Generazione di un modello di ratto di insufficienza epatica acuta combinando il 70% di epatitectomia parziale e acetaminofene

Riepilogo

Il modello animale acuto di insufficienza epatica sviluppato nell'attuale studio presenta un'alternativa fattibile per lo studio di potenziali terapie. L'attuale modello utilizza l'effetto combinato di lesioni epatiche fisiche e farmacologiche e fornisce una finestra temporale adatta per studiare il potenziale di nuove terapie.

Abstract

L'insufficienza epatica acuta (ALF) è una condizione clinica causata da varie eziologie con conseguente perdita di funzioni metaboliche, biochimiche, sintetizzanti e disintossicanti del fegato. Nella maggior parte dei casi di danni al fegato irreversibili, trapianto di fegato ortotropico (OLT) rimane l'unico trattamento disponibile. Per studiare il potenziale terapeutico di un trattamento per ALF, è essenziale il suo test precedente in un modello animale di ALF. Nello studio attuale, è stato sviluppato un modello ALF nei ratti combinando il 70% di epatectomia parziale (PHx) e iniezioni di acetaminofene (APAP) che fornisce una finestra terapeutica di 48 h. I lobi laterali mediani e lasciati del fegato sono stati rimossi per accise 70% della massa epatica e APAP è stato dato 24 h postchirurgico per 2 giorni. La sopravvivenza negli animali indotti da ALF è risultata essere gravemente diminuita. Lo sviluppo di ALF è stato confermato da livelli alterati di siero degli enzimi alanine aminoasi (ALT), aminoatomomomomomosoe aspartato (AST), fosfatosi alcalina (ALP); cambiamenti nel tempo protrombina (PT); e valutazione del rapporto internazionale normalizzato (INR). Lo studio del profilo di espressione genica da parte di qPCR ha rivelato un aumento dei livelli di espressione dei geni coinvolti nell'apoptosi, nell'infiammazione e nella progressione della lesione epatica. La degenerazione diffusa degli epatociti e l'infiltrazione delle cellule immunitarie è stata osservata mediante valutazione istologica. La reversibilità di ALF è stata confermata dal ripristino dei livelli di sopravvivenza e siero di ALT, AST e ALP dopo il trapianto intrasplenico di epatociti di ratti sani sinosgenici. Questo modello presenta un'alternativa affidabile ai modelli animali ALF disponibili per studiare la fisiofisiologia di ALF e per valutare il potenziale di una nuova terapia per ALF. L'uso di due approcci diversi consente inoltre di studiare l'effetto combinato delle lesioni epatiche fisiche e indotte da farmaci. La riproducibilità e la fattibilità della procedura corrente è un ulteriore vantaggio del modello.

Introduzione

L'insufficienza epatica acuta (ALF) è definita dall'Associazione Americana per lo Studio delle Malattie del Fegato come rapido sviluppo di lesioni epatiche acute senza segni previi di danno ed è caratterizzata da una grave compromissione delle funzioni sintetiche, metaboliche e disintossicanti del fegato¹. ALF si differenzia dall'insufficienza epatica cronica in cui l'insufficienza si verifica a causa di lesioni epatiche causate per un lungo periodo di tempo e da insufficienza epatica cronica acuta (ACLF), dove si verificano danni epatici bruschi a causa di malattie epatiche croniche^2,3^,4. L'unica cura disponibile per ALF è il trapianto di fegato ortotopico (OLT), o la morte può verificarsi. A causa della carenza di donatori di fegato, il tasso di mortalità nei pazienti affetti da ALF è molto alto.

Per studiare il potenziale di approcci terapeutici alternativi e per comprendere meglio la fisiofisiologia dell'ALF, sono necessari modelli animali che possano riflettere l'ALF che si verifica negli esseri umani. Molti dei modelli animali ALF già disponibili presentano diverse carenze. Gli effetti dell'acetaminofene (APAP) sono difficili da riprodurre, ma hanno le somiglianze più vicine in termini di parametri temporali, clinici, biochimici e patologici. I modelli animali indotti da APAP- incontrano spesso problemi dovuti alla presenza di methemoglobinemia causata dall'ossidazione dell'emoglobina da parte dell'APAP e dei suoi intermedi^5,6,7. Un altro problema è la mancanza di riproducibilità riflessa da risposte imprevedibili alla dose e l'ora della morte. I modelli animali ALF prodotti con tetra cloruro di tetra di carbonio (CCl₄) hanno scarsa riproducibilità^8,9,10,11. I modelli animali ALF indotti da Concavalin A (Con A) e lipoplysaccharide (LPS) non riflettono il modello clinico della malattia umana, anche se hanno vantaggi nello studio dei meccanismi cellulari coinvolti nelle malattie epatiche autoimmuni e nello studio della sepsi rispettivamente^12,13,14,15. Allo stesso modo, la tioacetamide (TAA) richiede anche la biotrasformazione in un metabolita attivo di tioacetamide e mostra la variazione delle specie^16,17,18,19. D-galactosamine (D-Gal) produce alcuni cambiamenti biochimici, metabolici e fisiologici simili a ALF ma non è in grado di riflettere l'intera condizione patologica ALF^20,21,22,23. Ci sono stati pochissimi tentativi di combinare due o più di questi metodi per sviluppare un modello ALF che è in grado di riflettere la sindrome ALF in modo migliore¹³. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per sviluppare un modello in grado di riflettere i parametri della malattia, ha una migliore riproducibilità e fornisce abbastanza tempo per studiare gli effetti di un intervento terapeutico.

Nello studio attuale, è stato creato un modello alternativo ALF nei ratti combinando gli effetti dell'epatectomia parziale (PHx) e le dosi più basse di un reagente epatotossico. APAP ha un ruolo ben consolidato nel causare lesioni epatiche^5,24,25. È un analgesico ampiamente usato ed è tossico per il fegato a dosi sopraterapeutiche formando metaboliti tossici. L'APAP è la causa di molti decessi nei paesi sviluppati. La lesione fisica causata dall'epatectomia parziale avvia l'attivazione di vari processi coinvolti nell'infiammazione e nella rigenerazione del fegato. L'iniezione dell'agente epatotossico APAP provoca un ambiente ostile nel fegato, impedendo la proliferazione di epatociti. Questo riduce il periodo di stress sull'animale, che quando combinato con piccole dosi di epatotossina, porta a una migliore riproducibilità della procedura. Pertanto, utilizzando questo modello, è stato studiato un effetto combinatorio di due tipi di lesioni epatiche. Per caratterizzare il modello animale ALF sviluppato, sono stati studiati i parametri fisiologici e biochimici. Una corretta reversibilità di ALF è stata confermata dal trapianto di epatociti di ratto sano singenico.

Protocollo

La procedura descritta di seguito è stata approvata dal Comitato Etico Istituzionale degli Animali dell'Istituto Nazionale di Immunologia, Nuova Delhi. Il numero di riferimento seriale dell'omologazione è IAEC-355/14.

1. Preparazione

1. Preparare la procedura chirurgica come descritto in precedenza da Das B et al.²⁶.
2. Usa ratti Wistar inbred di 6-8 settimane con un peso corporeo di 200-250 g.
3. Alloggiare gli animali in condizioni standard di cura degli animali e dar loro da mangiare con chow ratto e libitum prima e dopo la procedura.
4. Quando si esegue il 70% di PHx, utilizzare un mix cocktail standard di cloridrato di chetamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xylazina (10 mg/kg peso corporeo), che viene iniettato intraperitonealmente.
   NOTA: Il tipo di anestetico utilizzato può avere effetti postoperatori sulla mortalità e la morbilità.
5. Durante il trapianto di cellule, utilizzare l'anestesia inalante Isoflurane (2-cloro-2-(difluoromethoxy)-1,1-trifluoro-etano) per ridurre il tempo di recupero dell'animale dopo l'intervento di trapianto.
6. Indurre e mantenere l'anestesia inalazionale utilizzando un sistema di anestesia personalizzato. Mantenere il flusso di ossigeno a 4 L/min. Per l'uso a induzione èoflurane al 4% e per l'uso di manutenzione 2-3% durante la procedura chirurgica.

2. Procedure di preoperatoria

1. Anestesizzare il ratto iniettando la miscela di chetamina-xilazina descritta al punto 3.1 intraperitonealmente. Confermare l'anestesizzazione completa pizzicando la dita dell'animale. Ulteriori procedure vengono eseguite solo quando non c'è riflesso del pedale.
2. Per evitare la disidratazione corneale, applicare un carboxy methyl-cellulosa a base di occhio su entrambi gli occhi.
3. Restringere l'animale anestesizzato a una scheda chirurgica utilizzando nastro bianco. Posizionare l'animale con il lato addominale rivolto verso l'alto, assicurandosi che la bocca sia sul lato disfatto dalla persona che esegue l'operazione.
4. Rimuovere i capelli dall'area chirurgica addominale in alto a destra utilizzando un clipper elettrico.
5. Disinfettare il sito chirurgico con tre scrub alternati di iodio povidone e 70% di etanolo utilizzando batuffoli di cotone sterilizzati in movimento circolare.

3. Epatectomia parziale (PHx) per rimuovere il 70% della massa del fegato

NOTA: Eseguire l'intera procedura chirurgica in un ambiente sterile in una cappa a flusso laminare. Utilizzare solo strumenti chirurgici sterili per ridurre al minimo il rischio di infezione postchirurgica. La rimozione del 70% della massa epatica, chiamata 70% epatectomia parziale (70% PHx), è stata eseguita come descritto da C. Mitchell e H. Willenbring, 2008²⁷.

1. Prima dell'inizio dell'intervento, confermare l'anestesizzazione completa dell'animale pizzicando il dito del dito del dito. Ulteriori procedure vengono eseguite solo quando non c'è riflesso del pedale.
2. Contrassegnare la pelle da tagliare appena sotto lo sterno, perpendicolare allo xifoide e parallelamente alla gabbia toracica.
3. Posizionare un foglio di drappo sterile con un'apertura di circa 3 cm x 1 cm sulla pelle marcata.
4. Eseguire un'incisione trasversale di circa 2-3 cm lungo la linea marcata con un bisturi. Utilizzare la lama chirurgica n. 22. Rimuovere delicatamente l'attaccamento della pelle allo strato muscolare sottostante in prossimità dell'area incisa utilizzando punte sterili di cotone inumidito.
5. Successivamente, fare un'incisione trasversale attraverso lo strato peritoneale appena sotto il processo xifoideo.
6. Con l'aiuto di due punte di cotone inumidite salina, esporre il lobo sinistro del fegato applicando una leggera pressione sul torace. Posizionare una punta di cotone sulla regione diaframmatica della porzione incisa e l'altra punta di cotone sotto la regione incisa per sollevare il lobo del fegato.
7. Scivolare un anello di filo di nylon sterile lungo 8-10 cm (dimensioni 4-0, diametro di 0,15 mm) intorno al lobo epatico esposto. Prendere l'anello alla base del lobo vicino all'hilum con l'aiuto di pinze microdissecting o cotton fioc inumiditi.
8. Con l'aiuto del supporto dell'ago di microchirurgia e delle microforza, legare le due estremità del loop, ponendo il nodo il più vicino possibile alla base del lobo per restringere il vaso sanguigno e ridurre il sanguinamento dopo la rimozione del lobo epatico. Legare due nodi aggiuntivi sull'altro lato.
9. Prendere precauzione di non legare il nodo troppo vicino ai vasi sanguigni vicini, che altrimenti possono causare ostruzione venosa (stenosi).
10. Utilizzare forbici microchirurgiche per tagliare il lobo legato appena sopra il nodo, che lascia una massa scolorita di tessuto chiamata un ceppo ischemico al posto del lobo.
    NOTA: Il fegato di ratto, come quelli dei topi, è diviso in quattro lobi distinti: il lobo mediano, il lobo laterale destro, il lobo laterale sinistro e il lobo caudato, che rappresentano rispettivamente circa il 40%, il 20%, il 30% e il 7% della massa epatica totale. Qualsiasi combinazione di questi lobi può essere rimosso per accise 70% massa epatica. Nello studio attuale, il lobo mediano e i lobi laterali sinistri sono stati rimossi.
11. Individuare con attenzione il lobo mediano senza danneggiare il resto ceppo del lobo laterale sinistro. Estrarlo delicatamente dalla cavità addominale, e alla base del lobo legare un filo di nylon lungo 8-10 cm (dimensioni 4-0) nodo come accennato in precedenza. Legare due nodi aggiuntivi sull'altro lato. Accisa con attenzione e rimuovere il lobo mediano legato prendendo tutte le precauzioni menzionate.
12. Dopo aver rimosso i lobi, suturare il peritoneo utilizzando una sutura cromatica assorbibile 4-0 con punti continui seguiti da sutura della pelle con una sutura interrotta.
13. Applicare iodio povidone sulla pelle che circonda le suture per prevenire l'infezione.
14. Rimuovere il foglio di drappo e rimuovere l'animale dalla scheda chirurgica.

4. Cura postoperatoria negli animali

1. Intraperitonealmente iniettare l'animale con una dose di 12 mg cefotaxime antibiotico in 1 mL di 5% soluzione di glucosio con una siringa da 1 mL per proteggerlo dal rischio di infezione postoperatoria.
2. Somministrare un'iniezione sottocutanea di meloxicam analgesica (1 mg/kg di peso corporeo) per alleviare il dolore dopo l'intervento chirurgico e seguirlo da altre due dosi, mantenendo il regime come una dose al giorno.
3. Casa gli animali operati in condizioni standard di 12 h ciclo di luce / buio e monitorare a intervalli regolari.

5. Iniezione di droga in animali parzialmente epatici per indurre l'insufficienza epatica

1. Dopo 24 ore di postchirurgia, quando gli animali si sono ripresi con successo dal 70% di PHx, misurare il peso corporeo dell'animale seguito dalle iniezioni.
2. Iniettare 750 mg/kg di peso corporeo di APAP per via intraperitoneamente in animali parzialmente epatici 24 h dopo il 70% di PHx dopo il recupero riuscito degli animali dalla procedura chirurgica. Ripetere di nuovo la dose dopo 24 h.
   NOTA: Due dosi di APAP vengono somministrate intraperitonealmente all'animale (rispettivamente 24 h e 48 h post della procedura PHx del 70%).
3. Ad ogni momento dopo l'iniezione di APAP, misurare il peso corporeo dell'animale in recupero.
   NOTA: L'APAP (biocetamolo) viene iniettato negli animali come soluzione da 150 mg/mL nel 2% di alcool benzile.

6. Trapianto di epatociti sani in modelli animali ALF

NOTA: Per studiare la reversibilità di ALF nei ratti, trapiantare epatociti di ratti sinugenici sani intrasplenically negli animali indotti da ALF insieme alla^dose di APAP. Nello studio attuale, per fornire ampio tempo alle cellule trapiantate per l'homing e l'innesto, il trapianto è stato fatto subito dopo aver dato la^dose di APAP. Gli epatociti rattociti sono isolati da un protocollo pubblicato prima da Berry and Friends et al.²⁸ e successivamente adattati in vari altri studi^29,30,31 con alcune modifiche. Per il trapianto intrasplenico di cellule nel modello animale ALF, seguire i passaggi indicati di seguito.

1. Mettere il ratto in una camera poli (methacritillato metilico) per l'induzione dell'anestesia con 4% di isoflurane e 4 L/min flusso di ossigeno per un ratto di 250-350 g di peso corporeo. Controllare la profondità dell'anestesia per la mancanza di riflessi del pedale quando si pizzica la punta dell'animale.
2. Posizionare il ratto anatizzato sulla scheda chirurgica in modo che la sua parte laterale sinistra sia rivolta verso l'alto. Mantenere l'anestesia al 2-3% di inalazione isoflurane attraverso un boccaglio adatto.
3. Rasare la pelle sulla regione laterale sinistra e sterilizzarla con soluzione di iodio povidone.
4. Fare un'incisione trasversale sulla regione rasata della pelle.
5. Fate un taglio di 1-2 cm nello strato peritoneale per esporre la milza.
6. Estrarre delicatamente la milza della cavità peritoneale e sollevarla con l'aiuto di due punte di cotone inumidite.
7. Mantenere le cellule (tipicamente 10⁷ per animale) da trapiantare sospese in supporti IMDM da 50 anni in una siringa di insulina da 1 mL con un ago da 29 G.
8. Forare delicatamente l'ago nella corteccia della milza e rilasciare la sospensione cellulare nella milza entro 2-3 min.
9. Dopo aver completato il trapianto di cellule, estrarre con attenzione l'ago e tamponare l'area della puntura dell'ago con una punta di cotone inumidita per evitare perdite della sospensione cellulare dal sito.
10. Chiudere il peritoneo e la pelle con una sutura assorbibile 4-0 con sutura continua e discontinua rispettivamente.
11. Applicare la soluzione di iodio povidone sulla pelle sul posto delle suture per prevenire l'infezione sul sito azionato.
12. Intraperitonemente iniettare 1 mL di 12 mg/mL di soluzione antibiotica (ad esempio cefotaxime) soluzione e sottocutaneamente iniettare analgesico (ad esempio, meloxicam) 1 peso corporeo di 1 mg/kg per l'animale come parte delle cure postoperatorie. Spostare l'animale in una gabbia calda di recupero.
13. Mantenere l'animale operato in isolamento in condizioni normali di 12 h ciclo leggero / scuro fino a quando le ferite chirurgiche sono completamente guarite. L'operazione potrebbe richiedere da 3 a 4 giorni.

7. Caratterizzazione dello sviluppo ALF

1. Eutanasia gli animali per sovradosaggio di chetamina-xylazina soluzione 2 h dopo la dose 2^nd di trattamento APAP e raccogliere campioni di sangue e tessuti.
2. Raccogliere il siero dal sangue per studi biochimici³².
3. Elaborare campioni di tessuto epatico per studi istologici e di espressione genica^33,34,35.

Risultati

Percentuale di sopravvivenza nei modelli animali di ALF
La dose ottimale di APAP per causare ALF in combinazione con 70% PHx è stato standardizzato come 750 mg/kg peso corporeo. Il regime di trattamento è iniziato 24 h dopo 70% PHx, quando gli animali si erano completamente ripresi dall'intervento chirurgico, e consisteva di due dosi di APAP a intervalli di 24 h. La mortalità è stata osservata al tasso dell'80% dopo la somministrazione della seconda dose di APAP, 48 h post-intervento chirurgico. L...

Discussione

Lo sviluppo di un modello animale appropriato per ALF è fondamentale per una migliore comprensione della patogenesi e della progressione di ALF. Un modello animale ALF ben caratterizzato offre anche l'opportunità per lo sviluppo e la sperimentazione di nuovi approcci terapeutici contro ALF. Sono stati fatti molti tentativi per sviluppare un modello clinicamente rilevante di ALF^{6,12,21,23...}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet (Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
Cefotaxime (Taxim®)	AlKem; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma; US	6522
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet®)	Reckitt Benckiser, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD; US	REF 303060
Isoflurane (Forane®)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax®)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex®)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll®	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin®)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant