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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Ziel des Protokolls ist es, die verschiedenen Assays im Zusammenhang mit viralen Eintritte zu veranschaulichen, die verwendet werden können, um Kandidaten-Virus-Eintrittshemmer zu identifizieren.

Zusammenfassung

Antivirale Assays, die den viralen Eintrag mechanistisch untersuchen, sind relevant, um zu erkennen, in welchem Schritt die bewerteten Wirkstoffe am effektivsten sind, und die Identifizierung von Kandidaten-Virus-Eintrittshemmern zu ermöglichen. Hier stellen wir die experimentellen Ansätze zur Identifizierung kleiner Moleküle vor, die eine Infektion durch das nicht umhüllte Coxsackievirus A16 (CVA16) blockieren können, indem sie auf die Viruspartikel oder bestimmte Schritte bei der frühen viralen Eintierung abzielen. Assays umfassen die Analyse der Zeit-der-Arzneimittel-Addition, Flusszytometrie-basierte virale Bindung Assay, und virale Inaktivierung Assay. Wir präsentieren auch ein molekulares Docking-Protokoll, das Virus-Capsid-Proteine verwendet, um potenzielle Rückstände vorherzusagen, die von den antiviralen Verbindungen angegriffen werden. Diese Assays sollten bei der Identifizierung von antiviralen Wirkstoffen helfen, die auf den viralen Eintrag wirken. Zukünftige Richtungen können diese möglichen Inhibitoren für die weitere Arzneimittelentwicklung erforschen.

Einleitung

Die Hand-, Fuß- und Mundkrankheit (HFMD) ist eine Krankheit, die am häufigsten durch das Coxsackievirus A16 (CVA16) und das Enterovirus 71 (EV71) bei Kleinkindern verursacht wird. Kürzlich gab es im gesamten asiatisch-pazifischen Raum einen deutlichen Anstieg der CVA16-induzierten HFMD. Während die Symptome leicht sein können, können schwere Komplikationen auftreten, die das Gehirn und das Herz betreffen, mit potenzieller Todesfall1,2. Derzeit gibt es keine zugelassenen antiviralen Therapien oder Impfungen für CVA16, und daher besteht die dringende Notwendigkeit, antivirale Strategien zu entwickeln, um zukünftige Ausbrüche und die damit verbundenen Komplikationen einzudämmen.

CVA16 ist ein nicht umhülltes Virus, das ein ikosaedrales Kapsid aus Pentamern hat, die jeweils 4 strukturelle Proteine enthalten: VP1, VP2, VP3 und VP4. Umgibt jede fünffache Achse in den Pentamer ist eine "Canyon"-Region, die als Depression zeigt und für ihre Rolle in der Rezeptorbindung3bekannt ist. Am Boden dieser Schlucht liegt eine hydrophobe Tasche in der VP1-Region, die einen natürlichen Fettligand namens Sphingosin (SPH) enthält. Zelluläre Rezeptoren, wie z. B. humanes P-Selgin-Glykoprotein-Ligand 1 (PSGL-1) und Scavenger-Rezeptor-Klasse B-Mitglied 2 (SCARB2), wurden vorgeschlagen, eine Rolle bei der viralen Bindung zu spielen, indem dieser Liganden verdrängt wird, was zu Konformationsänderungen am Kapsid und anschließender Auswurf des viralen Genoms in die Wirtszelle4,5,6. Die Identifizierung möglicher Inhibitoren, die die aufeinanderfolgenden Ereignisse im viralen Eintrittsprozess blockieren, könnte potenzielle therapeutische Strategien gegen eine CVA16-Infektion liefern.

Die Schritte im Viruslebenszyklus können durch experimentelle Ansätze als Ziele zur Identifizierung modusspezifischer antiviraler Wirkstoffe seziert werden. Eine Analyse der Zeit-der-Arzneimittel-Addition untersucht die Arzneimittelbehandlungswirkung zu verschiedenen Zeiten während der Virusinfektion, einschließlich Pre-Entry (vor der Virusinfektion hinzugefügt), Eintrag (gleichzeitig zur Virusinfektion hinzugefügt) und Post-Entry (hinzugefügt nach dem Virusinfektion)7. Die Auswirkungen können mit einem Standard-Plaque-Assay bewertet werden, indem die Anzahl der viralen Plaques quantifiziert wird, die in jeder der Behandlungsbedingungen gebildet werden. Der Strömungszytometrie-basierte virale Bindungstest bestimmt, ob das Medikament die virale Bindung an Wirtszellen verhindert. Dies wird erreicht, indem die Temperatur von 37 °C, bei der die Meisten Infektionen mit menschlichen Viren auftreten, auf 4 °C verschoben wird, wo die Virionen in der Lage sind, sich an die Oberfläche der Wirtszelle zu binden, aber nicht in die Zellen7gelangen können. Die zellmembrangebundenen Viruspartikel werden dann durch Immunfärbung gegen virale Antigene quantifiziert und durch Durchflusszytometrie bewertet. Der virale Inaktivierungstest hingegen hilft, mögliche physikalische Wechselwirkungen des Arzneimittels mit freien Viruspartikeln zu bewerten, entweder die Virionen abzuschirmen oder zu neutralisieren oder Aggregationen oder Konformationsänderungen zu verursachen, die sie für nachfolgende Wechselwirkungen mit der Wirtszelloberfläche während der Infektion8,9. In diesem Experiment darf das virale Inokulum zuerst mit dem Medikament inkubieren, bevor es verdünnt wird, um das Medikament vor der Infektion der Wirtszellmonolayer zu titrieren und einen Standard-Plaque-Assaydurchzuführen 8. Schließlich ist das molekulare Andocken ein leistungsfähiges Werkzeug, um potenzielle Wechselwirkungsstellen für Arzneimittel auf der Virionenoberfläche vorherzusagen, einschließlich der viralen Glykoproteine von umhüllten Viren und der viralen Kapsidproteine von nicht umhüllten Viren, indem computergestützte Algorithmen. Dies hilft, mechanistisch Ziele der Wirkungsweise des Medikaments zu lokalisieren und nützliche Informationen zu liefern, die durch nachgelagerte Assays weiter validiert werden können.

Wir haben vor kurzem die oben beschriebenen Methoden verwendet, um antivirale Verbindungen zu identifizieren, die eine Infektion durch das nicht umhüllte CVA169effizient blockierten. Hierin werden die verwendeten detaillierten Protokolle beschrieben und diskutiert.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Zellkulturen und Virusinfektionen müssen in zertifizierten Biosicherheitshauben durchgeführt werden, die dem Biosicherheitsniveau der behandelten Proben entsprechen. Die beiden Tannin-Klasse der kleinen Moleküle Chebulagsäure (CHLA) und Punicalagin (PUG), die beobachtet wurden, um effizient zu blockieren CVA16-Infektion9, werden als Beispiele für Kandidatenhemmende Mittel verwendet. Für Grundprinzipien in virologischen Techniken, Virusausbreitung, Bestimmung von Virustiter und Konzepten von Plaqueforming Units (PFU) oder Multiplizität von Infektionen (MOI) wird der Leser auf Referenz10verwiesen.

1. Zellkultur, Viruszubereitung, Compound-Vorbereitung und zusammengesetzte Zytotoxizität

  1. Menschliche Rhabdomyosarkom (RD) Zellen sind Wirtszellen freizügig cvA16 Infektion11. Wachsen Sie die RD-Zellen in 10 ml des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS), 200 U/ml Penicillin G, 200 g/ml Streptomycin und 0,5 g/ml Amphotericin B in T-75-Kolben bei 37 °C in einem 5%-CO2-Inkubator.
  2. Bereiten Sie CVA16 vor, indem Sie das Virus in RD-Zellen vermehren und viralen Titer in PFU/ml bestimmen. Für optimiertes Protokoll siehe Verweis11.
  3. Bereiten Sie die Prüfverbindungen und Kontrollen mit ihren jeweiligen Lösungsmitteln vor: lösen Sie beispielsweise CHLA und PUG in Dimethylsulfoxid (DMSO). Für alle Infektionsschritte bestand das Basalmedium aus DMEM plus 2% FBS und Antibiotika.
    HINWEIS: Die Endkonzentration von DMSO in den Test-Compound-Behandlungen beträgt in den Experimenten 0,25 % oder liegt unter 0,25 %; 0,25% DMSO wird als Negativkontrollbehandlung in die Vergleichstests einbezogen.
  4. Führen Sie den Zytotoxizitätstest der Testverbindungen an den FU-Zellen unter Verwendung eines zelllebensfähigkeitsbestimmenden Reagenzes wie XTT ((2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-Tetrazoliumhydroxid) durch. AusführlicheProtokolle finden Sie unter Referenz12. Bestimmen Sie die Zytotoxizitätskonzentrationen der Prüfverbindungen mit einer Analysesoftware wie GraphPad Prism gemäß dem Herstellerprotokoll. Für den Rest der Studie werden Arzneimittelkonzentrationen verwendet, die die Zelllebensfähigkeit nicht signifikant beeinflussen (95 % lebensfähige Zellen).

2. Time-of-Drug-Addition Assay

  1. Bewertung des Einflusses von Medikamenten auf Wirtszellen vor einer Virusinfektion (Vorbehandlung)
    1. Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erhalten.
    2. Behandeln Sie FU-Zellen mit Testverbindungen in nichtzytotoxischen Konzentrationen (bestimmt ab Schritt 1.4) in 1 ml Basalmedienvolumen für 1 h oder 4 h.
    3. Waschen Sie Zellen mit 1-2 ml PBS, bevor Sie 50 PFU/Well des Virus in Basalmedium (Endvolumen des Inokulums ist 300 l) für 1 h. Rock die Platte alle 15 min.
    4. Nach der Infektion die Monolayer erneut mit PBS waschen und dann mit 1 ml Basalmedium mit 0,8% Methylcellulose für eine weitere Inkubation bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator überlagern.
    5. Nach 72 h Inkubation die Überlagerungsmedien entfernen und die Brunnen mit 2 ml PBS waschen.
    6. Fixieren Sie die Brunnen mit 0,5 ml 37% Formaldehyd für 15 min.
    7. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie es erneut mit PBS.
    8. Beflecken Sie die Brunnen mit 0,5 ml 0,5% kristallvioletter Lösung. Dann entfernen Sie die Fleckenlösung innerhalb von 2 min und waschen Sie die Brunnen mit einem sanften Wasserstrom vor dem Austrocknen der Luft.
    9. Zählen Sie die viralen Plaques, indem Sie die Platte auf einen Weißlichtkasten legen. Berechnen Sie den Prozentsatz (%) CVA16-Infektion wie folgt: (Mean - des Plaquevirus +Arzneimittels / Mittelwert des Plaquevirus+DMSO-Kontrolle)
  2. Bewertung der Wirkung der gleichzeitigen Zugabe der Medikamente und des Virus (Koaddition)
    1. Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erhalten.
    2. Behandeln Sie RD-Zellen mit den Prüfverbindungen in den entsprechenden Konzentrationen und 50 PFU/Well von CVA16 (Endvolumen des Inokulums beträgt 300 l) gleichzeitig für 1 h. Gestein die Platte alle 15 min.
    3. Waschen Sie Zellen mit 1 ml PBS und überlagern Sie dann mit 1-2 ml Basalmedium, das 0,8% Methylcellulose enthält, für eine weitere Inkubation bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator.
    4. Stain virale Plaques mit Kristallviolett nach 72 h post-Infektion und bestimmen Die% CVA16-Infektion wie oben beschrieben.
  3. Bewertung der Arzneimittelbehandlungswirkung nach viralem Eintritt (nach der Infektion)
    1. Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erhalten.
    2. Impfen Sie die RD-Zellen mit 50 PFU/Well von CVA16 (Endvolumen des Inokulums beträgt 300 l) für 1 h. Gestein die Platte alle 15 min.
    3. Waschen Sie die Brunnen mit 1-2 ml PBS und überlagern Sie die Zellen mit Basalmedien, die 0,8% Methylcellulose und die entsprechenden Konzentrationen von Prüfverbindungen enthalten.
    4. Stain virale Plaques mit Kristallviolett und zählen nach 72 h nach der Infektion und bestimmen die% CVA16 Infektion Inkubationen oben beschrieben.
      HINWEIS: Führen Sie alle PBS-Washes vorsichtig aus, um das Heben der Zellen zu vermeiden.

3. Flow Cytometry-basierter Bindungstest

  1. Seed RD-Zellen in 12-Well-Platten mit einer Saatdichte von 2 x 105 Zellen/Well. Über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren, um eine Monoschicht zu erreichen.
  2. Die Zellmonoschicht bei 4 °C für 1 h vorkühlen.
  3. Infizieren Sie RD-Zellen mit CVA16 (MOI = 100) in Gegenwart und Abwesenheit der Prüfverbindungen für 3 h bei 4 °C.
    HINWEIS: Führen Sie die virale Impfung auf Eis und die anschließende Inkubation in einem 4 °C-Kühlschrank durch, um die Temperatur bei 4 °C zu halten, was eine virale Bindung, aber keinen Eintritt ermöglicht.
  4. Entfernen Sie Virus Inoculum und waschen Sie einmal mit 1-2 ml eiskalte PBS.
  5. Heben Sie zellen, indem Sie 1 ml eiskalten Dissoziationspuffer für 3 min zu den Brunnen auf dem Eis hinzufügen, bevor Sie die Zellen sammeln und in eiskaltem Durchflusszytometriepuffer (1x PBS plus 2% FBS) wieder aufhängen.
  6. Waschen Sie Zellen zweimal mit dem eiskalten Durchflusszytometriepuffer und fixieren Sie die Zellen mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd für 20 min auf Eis.
  7. Waschen Sie die Zellen mit PBS, um alle ungebundenen oder schwach gebundenen Viren zu entfernen, und färben Sie dann die Zellen mit 1 ml Anti-VP1-Antikörper (1:2.000; verdünnt in PBS mit 3% BSA) auf Eis für 1 h, gefolgt von einer Inkubation mit einem sekundären Alexa 488-konjugierten Anti-Maus-IgG (1:250; in PBS mit 3% BSA) auf Eis für 1 h verdünnt. Führen Sie PBS-Waschungen (3-mal) nach jeder Antikörperbehandlung durch.
  8. Setzen Sie die Zellen in 0,5 ml des eiskalten Durchflusszytometriepuffers aus und führen Sie die Durchflusszytometrieanalyse an einem Durchflusszytometer mithilfe von Standardverfahren durch. Präsentieren Sie Daten in Histogrammen mit der zugehörigen Software und quantitieren Sie für die Darstellung von Balkendiagrammen.

4. Viraler Inaktivierungstest

  1. Führen Sie den viralen Inaktivierungstest wie zuvorbeschrieben 12 unter Verwendung der folgenden Bedingungen durch:
    - Eine Anfangskonzentration von 106 PFU/ml CVA16.
    - RD-Zell-Monolayer in 12-Well-Platten aus einer Sädichte von 2 x 105 Zellen/Well.
    - 50-fache Verdünnung zum Austäupfen der Wirkstoffverbindungen, was zu einer endgültigen Viruskonzentration von 50 PFU/Well führt.
    - Waschschritte mit 1-2 ml PBS.
    - Overlay-Medien mit 0,8% Methylcellulose.
  2. Führen Sie die endgültige Auslesung der Virusinfektion mit der kristallvioletten Färbung von viralen Plaques Verfahren wie oben beschrieben.

5. Molekulare Docking-Analyse

  1. Laden Sie 3D-Moleküle von Testverbindungen von PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) herunter. Wenn Moleküle keine 3D-Struktur hochgeladen haben, laden Sie die 2D-Strukturen herunter oder verwenden Sie die SMILES-String-Sequenz und wandeln Sie sich über ein molekulares Programm (z.B. CORINA) in 3D-Moleküle um.
  2. Laden Sie die virale biologische Montageeinheit von der RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) herunter und erstellen Sie das virale Strukturmodell mit einem Biocomputing-Programm (z.B. UCSF Chimera). Zum Beispiel, im Fall von CVA16 reifen Virionenkristallstruktur (PDB: 5C4W)3, löschen Lösungsmittel aus der PDB-Datei, ersetzen unvollständige Seitenketten mit Daten aus der Dunbrach 2010 Rotamer Library, und fügen Sie Wasserstoffe und Ladungen zur Struktur als zuvor gemeldet13. Docking-Ziele können alle relevanten viralen Proteine für die beabsichtigte Analyse mit einer biologischen Montageinformation (Protein Data Bank) sein.
  3. Dock-Test-Compounds auf die vorbereitete Viruseinheit mit z.B. UCSF Chimera und analysieren Sie die Ausgabedateien mit einer Visualisierungssoftware (z.B. Autodock Vina, PyMol):
    1. Laden Sie die Test-Compound-Datei in UCSF Chimera als "Ligand" hoch und führen Sie blindes Andocken durch, indem Sie das gesamte vorbereitete virale Protein als "Rezeptor" auswählen. Verwenden Sie die Computermaus oder das Trackpad, um die Größe des Suchvolumens auf den gesamten "Rezeptor" zu ändern. Lassen Sie unter "Erweiterte Optionen" die Anzahl der Bindungsmodi maximal zu. Docking-Frames werden automatisch von der höchsten bis zur niedrigsten Bindungsenergie gewertet.
    2. (Optional) Beschränken Sie die Andockstelle nach dem Blindandocken auf das virale Protein in Bereichen von Interesse, die aus den Blinddocking-Ergebnissen abgeleitet sind, indem Sie die Maus oder das Trackpad erneut verwenden, um das Suchvolumen zu reduzieren (z. B. 100 x 100 x 100 X). Dieser Schritt hilft, die Blind-Docking-Ergebnisse zu bestätigen und erhöht die Spezifität.
    3. Verwenden Sie ein molekulares Grafiksystem (z. B. PyMol), um die Positionen der Bindungsmodi zu analysieren, indem Sie die Dockingdatei hochladen. Finden Sie polare Kontakte von der Verbindung zum viralen Protein, indem Sie den "Ligand" auswählen und polare Kontakte mit der Option "zu beliebigen Atomen" identifizieren; die Ergebnisse zu untersuchen.

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Ergebnisse

Der Time-of-Drug-Additionstest ist in Abbildung 1 dargestellt und zeigt den Einfluss der Behandlung mit den kleinen Molekülen CHLA und PUG auf die CVA16-Infektion entweder vorviral (Vorbehandlung), während des viralen Eintrags (Koaddition) oder des postviralen Eintrags ( nach der Infektion). Beide kleinen Moleküle erzeugten nur marginale Auswirkungen auf die CVA16-Infektion, sei es bei der Vorbehandlung der Wirtszellen vor einer Virusinfektion (

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Diskussion

In diesem Bericht haben wir die Protokolle beschrieben, die für die Identifizierung antiviraler Kandidaten nützlich sind, die auf die Viruseingabe abzielen, insbesondere gegen die nicht umhüllte CVA16. Die Assays sind so konzipiert, dass die frühen Ereignisse während des viralen Eintrags sezieren, was hilfreich ist, um den Wirkmechanismus(n) und die potenziellen Ziele der antiviralen Aktivität der Testmittel zu klären. Der "Time-of-Drug-Addition ssay" ermöglicht es, das potenzielle Ziel der Testverbindungen, z. B...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Joshua Beckham von der University of Texas at Austin für die technische Unterstützung beim molekularen Andocken. Diese Studie wurde teilweise durch Fördermittel des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie Taiwans (MOST107-2320-B-037-002 bis C.-J.L. und L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 und MOST107-2320-B-038-034-MY3 bis L.-T.L.).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
4% ParaformaldehydeSigmaAL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgGInvitrogenA11029
Amphotericin BGIBCO15290-018
Anti-VP1 antibodyMerck-MilliporeMAB979Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter CytometerBeckman CoulterFC500
CorinaMolecular Networks GmbH
Crystal violetSigmaC3886-100G
DMEMGIBCO11995-040
DMSOSigmaD5879
FBSGIBCO26140-079
FormaldehydeSigmaF8775
Graphpad PrismGraphPad
Heparin sodium saltSigmaH3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-basedSigmaTOX2
MethylcelluloseSigmaM0512-100G
PBS pH 7.4GIBCO10010023
Penicillin-StreptomycinGIBCO15070-063
PyMolSchrödinger
UCSF ChimeraUniversity of California, San Francisco

Referenzen

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  2. Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
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