Uso de ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular para a identificação de candidatos antivirais contra coxsackievirus a16

Resumo

O objetivo do protocolo é ilustrar os diferentes ensaios relativos à entrada viral que podem ser utilizados para identificar os inibidores da entrada viral do candidato.

Resumo

Ensaios antivirais que examinam mecanisticamente a entrada viral são pertinentes para discernir em que etapa os agentes avaliados são mais efetivos e permitem a identificação de inibidores da entrada viral do candidato. Aqui, apresentamos as abordagens experimentais para a identificação de pequenas moléculas capazes de bloquear a infecção pelo coxsackievirus não envelopado A16 (CVA16) através da segmentação das partículas de vírus ou etapas específicas na entrada viral precoce. Os ensaios incluem a análise do tempo de adição de drogas, o ensaio de ligação viral à base de citometria de fluxo e o ensaio de inativação viral. Nós igualmente apresentamos um protocolo de encaixe molecular que utiliza proteínas do capsídeo do vírus para prever os resíduos potenciais alvejados pelos compostos antivirais. Estes ensaios devem ajudar na identificação de agentes antivirais candidatos que atuam na entrada viral. As direções futuras podem explorar esses possíveis inibidores para o desenvolvimento de drogas.

Introdução

A doença da mão, do pé, e da boca (hfmd) é uma doença causada o mais geralmente pelo coxsackievirus A16 (CVA16) e pelo enterovírus 71 (EV71) em crianças novas. Recentemente, em toda a região da Ásia-Pacífico, houve um aumento significativo na HFMD induzida por CVA16. Embora os sintomas possam ser leves, podem ocorrer complicações graves que afetam o cérebro e o coração, com potencial fatalidade^1,2. Atualmente, não há terapias antivirais licenciadas ou vacinações disponíveis para CVA16, e, portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver estratégias antivirais para conter surtos futuros e as complicações associadas.

CVA16 é um vírus não-envelopado que tenha um capsídeo icosahedral montado dos pentâmeros que cada um contem 4 proteínas estruturais a saber VP1, VP2, VP3, e VP4. Circundando cada eixo cinco vezes no pentâmero é uma região ' Canyon ' que mostra como uma depressão e é notável por seu papel na ligação do receptor³. Na parte inferior deste Canyon encontra-se um bolso hidrofóbico na região VP1 que contém um ligante gordo natural chamado esfingosina (SPH). Receptores celulares, como a glicoproteína de P selectina humana ligante 1 (PSGL-1) e o membro da classe B do receptor de scavenger 2 (SCARB2), têm sido sugeridos para desempenhar um papel na ligação viral, deslocando este ligante que resulta em alterações conformacionais para o capsídeo e o subsequente ejeção do genoma viral na célula hospedeira^4,5,6. A identificação de possíveis inibidores que bloqueiam os eventos sucessivos no processo de entrada viral pode fornecer estratégias terapêuticas potenciais contra a infecção por CVA16.

As etapas do ciclo de vida do vírus podem ser dissecadas por meio de abordagens experimentais como alvos para ajudar a identificar agentes antivirais específicos do modo. Uma análise da tempo--droga-adição examina o efeito do tratamento da droga em épocas diferentes durante a infecção viral, incluindo o pre-entry (adicionado antes da infecção do vírus), entrada (adicionado simultâneo à infecção do vírus), e borne-entrada (adicionado depois do Infeção pelo vírus)⁷. O impacto pode ser avaliado usando um ensaio de placa padrão, quantitando o número de chapas virais formadas em cada uma das condições de tratamento. O ensaio de ligação viral à base de citometria de fluxo determina se a droga impede o apego viral às células hospedeiras. Isto é conseguido deslocando a temperatura de 37 ° c, em que a maioria de infecções humanas do vírus ocorre, a 4 ° c, onde os virions podem se ligar à superfície da pilha do anfitrião mas são incapazes de incorporar as pilhas⁷. As partículas de vírus ligadas à membrana celular são então quantificadas por imunocoloração contra antígenos virais e avaliadas por citometria de fluxo. O ensaio de inativação viral, por outro lado, ajuda a avaliar potenciais interações físicas da droga com partículas de vírus livres, protegendo ou neutralizando os virions, ou causando agregações ou alterações conformacionais que os tornam inativos para interações subsequentes com a superfície celular do hospedeiro durante a infecção^8,9. Neste experimento, o inuso viral é permitido incubar primeiro com a droga antes de ser diluído para titular para fora a droga antes de infectar a monocamada da pilha de anfitrião e de executar um ensaio padrão da chapa⁸. Finalmente, o encaixe molecular é uma ferramenta poderosa para prever locais potenciais da interação da droga na superfície do virion, incluindo as glicoproteínas virais dos vírus Envelopado e das proteínas virais do capsídeo dos vírus não-envelopado, usando o computacional Algoritmos. Isso ajuda a identificar os alvos mecanisticamente do modo de ação da droga e fornecer informações úteis que podem ser mais validadas por ensaios a jusante.

Recentemente, empregou-se os métodos descritos acima para identificar compostos antivirais que bloquearam eficientemente a infecção pelos não-envoltos CVA16⁹. Nisto, os protocolos detalhados que foram usados são descritos e discutidos.

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Protocolo

Nota: Todas as infecções da cultura e do vírus de pilha devem ser conduzidas em capas certificadas da Biossegurança que são apropriadas para o nível da biossegurança das amostras que estão sendo tratadas. As duas classes de Tanina de pequenas moléculas de Ácido Chebulágico (CHLA) e punicalagina (PUG), que foram observadas para bloquear eficientemente a infecção por CVA16⁹, são usadas como exemplos de agentes inibitórios candidatos. Para princípios básicos em técnicas de virologia, propagação de vírus, determinação de titer de vírus e conceitos de unidades formadoras de placas (PFU) ou multiplicidade de infecção (MOI), o leitor é encaminhado para referência¹⁰.

1. cultura da pilha, preparação do vírus, preparação composta, e Cytotoxicity composto

1. As células de rabdomiossarcoma humano (RD) são células hospedeiras permissivas à infecção por CVA16¹¹. Aumente as células de RD em 10 mL do meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS), 200 U/mL de penicilina G, 200 μg/mL de estreptomicina e 0,5 μg/mL de anfotericina B em frascos T-75 a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO₂
2. Prepare CVA16 propagando o vírus em pilhas do RD e determine o Titer viral em PFU/mL. Para o protocolo aperfeiçoado, refira por favor a referência¹¹.
3. Prepare os compostos e controles de teste usando seus respectivos solventes: por exemplo, dissolver CHLA e PUG em dimetil sulfóxido (DMSO). Para todas as etapas da infecção, o meio basal consistiu em DMEM mais 2% FBS e antibióticos.
   Nota: A concentração final de DMSO nos tratamentos compostos de teste é igual ou inferior a 0,25% nos experimentos; 0,25% DMSO é incluído como um tratamento de controle negativo nos ensaios para a comparação.
4. Realizar ensaio de citotoxicidade dos compostos de teste nas células de RD usando uma viabilidade celular determinando reagente como XTT ((2,3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -5-phenylamino)-carbonilo]-2H-hidróxido de tetrazólio). Para o protocolo detalhado, refira por favor a referência¹². Determine as concentrações de citotoxicidade dos compostos de teste usando um software analítico como o GraphPad Prism de acordo com o protocolo do fabricante. As concentrações de fármacos que não influenciam significativamente a viabilidade celular (≥ 95% de células viáveis) são utilizadas para o restante do estudo.

2. teste de tempo de adição de drogas

1. Avaliar a influência de fármacos nas células hospedeiras antes da infecção viral (pré-tratamento)
   1. Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 10⁵ células/poço. Incubar durante a noite a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO₂ para obter uma monocamada.
   2. Trate as células de RD com compostos de teste em concentrações não citotóxicas (determinadas a partir da etapa 1,4) em 1 mL de volume de mídia basal por 1 h ou 4 h.
   3. Células de lavagem com 1-2 mL de PBS antes de adicionar 50 PFU/poço de vírus no meio basal (volume final do iníbulo é 300 μL) para 1 h. agitar a placa a cada 15 min.
   4. Após a infecção, lave as monocamadas novamente usando PBS, em seguida, sobrepor com 1 ml de mídia basal contendo 0,8% metilcelulose para incubação mais a 37 ° c em uma incubadora de co₂ de 5%.
   5. Após 72 h de incubação, retire a mídia de sobreposição e lave os poços usando 2 mL de PBS.
   6. Fixar os poços usando 0,5 mL de formaldeído 37% por 15 min.
   7. Retire o sobrenadante e lave novamente usando PBS.
   8. Manchar os poços usando 0,5 mL de 0,5% de solução de cristal violeta. Em seguida, retire a solução de mancha dentro de 2 min e lave os poços com um fluxo suave de água antes da secagem do ar.
   9. Conte as chapas virais colocando a placa em uma caixa de luz branca. Calcule o percentual (%) Infecção CVA16 como segue: (média # de placa _{Virus + droga} /média # de placa _{Virus + DMSO controle}) × 100%.
2. Para avaliar o efeito da adição dos fármacos e do vírus concomitantemente (coadição)
   1. Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 10⁵ células/poço. Incubar durante a noite a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO₂ para obter uma monocamada.
   2. Trate as células de RD com os compostos de teste nas concentrações apropriadas e 50 PFU/poço de CVA16 (volume final do iníbulo é 300 μL) simultaneamente para 1 h. agitar a placa a cada 15 min.
   3. Lave as células com 1 mL de PBS e, em seguida, sobrepor-se com 1-2 mL de meios basais contendo 0,8% de metilcelulose para posterior incubação a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO₂ .
   4. As chapas virais da mancha com violeta de cristal após a infecção do borne de 72 h e determinam a infecção de% CVA16 como descrita acima.
3. Avaliar o efeito do tratamento medicamentoso após a entrada viral (pós-infecção)
   1. Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 10⁵ células/poço. Incubar durante a noite a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO₂ para obter uma monocamada.
   2. Inocular as células de RD com 50 PFU/poço de CVA16 (volume final do inátodo é 300 μL) para 1 h. agitar a placa a cada 15 min.
   3. Lave os poços com 1-2 mL de PBS e sobreponha as células com meios basais contendo 0,8% de metilcelulose e as concentrações apropriadas de compostos de teste.
   4. As chapas virais da mancha com violeta de cristal e contam após a infecção do borne de 72 h e determinam as incubações da infecção de% CVA16 descritas acima.
      Nota: Realize todas as lavas de PBS suavemente para evitar o levantamento das células.

3. ensaio de ligação à base de citometria de fluxo

1. Células de RD de semente em placas de 12 poços em uma densidade de semeadura de 2 x 10⁵ células/poço. Incubar durante a noite em 37 ° c em uma incubadora de 5% CO₂ para conseguir um monocamada.
2. Pré-Chill a monocamada celular a 4 ° c por 1 h.
3. Infectar células RD com CVA16 (MOI = 100) na presença e ausência dos compostos de teste por 3 h a 4 ° c.
   Nota: Realize a inoculação viral no gelo e a incubação que se seguiu em um refrigerador de 4 ° c para manter a temperatura a 4 ° c, o que permite a ligação viral, mas não a entrada.
4. Remova o iníbulo do vírus e lave-o uma vez com 1-2 mL de PBS gelada.
5. Levante as células adicionando 1 mL de tampão de dissociação gelo-frio aos poços no gelo por 3 min, antes de coletar as células e ressuscita-los em buffer de citometria de fluxo de gelo-frio (1X PBS mais 2% FBS).
6. Lave as células duas vezes usando o tampão de citometria de fluxo gelado e fixe as células com 0,5 mL de paraformaldeído a 4% por 20 min no gelo.
7. Lave as células usando PBS para remover quaisquer vírus não acoplados ou fracamente ligados e, em seguida, manchar as células com 1 mL de anticorpo VP1 (1:2000; diluído em PBS contendo 3% de BSA) no gelo por 1 h, seguido de incubação com um secundário Alexa 488-Conjugado IgG anti-mouse (1:250; diluído em PBS contendo 3% de BSA) no gelo durante 1 h. realize lavas de PBS (3 vezes) após cada tratamento de anticorpos.
8. Ressuscita as células em 0,5 mL do tampão de citometria de fluxo de gelo-frio e executa a análise de citometria de fluxo em um citometro de fluxo usando procedimentos padrão. Apresente dados em histogramas usando o software associado e quantificar para representação de gráfico de barras.

4. ensaio de inactivação viral

1. Realize o ensaio de inactivação viral como descrito anteriormente¹² utilizando as seguintes condições:
   -Uma concentração inicial de 10⁶ pfu/ml de CVA16.
   -Monocamadas da pilha do RD em 12 placas do poço de uma densidade de semeadura de 2 x 10⁵ pilhas/poço.
   -50-dobre a diluição para titulating para fora os compostos da droga tendo por resultado uma concentração final do vírus de 50 PFU/poço.
   -Lave as etapas usando 1-2 mL de PBS.
   -Sobreposição de mídia contendo 0,8% metilcelulose.
2. Realize o leitura final da infecção viral usando a mancha violeta de cristal do procedimento viral das chapas como detalhado acima.

5. análise de ancoragem molecular

1. Baixar moléculas 3D de compostos de teste de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Se as moléculas não tiverem uma estrutura 3D carregada, faça o download das estruturas 2D ou use a sequência de cordas SMILES e transforme-as em moléculas 3D através de um programa molecular (por exemplo, CORINA).
2. Baixe a unidade de montagem biológica viral do RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) e prepare o modelo de estrutura viral usando um programa de biocomputação (por exemplo, UCSF Chimera). Por exemplo, no caso da estrutura de cristal de virion CVA16 maduro (PDB: 5C4W)³, exclua os solventes do arquivo PDB, substitua cadeias laterais incompletas usando dados da biblioteca Dunbrach 2010 Rotamer e adicione hidrogênios e encargos à estrutura como relatado anteriormente¹³. As metas de encaixe podem ser quaisquer proteínas virais relevantes para a análise pretendida com uma informação de montagem biológica (Protein Data Bank).
3. Os compostos de teste de doca para a unidade de vírus preparada usando, por exemplo, UCSF Chimera, e analisar os arquivos de saída com um software de visualização (por exemplo, autodock vina, PyMol):
   1. Carregue o arquivo composto de teste em UCSF Chimera como o ' ligand ' e realize o encaixe cego selecionando toda a proteína viral preparada como o ' receptor '. Use o mouse ou o trackpad do computador para redimensionar o volume de pesquisa para todo o ' receptor '. Em ' Opções avançadas ', permitir que o número de modos de ligação para ser no máximo. Os frames de encaixe serão classificados automaticamente da mais alta à mais baixa energia obrigatória.
   2. Opcional Além do encaixe cego, confinar o local de encaixe na proteína viral em regiões de interesse derivadas dos resultados de encaixe cego usando o mouse ou o trackpad novamente para reduzir o volume de pesquisa (por exemplo, 100 å x 100 å x 100 å). Esta etapa ajuda a confirmar os resultados de encaixe cego e aumenta a especificidade.
   3. Use um sistema gráfico molecular (por exemplo, PyMol) para analisar as posições dos modos de vinculação carregando o arquivo de encaixe. Encontre contatos polares do composto à proteína viral selecionando o ' ligand ' e identificando contatos polares com a opção "a todos os átomos"; examinar os resultados.

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Resultados

O teste de adição de tempo de fármaco é indicado na Figura 1 e mostra a influência do tratamento usando as pequenas moléculas CHLA e Pug na infecção CVA16 ou entrada pré-viral (pré-tratamento), durante a entrada viral (coadição), ou entrada pós-viral ( pós-infeção). Ambas as pequenas moléculas produziram apenas impacto marginal contra a infectividade do CVA16, seja no pré-tratamento das células hospedeiras antes da infecção viral (

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Discussão

Neste relato, foram descritos os protocolos que são úteis para a identificação de candidatos antivirais que visam a entrada viral, em particular contra os não CVA16. Os ensaios são projetados de forma a dissecar os acontecimentos precoces durante a entrada viral, o que é útil para esclarecer o mecanismo (s) de ação e potencial alvo (s) da atividade antiviral dos agentes de teste. O "teste de tempo de adição de drogas" permite determinar amplamente o potencial alvo dos compostos de teste, por exemplo, as célu...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyde	Sigma	AL-158127-500G
Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG	Invitrogen	A11029
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Anti-VP1 antibody	Merck-Millipore	MAB979	Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter Cytometer	Beckman Coulter	FC500
Corina	Molecular Networks GmbH
Crystal violet	Sigma	C3886-100G
DMEM	GIBCO	11995-040
DMSO	Sigma	D5879
FBS	GIBCO	26140-079
Formaldehyde	Sigma	F8775
Graphpad Prism	GraphPad
Heparin sodium salt	Sigma	H3393
In vitro toxicology assay kit, XTT-based	Sigma	TOX2
Methylcellulose	Sigma	M0512-100G
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070-063
PyMol	Schrödinger
UCSF Chimera	University of California, San Francisco