コキサッキーウイルスA16に対する抗ウイルス候補の同定のためのウイルスエントリーアッセイと分子ドッキング解析の使用

要約

プロトコルの目的は、候補ウイルスエントリ阻害剤を同定するために使用することができるウイルスエントリに関連する異なるアッセイを説明することです。

要約

機械的にウイルスの入り口を調べる抗ウイルスアッセイは、評価された薬剤が最も効果的であるステップを識別するのに関連し、候補ウイルスエントリー阻害剤の同定を可能にする。ここでは、ウイルス粒子または初期のウイルス侵入における特定のステップを標的にすることにより、非エンベロープコクサッキーウイルスA16(CVA16)による感染を遮断することができる低分子の同定のための実験的アプローチを提示する。アッセイには、薬物添加分析の時間、フローサイトメトリーベースのウイルス結合アッセイ、およびウイルス不活性化アッセイが含まれる。また、ウイルスカプシドタンパク質を利用して、抗ウイルス化合物の標的となる潜在的な残留物を予測する分子ドッキングプロトコルを提示する。これらのアッセイは、ウイルスの侵入に作用する候補抗ウイルス剤の同定に役立つはずだ。将来の方向性は、さらなる薬剤開発のためのこれらの可能な阻害剤を探索することができます。

概要

手、足、口の病気(HFMD)は、幼児におけるコクサッキーウイルスA16(CVA16)およびエンテロウイルス71(EV71)によって最も一般的に引き起こされる疾患である。最近、アジア太平洋地域では、CVA16誘発HFMDが著しい上昇を見せております。症状は軽度であり、脳と心臓に影響を与える重篤な合併症が起こり、潜在的な死亡^{事故は1、2}である。現在のところ、CVA16に対して認可された抗ウイルス療法やワクチン接種は存在しないため、将来の流行とそれに関連する合併症を抑制するための抗ウイルス戦略を開発する必要があります。

CVA16は、それぞれVP1、VP2、VP3、およびVP4という4つの構造タンパク質を含むペンタマーから組み立てられたイコサヘドラルドカプシドを持つ非エンベロープウイルスです。ペンタマーの各5倍軸を囲むは、うつ病として示す「キャニオン」領域であり、受容体^結合3におけるその役割で知られている。この渓谷の底部には、スフィンゴシン(SPH)という名前の天然脂肪リガンドを含むVP1領域に疎水性ポケットがあります。ヒトPセレクチン糖タンパク質リガンド1(PSGL-1)およびスカベンジャー受容体クラスB部材2(SCARB2)などの細胞受容体は、このリガンドを置換することによりウイルス結合の役割を果たさなことが示唆されており、その結果、カプシドおよびコプレジドに対する立体構造変化をもたらす。宿主細胞4、5、6へのウイルスゲノムのその後^の排出。ウイルス入力プロセスにおける連続的な事象をブロックする可能性のある阻害剤を同定することは、CVA16感染に対する潜在的な治療戦略を提供する可能性がある。

ウイルスライフサイクルのステップは、モード特異的抗ウイルス剤の同定に役立つ標的として実験的アプローチを通じて解剖することができる。薬物添加分析では、ウイルス感染の前に(ウイルス感染前に追加)、エントリー(ウイルス感染に同時に追加)、およびポストエントリー(以下に追加される)を含む、ウイルス感染中の異なる時期における薬物治療効果を調べる。ウイルス感染)⁷.その影響は、各治療条件で形成されたウイルスプラークの数を定量することにより、標準的なプラークアッセイを用いて評価することができる。フローサイトメトリーベースのウイルス結合アッセイは、薬物が宿主細胞へのウイルスの付着を防ぐかどうかを決定する。これは、ヒトウイルス感染の大部分が発生する37°Cから、ウイルスが宿主細胞表面に結合できるが^細胞7に入ることができない4°Cに温度をシフトすることによって達成される。細胞膜結合ウイルス粒子は、ウイルス抗原に対する免疫染色を通じて定量化され、フローサイトメトリーによって評価される。一方、ウイルス不活性化アッセイは、遊離ウイルス粒子との薬物の潜在的な物理的相互作用を評価するのに役立ちます, バイリオンを保護または中和, またはそれらのために非アクティブにする集約や立体構造変化を引き起こす感染8、9の間に宿主細胞表面とのその後の相互作用。この実験では、ウイルス接種は、宿主細胞単層に感染し、標準的なプラークアッセイ8を行う前に薬物をチレートする前に、薬物で最初にインキュベートすることを許可する。最後に、分子ドッキングは、計算を使用して、エンベロープされたウイルスからのウイルス糖タンパク質や非エンベロープウイルスからのウイルスカプシドタンパク質を含む、ビリオン表面上の潜在的な薬物相互作用部位を予測するための強力なツールです。アルゴリズム。これは、薬物の作用モードの標的を機械的に特定し、下流アッセイによってさらに検証できる有用な情報を提供するのに役立ちます。

我々は最近、非エンベロープCVA16⁹による感染を効率的にブロックした抗ウイルス化合物を同定するために、上記の方法を採用した。本明細書において、使用された詳細なプロトコルについて説明し、議論する。

プロトコル

注:すべての細胞培養およびウイルス感染は、取り扱うサンプルのバイオセーフティレベルに適した認定バイオセーフティフードで行う必要があります。CVA16感染9を効率的に遮断することが観察された小分子ケブラギン酸(CHLA)とプニカラギン(PUG)の2つのタンニンクラスは、候補阻害剤の例として用いられる。ウイルス学技術における基本原理、ウイルス伝播、ウイルス力確定、およびプラーク形成単位(PFU)または感染の多重性(MOI)の概念について、読者は参照^参照10と呼ばれる。

1. 細胞培養、ウイルス製剤、化合物製剤、化合物細胞毒性

1. ヒト横紋筋肉腫(RD)細胞は、CVA16^感染11に寛容な宿主細胞である。10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)の10mLでRD細胞を成長させ、200 U/mLペニシリンG、 200 μg/mLストレプトマイシン、およびT-75フラスコ中の0.5 μg/mLアンポテリシンBを5%CO₂インキュベーターで37°Cで使用します。
2. RD細胞にウイルスを伝播してCVA16を調べ、PFU/mLでウイルスのチターを決定する。最適化されたプロトコルについては、リファレンス¹¹を参照してください。
3. 各溶媒を使用して試験化合物およびコントロールを調融する:例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)にCHLAおよびPUGを溶解する。すべての感染ステップについて、基底培地はDMEMプラス2%FBSおよび抗生物質からなる。
   注:試験化合物処理におけるDMSOの最終的な濃度は、実験で0.25%以下である。0.25%DMSOは、比較のためのアッセイに陰性対照治療として含まれる。
4. XTTなどの細胞生存率判定試薬を用いてRD細胞上の試験化合物の細胞毒性アッセイを行う((2,3-bis-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-フェニルアミノ)-カルボニル-2H-テトラゾリウムヒドロキシド)詳細なプロトコルについては、リファレンス¹²を参照してください。製造元のプロトコルに従って GraphPad プリズムなどの分析ソフトウェアを使用して、試験化合物の細胞毒性濃度を決定します。細胞生存率に有意に影響を与えない薬物濃度(≥95%生存細胞)は、研究の残りの部分に使用される。

2. 薬剤添加アッセイの時間

1. ウイルス感染前の宿主細胞に対する薬物の影響を評価する(前処理)
   1. 2 x 10⁵細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を得た。
   2. RD細胞を非細胞傷害性濃度(ステップ1.4から決定)で1時間または4時間の基底媒体容積の1mLで治療する。
   3. 1-2 mLのPBSで細胞を洗浄してから、基底媒体に50 PFU/ウェルのウイルスを加え(接種の最終体積は300μL)、1時間ごとにプレートを15分ごとにロックします。
   4. 感染後、PBSを用いて単層を再度洗浄し、0.8%メチルセルロースを含む基底媒体の1mLをオーバーレイし、5%CO2インキュベーターで37°Cでさらにインキュベーションを行う。
   5. インキュベーションの72時間後、オーバーレイ培温を取り外し、PBSの2 mLを使用してウェルを洗浄します。
   6. 37%ホルムアルデヒドの0.5 mLを使用して15分間ウェルを固定します。
   7. 上清を取り出し、PBSを使用して再び洗浄します。
   8. 0.5%結晶紫色溶液の0.5 mLを使用して井戸を汚します。その後、2分以内に汚れ溶液を除去し、空気乾燥前に水の穏やかな流れで井戸を洗浄します。
   9. ホワイトライトボックスにプレートを置くことによって、ウイルスプラークを数えます。パーセント (%)CVA16感染は以下の通り:(プラーク_{ウイルス+薬物}の平均#/プラーク_{ウイルス+DMSO制御}の平均#)×100%。
2. 薬物とウイルスを同時に添加する効果を評価する(共添加)
   1. 2 x 10⁵細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を得た。
   2. RD細胞を適当な濃度で試験化合物で処理し、CVA16の50 PFU/ウェル(接種の最終体積は300μL)を1時間毎にプレートを1時間ロックします。
   3. 1 mLのPBSで細胞を洗浄し、0.8%メチルセルロースを含む基底媒体の1-2 mLでオーバーレイし、5%CO₂インキュベーターで37°Cでさらにインキュベーションを行います。
   4. 感染後72時間後に結晶紫色でウイルスプラークを染色し、上述したようにCVA16感染率を決定する。
3. ウイルス感染後の薬物治療効果を評価する(感染後)
   1. 2 x 10⁵細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を得た。
   2. CVA16の50 PFU/ウェル(接種の最終体積は300μL)でRD細胞を1時間毎にプレートをロックします。
   3. PBSの1-2 mLでウェルを洗浄し、0.8%のメチルセルロースと適切な濃度の試験化合物を含む基底媒体で細胞をオーバーレイします。
   4. 結晶バイオレットでウイルスプラークを染色し、72時間後の感染後にカウントし、上記の%CVA16感染インキュベーションを決定する。
      注:細胞を持ち上げないように、すべてのPBS洗いを穏やかに行います。

3. フローサイトメトリーベースのバインディングアッセイ

1. 2 x 10⁵細胞/ウェルの播種密度で12ウェルプレート中のシードRD細胞。5%CO₂インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、単層を達成する。
2. 細胞単層を4°Cで1時間予冷します。
3. 4°Cで3時間の試験化合物の有無にCVA16(MOI=100)でRD細胞に感染する。
   注:氷上のウイルス接種と4°C冷蔵庫でのインキュベーションを行い、4°Cの温度を維持し、ウイルス結合を可能にするが、入り口は認めません。
4. ウイルスの接種を取り除き、1-2 mLの氷冷PBSで一度洗います。
5. 氷上の井戸に1 mLの氷冷解離バッファーを3分間加えて、細胞を集集め、氷冷流サイトメトリーバッファー(1x PBS+2%FBS)で再懸濁して細胞を持ち上げます。
6. 氷冷流サイトメトリーバッファーを用いて細胞を2回洗浄し、0.5mLの4%パラホルムアルデヒドで20分間氷上で固定する。
7. PBSを使用して細胞を洗浄して、結合されていないウイルスまたは弱結合ウイルスを除去し、その後、抗VP1抗体の1 mL(1:2,000;3%BSAを含むPBSで希釈)で細胞を1時間氷上に染色し、続いてセカンダリAlexa 488結合抗マウスIgG(1:250)でインキュベーションを行います。1時間氷上に3%BSAを含むPBSで希釈し、各抗体処理後にPBS洗い(3回)を行う。
8. 氷冷流サイトメトリーバッファーの0.5 mLで細胞を再中断し、標準的な手順を使用してフローサイトメータ上のフローサイトメトリー分析を実行します。関連するソフトウェアを使用してヒストグラムにデータを表示し、棒グラフ表現の定量を行います。

4. ウイルス不活性化アッセイ

1. 前述^の12のように、次の条件を使用してウイルス不活性化アッセイを実行します。
   - CVA16の開始濃度10⁶ PFU/mL。
   - 2 x 10⁵細胞/ウェルの播種密度から12ウェルプレート中のRD細胞単層。
   - 50倍の希釈を行い、薬物化合物を活性化させ、最終的なウイルス濃度を50PFU/ウェルにする。
   - PBSの1-2 mLを使用してステップを洗浄します。
   - 0.8%のメチルセルロースを含むオーバーレイ培った培養剤。
2. 上記で詳述したように、ウイルスプラーク手順の結晶紫色染色を用いてウイルス感染の最終読み出しを行う。

5. 分子ドッキング解析

1. PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)から試験化合物の3D分子をダウンロードします。分子に3D構造がアップロードされていない場合は、2D構造をダウンロードするか、SMILES弦配列を使用して分子プログラム(例えばCORINA)を介して3D分子に変換します。
2. RCSBタンパク質データバンク(https://www.rcsb.org/)からウイルス生物学的組み立てユニットをダウンロードし、バイオコンピューティングプログラム(例えばUCSFキメラ)を使用してウイルス構造モデルを調作する。例えば、CVA16成熟ビリオン結晶構造(PDB:5C4W)3の場合、PDBファイルから溶媒を削除し、Dunbrach 2010ロタマーライブラリーのデータを使用して不完全なサイドチェーンを置き換え、水素と料金を構造に追加します。以前に報告された¹³.ドッキングターゲットは、生物学的アセンブリ情報(タンパク質データバンク)を用いた意図された分析に関連する任意のウイルスタンパク質でありうたえられる。
3. 例えばUCSFキメラを使用して調製されたウイルスユニットに化合物をドッキングし、ビジュアライゼーションソフトウェア(例えば、オートドックVina、PyMol)で出力ファイルを分析します。
   1. 「リガンド」としてUCSFキメラにテスト化合物ファイルをアップロードし、「受容体」として準備されたウイルスタンパク質全体を選択してブラインドドッキングを実行します。コンピュータのマウスまたはトラックパッドを使用して、検索ボリューム全体の「受容体」のサイズを変更します。[詳細オプション] で、バインド モードの数を最大に設定します。ドッキング フレームは、最高から最低の結合エネルギーに自動的にランク付けされます。
   2. (オプション)さらにブラインドドッキングに関して、マウスまたはトラックパッドを再び使用してブラインドドッキング結果に由来する目的の領域のウイルスタンパク質にドッキング部位を閉じ込め、検索量を減らす(例えば、100Å x 100Å x 100Å)。この手順は、ブラインドドッキングの結果を確認するのに役立ち、特異性を高めるのに役立ちます。
   3. 分子グラフィックスシステム(例えば、PyMol)を使用して、ドッキングファイルをアップロードしてバインディングモードの位置を分析します。「リガンド」を選択し、「任意の原子に」オプションで極性接触を識別することにより、化合物からウイルスタンパク質への極性接触を見つけます。結果を調べます。

結果

時間増量アッセイは図1に示され、CVA16感染に対する低分子CHLAおよびPUGを用いた治療からの影響を示す前ウイルス入力(前処理)、ウイルス入力中(共添加)、またはウイルス後のエントリー(感染後)。いずれの低分子も、ウイルス感染前の宿主細胞の前処理(図1A)または感染後治療(図1C)において、CVA16感染?...

ディスカッション

本報告では、特に非エンベロープCVA16に対して、ウイルスエントリを標的とする抗ウイルス候補の同定に有用なプロトコルについて説明した。アッセイは、ウイルスの侵入中に初期の事象を解剖する方法で設計されており、試験剤の抗ウイルス活性の作用と潜在的な標的のメカニズムを明らかにするのに役立ちます。「薬物添加アッセイ」は、例えば、未感染の宿主細胞(前処理分析)、ウイル...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Sigma	AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG	Invitrogen	A11029
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Anti-VP1 antibody	Merck-Millipore	MAB979	Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer	Beckman Coulter	FC500
Corina	Molecular Networks GmbH
Crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	GIBCO	11995-040
DMSO	Sigma	D5879
FBS	GIBCO	26140-079
Formaldehyde	Sigma	F8775
Graphpad Prism	GraphPad
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based	Sigma	TOX2
Methylcellulose	Sigma	M0512-100G
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070-063
PyMol	Schrödinger
UCSF Chimera	University of California, San Francisco