הדור של מודל עכברוש של אי ספיקת כבד חריפה על ידי שילוב 70% כריתת הריאה חלקית ופרצטמול

Summary

ספיקת כבד חריפה מודל בעלי חיים שפותחה במחקר הנוכחי מציג חלופה אפשרית למחקר של טיפולים פוטנציאליים. המודל הנוכחי מעסיק את ההשפעה המשולבת של פציעה פיזית ומושרה בתרופות בכבד ומספק חלון זמן מתאים כדי ללמוד את הפוטנציאל של טיפולים חדשניים.

Abstract

אי ספיקת כבד חריפה (אלף) היא מחלה קלינית הנגרמת על ידי חבלות שונות וכתוצאה מכך אובדן מטבולית, ביוכימית, סינתזה, ו הרעלים פונקציות של הכבד. במקרים של נזק בלתי הפיך ביותר בכבד, השתלת כבד אורתוטרופי (OLT) נשאר הטיפול היחיד הזמין. כדי ללמוד את הפוטנציאל התרפויטי של טיפול באלף, הבדיקה המוקדמת במודל החי של אלף היא חיונית. במחקר הנוכחי, מודל אלף בחולדות פותחה על ידי שילוב 70% כריתת hepatectomy חלקית (PHx) וזריקות של פרצטמול (APAP) המספק חלון טיפולי של 48 h. חציון ואת האונות לרוחב השמאלי של הכבד הוסרו לבלו 70% ממסת הכבד APAP ניתנה 24 שעות בניתוח עבור 2 ימים. הישרדות בבעלי חיים באלף המושרה נמצאה בירידה חמורה. ההתפתחות של אלף אושרה על ידי שינוי רמות הסרום של האנזימים אלטין העברת אמינו (ALT), אספרטט העברת אמינו (AST), פוספטאז אלקליין (ALP); שינויים בזמן הפרותרומבין (PT); והערכה של היחס המנורמל הבינלאומי (INR). המחקר של הפרופיל ביטוי הגן על ידי qPCR חשף עלייה ברמות הביטוי של גנים המעורבים אפופטוזיס, דלקת, ובהתקדמות של פציעה בכבד. התנוונות מניוון של hepatocytes וחדירה של תאים חיסוניים נצפתה על ידי הערכה היסטולוגית. הסבירות של אלף אושרה על ידי שיקום של רמות ההישרדות והסרום של ALT, AST, ו-ALP לאחר השתלת הטחול של החולדה בריאה syngeneic. מודל זה מציג חלופה אמינה למודלים הזמינים בעלי חיים כדי ללמוד את הפתופסולוגיה של אלף, כמו גם להעריך את הפוטנציאל של טיפול הרומן של אלף. השימוש בשתי גישות שונות מאפשר גם לבחון את ההשפעה המשולבת של פגיעה בכבד ובתרופות הנובעות מסמים. השגות והכדאיות של ההליך הנוכחי הוא יתרון נוסף של המודל.

Introduction

אי ספיקת כבד חריפה (אלף) מוגדר על ידי האגודה האמריקנית לחקר מחלות כבד כהתפתחות מהירה של פגיעה בכבד חריפה ללא סימנים קודמים של נזק מאופיין ליקוי חמור של סינתטי, מטבולית, ו הרעלים פונקציות של הכבד¹. אלף שונה מכשל כבד כרוני שבו הכישלון מתרחש כתוצאה של פגיעה בכבד הנגרמת על פני תקופה ארוכה של זמן מ ספיקת כבד כרונית חריפה (aclf), שבו נזק לכבד פתאומי מתרחש כתוצאה של מחלות כבד כרונית^2,3,4. התרופה הזמינה היחידה עבור אלף היא השתלת כבד אורתוטופית (OLT), או מוות עלול להתרחש. בשל המחסור של תורמי הכבד, שיעור התמותה בחולים הסובלים מאלף הוא גבוה מאוד.

כדי ללמוד את הפוטנציאל של גישות טיפוליות חלופיות ולהבין טוב יותר את הפתופסיולוגיה של אלף, מודלים בעלי חיים שיכולים לשקף את אלף המתרחשים בבני האדם הם זקוקים. רבים מדגמי החיות הזמינים שכבר הינם בעלי מספר חסרונות. ההשפעות של פרצטמול (APAP) קשות להתרבות, אך יש להן את הדמיון הקרוב ביותר במונחים של הערכים הטמפורלית, הקליניים, הביוכימיים והפתולוגיים. Apap מודלים בעלי חיים המושרה לעתים קרובות בעיות בשל נוכחותם של טהמוגלובינמיה נגרמת על ידי חמצון של המוגלובין על ידי apap ו intermediates שלה^5,6,7. בעיה נוספת היא חוסר ביכולת התגובה המשתקף על ידי תגובות מינון בלתי צפויות ואת זמן המוות. אלף מודלים בעלי חיים המיוצרים באמצעות פחמן טטרה^כלוריד(ccl₄) יש שיקול העוני המסכן^8,9,^10,11. קונקבלנה (קון a) וליפוסכריד (lps)-המושרה אלף בעלי חיים מודלים לא משקפים את הדפוס הקליני של המחלה האנושית, למרות שיש להם יתרונות במחקר של מנגנונים סלולריים המעורבים מחלות בכבד אוטואימוניות במחקר של אלח דם בהתאמה^12,13,14,15. באופן דומה, thioacetamide (TAA) גם דורש ביוטרנספורמציה כדי מטבוליזם פעיל thioacetamide סולפוקסיד ומראה וריאציה מינים^16,17,18,19. ד-גלטוסמיטין (d-Gal) מייצרת מספר שינויים ביוכימיים, מטבוליים ופיסיולוגיים הדומים לאלף, אך אינו מסוגל לשקף את כל המצב הפתולוגי של אלף^20,21,22,23. היו מעט מאוד נסיונות לשלב שתיים או יותר מהשיטות האלה כדי לפתח דגם אלף שמסוגל לשקף את תסמונת אלף בצורה טובה יותר¹³. לכן, מחקרים נוספים נדרשים לפתח מודל שיכול לשקף את הפרמטרים של המחלה, יש התפתחות טובה יותר, ומספק מספיק זמן כדי ללמוד את ההשפעות של התערבות טיפולית.

במחקר הנוכחי, המודל האלטרנטיבי של אלף בחולדות נוצר על ידי שילוב ההשפעות של כריתת hepatectomy (PHx) ומינונים נמוכים יותר של מגיב hepatoרעילים. Apap יש תפקיד מבוסס היטב גרימת פציעה בכבד^5,24,25. זהו כאבים בשימוש נרחב הוא רעיל לכבד במינון supratherapeutic על ידי יצירת מטבוליטים רעילים. APAP הוא הגורם למותם של רבים במדינות מפותחות. פגיעה גופנית נגרמת על ידי כריתת hepatectomy יוזם הפעלה של תהליכים שונים המעורבים דלקת, כמו גם התחדשות הכבד. הזרקה של הסוכן hepatotoxic APAP גורם לסביבה עוינת בכבד, מניעת התפשטות של hepatציטים. זה מפחית את תקופת הלחץ על בעל החיים, אשר כאשר בשילוב עם מינונים קטנים יותר של hepatotoxin, מוביל לשגות טוב יותר של ההליך. לכן, באמצעות מודל זה, השפעה שוללת של שני סוגים של פציעות בכבד נחקרו. כדי לאפיין את דגם אלף החי המפותח, הפרמטרים הפיזיולוגיים והביוכימיים נחקרו. ההיבישה המוצלחת של אלף אושרה על ידי השתלת החולדה בריאה syngeneic.

Protocol

ההליך המתואר להלן אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדי של המכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. מספר האסמכתא הטורית של האישור מהווה המשך 355/14.

1. הכנה

1. היכונו להליך הכירורגי כמתואר קודם על ידי Das B et al.²⁶.
2. השתמש 6 – 8-שבוע בן המטבעי חולדות Wistar עם משקל הגוף של 200 – 250 g.
3. בית בעלי החיים תחת תנאים סטנדרטיים טיפול בבעלי חיים ולהאכיל אותם עם החולדה העכבר libitum לפני ואחרי ההליך.
4. בעת ביצוע 70% PHx, להשתמש בשילוב קוקטייל סטנדרטי של קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/ק"ג משקל הגוף) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג משקל הגוף), אשר מוזרק intraperitoneally.
   הערה: סוג ההרדמה שבשימוש יכול להיות השפעות פוסט-אופרטיביות על התמותה והתחלואה.
5. במהלך השתלת התא, השתמשו בהרדמה ממסים נדיפים (2-כלורט-2-(difluoromethoxy)-1, 1, 1-trifluoro-ethane) כדי להקטין את זמן ההחלמה של בעל החיים לאחר ניתוח ההשתלה.
6. לגרום ולתחזק את ההרדמה הבין-משתמשים במערכת הרדמה אישית. שמור על זרימת החמצן ב-4 ליטר/דקות. לשימוש האינדוקציה isofלאנה ב 4% לשימוש תחזוקה 2 – 3% במהלך הניתוח.

2. הליכים מוקדמים

1. הintraperitoneally את החולדה על ידי הזרקת התערובת הקטמין-xylazine שתוארה בשלב 3.1. לאשר את ההרדמה המלאה על ידי צובט את הבוהן של החיה. הליכים נוספים מתבצעים רק כאשר אין רפלקס דוושה.
2. על מנת למנוע התייבשות, יש למרוח לשתי העיניים שטיפת מתיל מבוססת-תאית.
3. רסן את בעל החיים ההרדמה. ללוח כירורגי באמצעות קלטת לבנה מניחים את בעל החיים עם צד הבטן הפונה כלפי מעלה, ומבטיחים שהפה הוא בצד המרוחק מהאדם המבצע את המבצע.
4. להסיר את השיער מאזור כירורגי הימנית העליונה באמצעות קוצץ חשמלי.
5. לחטא את האתר כירורגי על ידי שלושה חלוקים לסירוגין של povidone יוד ו 70% אתנול באמצעות רפידות כותנה מעוקר בתנועה מעגלית.

3. כריתת הלוע חלקית (PHx) כדי להסיר 70% ממסת הכבד

הערה: בצע את ההליך הכירורגי כולו תחת סביבה סטרילית במכסה זרימה למינארי. השתמש רק כלי ניתוח סטרילי כדי למזער את הסיכון של זיהום בניתוח. הסרת 70% של מסת הכבד, המכונה 70% כריתת hepatectomy (70% PHx), בוצעה כמתואר על ידי ג ' מיטשל ו-H. וילאנביא, 2008²⁷.

1. לפני תחילת הניתוח, לאשר את ההרדמה המלאה של החיה על ידי צובט את הבוהן שלה. הליכים נוספים מתבצעים רק כאשר אין רפלקס דוושה.
2. סמן את העור להיות נחתך ממש מתחת עצם החזה, בניצב xiphoid, ובמקביל לחזה.
3. מניחים סדין סטרילי נקי שיש לו פתח של כ 3 ס"מ x 1 ס מ מעל העור המסומן.
4. בצע חתך רוחבי של סביב 2 – 3 ס מ לאורך הקו המסומן עם אזמל. . השתמש בלהב כירורגי מס ' 22 הסירו בעדינות את ההחזקה של העור לשכבת השריר הבסיסית בקרבת האזור המעוקר תוך שימוש בתיאורי כותנה עקרים.
5. לאחר מכן, בצע חתך רוחבי דרך שכבת הצפק בדיוק מתחת לתהליך xiphoid.
6. בעזרת שני טיפים מלוחים להתשחת כותנה, לחשוף את האונה השמאלית של הכבד על ידי הפעלת לחץ עדין על החזה. מניחים קצה כותנה אחד על האזור הסרמטי של החלק המבוקר וקצה הכותנה השני מתחת לאזור המגורש כדי להרים את אונה הכבד.
7. להחליק 8 – 10 ס מ לולאה לאורך חוט ניילון סטרילי (גודל 4 – 0, 0.15 מ"מ קוטר) סביב אונה הכבד חשוף. קח את הלולאה לבסיס של האונה קרוב hilum בעזרת מלקחיים מיקרובתר או ניצנים לחלח כותנה.
8. בעזרת מחזיק המחט יקרוסקופיים מיקרו מלקחיים, לקשור את שני הקצוות של הלולאה, הצבת הקשר קרוב לבסיס של האונה ככל האפשר כדי לצמצם את כלי הדם ולהפחית את הדימום לאחר האונה הכבד מוסר. . קשור שני קשרים נוספים בצד השני
9. נקוט זהירות לא לקשור את הקשר קרוב מדי לכלי הדם הסמוכים, אשר עלול אחרת לגרום חסימה בורידים (היצרות).
10. השימוש מספריים יקרוסקופיים לחתוך את האונה הקשורה ממש מעל הקשר, אשר משאיר מסה דהוי של רקמה הנקרא גדם האיסכמי במקום האונה.
    הערה: כבד חולדה, כמו אלה של עכברים, מחולק לארבע אונות נפרדות: האונה החציוני, האונה הימנית לרוחב, שמאל האונה השמאלית, ואת האונה מזונבת, אשר מייצגים כ 40%, 20%, 30%, ו 7% ממסת הכבד הכולל, בהתאמה. כל שילוב של האונות האלה ניתן להסיר לבלו 70% הכבד מסה. במחקר הנוכחי, האונה החציוני ואת האונות הצדדיים השמאלית הוסרו.
11. אתר בקפידה את האונה החציוני מבלי לפגוע בגדם הנותר של האונה הצדדית השמאלית. בעדינות למשוך את זה מתוך חלל הבטן, ובבסיס של עניבה האונה 8-10 ס מ החוט ניילון ארוך (גודל 4-0) הקשר כפי שהוזכר קודם לכן. . קשור שני קשרים נוספים בצד השני בסדר בזהירות ולהסיר את האונה החציוני קשור לקחת את כל אמצעי הזהירות שהוזכרו.
12. לאחר הסרת האונות, תפר את הצפק באמצעות כרוממית 4-0 תפר עם תפרים מתמשך ואחריו העור בתפירה עם תפר קטוע.
13. החל povidone יוד על העור המקיף את התפרים כדי למנוע זיהום.
14. הסר את הסדין העטוף והוצא את בעל החיים מלוח הניתוח.

4. טיפול פוסט-פעיל בבעלי חיים

1. Intraperitoneally להזריק את בעל החיים עם מנה של 12 mg cefo, 1 מ ל של 5% גלוקוז פתרון עם מזרק 1 mL כדי להגן עליו מפני הסיכון של זיהום לאחר הניתוח.
2. ניהול הזרקה תת עורית של מלוקסיאם כאבים (1 מ"ג/ק"ג משקל הגוף) להקלה על הכאב לאחר הניתוח ולעקוב אחר זה על ידי שתי מינונים יותר, שמירה על משטר כמנה אחת ליום.
3. הבית בעלי החיים המופעלים תחת תנאים סטנדרטיים של 12 h מחזור אור/כהה וניטור במרווחי זמן קבועים.

5. הזרקת סם בעלי חיים בעלי מערכת חלקית כדי לגרום לכשל בכבד

1. לאחר 24 שעות הניתוח, כאשר בעלי החיים התאושש בהצלחה מ 70% PHx, למדוד את משקל הגוף של בעל החיים ואחריו הזריקות.
2. הכנס 750 מ"ג/ק"ג משקל הגוף של APAP intraperitoneally בחיות hepatectomized תוייזציה באופן חלקי 24 שעות לאחר 70% PHx בעקבות בעלי החיים ' התאוששות מוצלחת מההליך כירורגי. חזור על המינון שוב לאחר 24 שעות.
   הערה: שתי מינונים של APAP מנוהלים intraperitoneally לבעל החיים (כלומר, 24 h ו 48 h לפרסם את ההליך 70% PHx, בהתאמה).
3. בכל פעם לאחר ההזרקה של APAP, למדוד את משקל הגוף של החיה להתאושש.
   הערה: APAP (biocetamol) הוא מוזרק בעלי חיים כפתרון 150 mg/mL ב 2% אלכוהול בנזיל.

6. השתלת הפציטים בריאות בדגמי אלף בעלי חיים

הערה: כדי ללמוד את הסבירות של אלף בחולדות, השתלת מלשין בריא לעכברושים בעלי חיים בתוך הבשר המושרה ביחד עם^{מנה אחת} של apap. במחקר הנוכחי, כדי לספק זמן רב לתאים המושתלים עבור ביות ו העפילו, ההשתלה נעשתה רק לאחר לתת את^{המינון 1} של apap. החולדה הפטציטים מבודדת על ידי פרוטוקול שפורסם לראשונה על ידי ברי וחברים ואח '²⁸ ומאוחר יותר הותאם במחקרים שונים^29,30,31 עם כמה שינויים. עבור השתלת הטחול של תאים בדגם אלף בעלי חיים, בצע את השלבים שהוזכרו להלן.

1. מניחים את העכברוש לתוך תא פולי (מתיל מתיונין) עבור אינדוקציה של הרדמה עם 4% isof, ו 4 זרימת חמצן L/min עבור חולדה של 250 – 350 גרם משקל הגוף. בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר רפלקסים פדלים כאשר צובט את הבוהן של החיה.
2. הניחו את העכברוש הרדימים על הלוח הכירורגי, כך שהחלק השמאלי שלו פונה כלפי מעלה. שמרו על הרדמה בשעה 2-3% משאיפת האינהלציה באמצעות דובר מתאים.
3. לגלח את העור על האזור לרוחב שמאל לעקר אותו על ידי הפתרון יוד povidone.
4. לעשות חתך רוחבי על האזור מגולח של העור.
5. בצע חתך של 1 – 2 ס מ בשכבת הצפק כדי לחשוף את הטחול.
6. הסירו בעדינות את הטחול של חלל הצפק והרימו אותו בעזרת שתי עצות לגבי כותנה.
7. שמור את התאים (בדרך כלל 10⁷ לכל בעל חיים) להיות מושתלים מושעה 50 ΜL imdm מדיה במזרק 1 מ"ל אינסולין עם מחט של 29 G.
8. בעדינות לנקב את המחט לתוך קליפת הטחול ולשחרר את ההשעיה התא לתוך הטחול בתוך 2 – 3 דקות.
9. לאחר השתלת התא הושלמה, בזהירות להוציא את המחט ולחלק את האזור של ניקוב המחט עם קצה כותנה לחלח כדי למנוע דליפה של ההשעיה התא מהאתר.
10. סגרו את הצפק והעור באמצעות תפר של 4-0 שנספג באופן רציף ובלתי פוסק בהתאמה.
11. החל povidone פתרון יוד על העור במקום התפרים כדי למנוע זיהום באתר המופעל.
12. Intraperitoneally להזריק 1 מ"ל נפח של 12 מ"ג/mL של אנטיביוטיקה (למשל, cefoסעה) פתרון ותת-עורי להזריק כאבים (g., מלוקסיעם) 1 מ"ג/ק"ג משקל הגוף לחיה כחלק טיפול פוסט-פעיל. הזיזו את החיה לכלוב חם ומתאושש.
13. לשמור על החיה המופעלת בבידוד בתנאים נורמליים של 12 h מחזור אור/כהה עד הפצעים המנתחים החלימו לחלוטין. הדבר עשוי להימשך שלושה – ארבעה ימים.

7. אפיון ההתפתחות של אלף

1. המתת חסד בעלי חיים על ידי מנת יתר של פתרון קטמין-xylazine 2 h לאחר^{המינון 2} של apap טיפול ולאסוף דגימות דם ורקמות.
2. איסוף סרום מדם למחקרים ביוכימיים³².
3. עיבוד דוגמיות של רקמת הכבד עבור לימודי היסטולוגית וגנים ביטויים^33,34,35.

תוצאות

אחוז ההישרדות במודלים של בעלי חיים של אלף
המינון האופטימלי של APAP לגרום אלף בשילוב עם 70% PHx היה מתוקננת כמו 750 מ"ג/ק"ג משקל הגוף. משטר הטיפול החל 24 שעות לאחר 70% PHx, כאשר בעלי החיים התאושש לחלוטין מהניתוח, וכללה שתי מנות APAP במרווחי זמן 24 h. התמותה נצפתה בשיעור של 80% לאחר הממשל של המינון הש...

Discussion

התפתחותו של דגם בעלי חיים מתאים לאלף היא החשובה ביותר להבנת הפתוגנזה וההתקדמות של אלף. מודל מאופיין היטב של אלף בעלי חיים גם מספק את ההזדמנות לפיתוח ולניסוי של גישות טיפוליות חדשות נגד אלף. ניסיונות רבים נעשו לפתח מודל רלוונטי קלינית של אלף^6,12,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet (Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
Cefotaxime (Taxim®)	AlKem; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma; US	6522
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet®)	Reckitt Benckiser, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD; US	REF 303060
Isoflurane (Forane®)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax®)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex®)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll®	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin®)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant