72 h לאחר ההדבקה ולקבוע את הזיהום% CVA16 כפי שמתואר לעיל.
3. להערכת אפקט טיפול בסמים לאחר הזנה ויראלית (לאחר ההדבקה)
   1. התאים זרעים RD ב 12-לוחות היטב בצפיפות הזריעה של 2 x 10⁵ תאים/טוב. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c בחממה בעלת 5%₂ לקבלת מונאולייר.
   2. איחסן את התאים RD עם 50 PFU/באר של CVA16 (הנפח הסופי של האינות1 הוא 300 μL) עבור 1 h. רוק את הצלחת כל 15 דקות.
   3. לשטוף את הבארות עם 1-2 mL של PBS ו כיסוי התאים עם מדיה בסיס המכיל 0.8% מתילתאית ואת ריכוזי המתאים של תרכובות בדיקה.
   4. כתם נגיפי שלטים עם גביש סגול לספור אחרי 72 h לאחר ההדבקה ולקבוע את הזיהום% CVA16 incubations שתוארו לעיל.
      הערה: לבצע את כל שוטף PBS בעדינות כדי למנוע הרמת התאים.

3. שיטת האיגוד המבוססת על הזרמת הזרימה

1. התאים זרעים RD ב 12-לוחות היטב בצפיפות הזריעה של 2 x 10⁵ תאים/טוב. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c בחממה בעלת 5%₂ להשגת מונאולייר.
2. לפני הצינה מונאולייר התא ב -4 ° c עבור 1 h.
3. להדביק את התאים הRD עם CVA16 (מע = 100) בנוכחות והעדר תרכובות הבדיקה עבור 3 h ב 4 ° c.
   הערה: בצעו את החיסון הנגיפי על הקרח ואת הדגירה שלאחר מכן במקרר של 4 ° c כדי לשמור על הטמפרטורה ב -4 ° c, אשר מתיר כריכה ויראלית אך לא כניסה.
4. הסרת וירוסים האירשת ולשטוף פעם אחת עם 1-2 mL של הקרח קר PBS.
5. הרימו את התאים על ידי הוספת 1 מ ל של מאגר דיסוציאציה קר קרח לבארות על הקרח עבור 3 דקות, לפני איסוף התאים והשעיית אותם מחדש הקרח קר הזרימה cy, לנסות מאגר (1x PBS פלוס 2% FBS).
6. לשטוף את התאים פעמיים באמצעות הקרח-קר cy, לנסות מאגר ולתקן את התאים עם 0.5 mL של 4% פאראפורמלדהיד עבור 20 דקות על הקרח.
7. שטוף את התאים באמצעות PBS כדי להסיר וירוסים כבולים לא מאוגדים או חלש, ולאחר מכן הכתם את התאים עם 1 מ ל של נוגדן anti-VP1 (1:2000; מדולל ב-PBS המכיל 3% bsa) על הקרח עבור 1 h, ואחריו דגירה עם אלקסה משנית 488-מעלה מצושל ה1:250 עכבר ה מדולל ב-PBS המכיל 3% BSA) על הקרח עבור 1 h. בצע מנקי PBS (3 פעמים) לאחר כל טיפול נוגדן.
8. להשעות מחדש את התאים ב 0.5 mL של הקרח-קר cy, לנסות מאגר ולבצע הזרימה cy, לנסות ניתוח על cytometry זרימה באמצעות הליכים סטנדרטיים. הצגת נתונים ב היסטגרמות באמצעות התוכנה המשויכת וכימות עבור ייצוג גרף עמודות.

4. שיטת הפעלה נגיפית

1. בצע את שיטת ההפעלה הנגיפית שתוארה בעבר¹² באמצעות התנאים הבאים:
   -ריכוז התחלתי של 10^שישה pfu/ML של CVA16.
   -מונאולאיירס תא RD ב 12-טוב צלחות מצפיפות הזריעה של 2 x 10⁵ תאים/טוב.
   -50-מקפלים לדילול עבור titrating את תרכובות התרופה וכתוצאה מכך ריכוז וירוס הסופי של 50 PFU/טוב.
   -לשטוף את הצעדים באמצעות 1-2 mL של PBS.
   -מדיה שכבת-על המכילה 0.8% מתילצלולוזה.
2. ביצוע הבדיקה הסופית של זיהום נגיפי באמצעות כתמים סגול קריסטל של שלטים ויראלי הליך כמפורט לעיל.

5. ניתוח עגינה מולקולרית

1. הורד מולקולות 3D של תרכובות בדיקה מ-"פוכימיה" (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). אם מולקולות לא יש מבנה תלת-ממד שהועלו, להוריד את המבנים 2D או להשתמש ברצף מחרוזת חיוכים ולהפוך למולקולות תלת-ממד באמצעות תוכנית מולקולרית (g. CORINA).
2. הורד ויראלי יחידת הרכבה ביולוגית מהבנק לנתוני חלבון RCSB (https://www.rcsb.org/) ולהכין את מודל המבנה הנגיפי באמצעות תוכנית biocomputing יחשוב (למשל, הכמרה). לדוגמה, במקרה של CVA16 בוגרת מבנה גבישי קריסטל (PDB: 5C4W)³, למחוק ממיסים מהקובץ PDB, להחליף שרשראות צד לא הושלמה באמצעות נתונים מתוך הספרייה Dunbrach 2010 rotamer ולהוסיף הידרוגנים וחיובים למבנה כמו בעבר דיווחו על¹³. מטרות עגינה יכולות להיות כל חלבונים ויראליות רלוונטיים לניתוח המיועד עם מידע הרכבה ביולוגי (בנק הנתונים של החלבון).
3. עגן תרכובות הבדיקה על יחידת וירוס מוכן באמצעות למשל UCSF המרה כמירה, ולנתח את קבצי הפלט עם תוכנת ויזואליזציה (למשל, Autodock Vina, פימול):
   1. להעלות את הקובץ מתחם הבדיקה לתוך הכמירה בתור "ligand" ולבצע עגינה עיוורת על ידי בחירת החלבון כולו מוכן ויראלי כמו ' קולטן '. השתמש בעכבר המחשב או trackpad כדי לשנות את גודל החיפוש לאורך כל ' קולטן '. באפשרות ' אפשרויות מתקדמות ', הרשה למספר מצבי האיגוד להיות מקסימום. מסגרות עגינה יודרגו באופן אוטומטי מהאנרגיה הגבוהה ביותר לאיגוד הנמוך ביותר.
   2. אופציונלי בנוסף לעגינה עיוורת, להגביל את אתר העגינה אל החלבון הנגיפי באזורים של עניין נגזר מתוצאות העגינה עיוור באמצעות העכבר או trackpad שוב כדי להפחית את עוצמת החיפוש (למשל, 100 Å x 100 Å x 100 Å). שלב זה מסייע לאשר את תוצאות העגינה העיוורת ומגדיל את הפירוט.
   3. השתמש במערכת גרפית מולקולרית (לדוגמה, PyMol) כדי לנתח את מיקומי מצבי האיגוד על-ידי העלאת קובץ העגינה. מצא את אנשי הקשר הקוטבי מהמתחם אל החלבון הנגיפי על ידי בחירת ' ligand ' וזיהוי אנשי קשר קוטביים עם האפשרות ' לכל האטומים '; בדוק את התוצאות.

תוצאות

הזמן של הטיפול בתוספת סמים מצוין באיור 1 ומציג את ההשפעה מהטיפול באמצעות מולקולות קטנות CHLA ו פוג על זיהום CVA16 או הזנה טרום ויראלי (טרום טיפול), במהלך כניסה ויראלי (שיתוף בתוספת), או לאחר ויראלי כניסה ( לאחר ההדבקה). שתי המולקולות הקטנות הפיקו רק השפעה שולית נג...

Discussion

בדוח זה, תיארנו את הפרוטוקולים השימושיים לזיהוי מועמדים אנטי-ויראליים המכוונות לכניסה ויראלית, במיוחד נגד הCVA16 הבלתי-עטופים. האסמאומר מתוכננים בדרכים לנתח את האירועים המוקדמים במהלך הזנה ויראלית, המועילה להבהיר את המנגנון (של) הפעולה והיעד הפוטנציאלי של הפעילות האנטי-נגיפית של סוכני הני?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Sigma	AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG	Invitrogen	A11029
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Anti-VP1 antibody	Merck-Millipore	MAB979	Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer	Beckman Coulter	FC500
Corina	Molecular Networks GmbH
Crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	GIBCO	11995-040
DMSO	Sigma	D5879
FBS	GIBCO	26140-079
Formaldehyde	Sigma	F8775
Graphpad Prism	GraphPad
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based	Sigma	TOX2
Methylcellulose	Sigma	M0512-100G
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070-063
PyMol	Schrödinger
UCSF Chimera	University of California, San Francisco