Génération d'un modèle de rat de l'échec aigu de foie en combinant 70% hepatectomy partiel et acétaminophène

Résumé

Le modèle animal aigu d'échec de foie développé dans l'étude actuelle présente une alternative faisable pour l'étude des thérapies potentielles. Le modèle actuel utilise l'effet combiné des lésions hépatiques physiques et induites par la drogue et offre une fenêtre de temps appropriée pour étudier le potentiel des nouvelles thérapies.

Résumé

L'insuffisance hépatique aigue (ALF) est une condition clinique provoquée par diverses étiologies ayant pour résultat la perte des fonctions métaboliques, biochimiques, de synthèse, et de détoxification du foie. Dans la plupart des cas irréversibles de dommages de foie, la greffe orthotropique de foie (OLT) demeure le seul traitement disponible. Pour étudier le potentiel thérapeutique d'un traitement pour ALF, ses essais préalables dans un modèle animal d'ALF est essentiel. Dans la présente étude, un modèle ALF chez les rats a été développé en combinant 70% d'hépatectomie partielle (PHx) et des injections d'acétaminophène (APAP) qui fournit une fenêtre thérapeutique de 48 h. Les lobes latéraux médians et gauches du foie ont été enlevés pour exciser 70% de la masse de foie et APAP a été donné 24 h postsurgically pendant 2 jours. La survie chez les animaux induits par l'ALF s'est avérée sévèrement diminuée. Le développement d'ALF a été confirmé par des niveaux altérés de sérum des enzymes alanine amino transferase (ALT), le transferase d'aminé d'aspartate (AST), la phosphatase alcaline (ALP); changements dans le temps de prothrombine (PT); et l'évaluation du ratio international normalisé (INR). L'étude du profil d'expression de gène par qPCR a indiqué une augmentation des niveaux d'expression des gènes impliqués dans l'apoptosis, l'inflammation, et dans la progression des dommages de foie. La dégénérescence diffuse des hépatocytes et l'infiltration des cellules immunitaires ont été observées par évaluation histologique. La réversibilité d'ALF a été confirmée par la restauration des niveaux de survie et de sérum de l'ALT, de l'AST, et de l'ALP après la transplantation intrasplégique des hépatocytes sains syngéniques de rat. Ce modèle présente une alternative fiable aux modèles animaux ALF disponibles pour étudier la physiopathologie de l'ALF ainsi que pour évaluer le potentiel d'une nouvelle thérapie pour ALF. L'utilisation de deux approches différentes permet également d'étudier l'effet combiné des lésions hépatiques physiques et médicamenteuses. La reproductibilité et la faisabilité de la procédure actuelle est un avantage supplémentaire du modèle.

Introduction

L'insuffisance hépatique aigue (ALF) est définie par l'association américaine pour l'étude des maladies de foie comme développement rapide des dommages aigus de foie sans n'importe quel signe antérieur des dommages et est caractérisée par l'affaiblissement grave des fonctions synthétiques, métaboliques, et détoxifiantes du foie^1. ALF diffère de l'insuffisance hépatique chronique où l'échec se produit à la suite de lésions hépatiques causées sur une longue période de temps et d'insuffisance hépatique chronique aigue (ACLF), où des lésions hépatiques brusques a lieu à la suite de maladies chroniques du foie^2,3,4. Le seul remède disponible pour ALF est la greffe orthotopic de foie (OLT), ou la mort peut se produire. En raison de la pénurie de donneurs de foie, le taux de mortalité chez les patients souffrant d'ALF est très élevé.

Pour étudier le potentiel des approches thérapeutiques alternatives et pour mieux comprendre la physiopathologie de l'ALF, des modèles animaux qui peuvent refléter l'ALF se produisant chez les êtres humains sont nécessaires. Bon nombre des modèles animaux ALF déjà disponibles présentent plusieurs lacunes. Les effets de l'acétaminophène (APAP) sont difficiles à reproduire mais présentent les similitudes les plus étroites en termes de paramètres temporels, cliniques, biochimiques et pathologiques. Les modèles animaux induits par l'APAP rencontrent fréquemment des problèmes dus à la présence de la méthémoglobinémie causée par l'oxydation de l'hémoglobine par l'APAP et ses intermédiaires^5,6,7. Un autre problème est le manque de reproductibilité reflété par les réponses imprévisibles de dose et l'heure du décès. Les modèles animaux ALF produits à l'aide de chlorure de tétra de carbone (CCl₄) ont une mauvaise reproductibilité^8,9,10,11. Concavalin A (Con A) et lipoplysaccharide (LPS)-induit aLF modèles animaux ne reflètent pas le modèle clinique de la maladie humaine, mais ils ont des avantages dans l'étude des mécanismes cellulaires impliqués dans les maladies hépatiques auto-immunes et dans l'étude de la septicémie respectivement^12,13,14,15. De même, le thioacetamide (TAA) nécessite également une biotransformation à un métabolite actif de sulfoxide de thioacétamide et montre la variation des espèces^16,17,18,19. D-galactosamine (D-Gal) produit des changements biochimiques, métaboliques et physiologiques similaires à ALF, mais n'est pas en mesure de refléter l'ensemble de l'état pathologique ALF^20,21,22,23. Il ya eu très peu de tentatives de combiner deux ou plusieurs de ces méthodes pour développer un modèle ALF qui est capable de refléter le syndrome d'ALF d'une meilleure manière¹³. Par conséquent, d'autres études sont nécessaires pour développer un modèle qui peut refléter les paramètres de la maladie, a une meilleure reproductibilité, et fournit assez de temps pour étudier les effets d'une intervention thérapeutique.

Dans la présente étude, un modèle alternatif d'ALF chez les rats a été créé en combinant les effets de l'hépatectomie partielle (PHx) et des doses plus faibles d'un réactif hépatotoxique. L'APAP a un rôle bien établi dans la cause des lésions hépatiques^5,24,25. Il est un analgésique largement utilisé et est toxique pour le foie à des doses suprathérapeutiques en formant des métabolites toxiques. L'APAP est la cause de nombreux décès dans les pays développés. Les dommages physiques provoqués par l'hepatectomy partiel amorce l'activation de divers processus impliqués dans l'inflammation aussi bien que la régénération de foie. L'injection de l'agent hépatotoxique APAP provoque un environnement hostile dans le foie, empêchant la prolifération des hépatocytes. Cela réduit la période de stress sur l'animal, qui, lorsqu'il est combiné avec de plus petites doses d'hépatotoxine, conduit à une meilleure reproductibilité de la procédure. Par conséquent, à l'aide de ce modèle, un effet combinatoire de deux types de lésions hépatiques a été étudié. Pour caractériser le modèle animal Développé d'ALF, des paramètres physiologiques et biochimiques ont été étudiés. La réversibilité réussie d'ALF a été confirmée par la transplantation des hépatocytes sains syngéniques de rat.

Protocole

La procédure décrite ci-dessous a été approuvée par le Comité d'éthique animale institutionnelle du National Institute of Immunology, New Delhi. Le numéro de référence en série de l'approbation est IAEC-355/14.

1. Préparation

1. Préparez-vous pour l'intervention chirurgicale telle que décrite précédemment par Das B et coll.²⁶.
2. Utilisez des rats Wistar consanguins de 6 à 8 semaines d'un poids corporel de 200 à 250 g.
3. Loger les animaux dans des conditions de soins aux animaux standard et les nourrir avec du rat chow et du libitum avant et après la procédure.
4. Lors de l'exécution de 70% PHx, utilisez un mélange de cocktail standard d'hydrochlorure de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg de poids corporel), qui est injecté par voie intrapéritone.
   REMARQUE : Le type d'anesthésique utilisé peut avoir des effets postopératoires sur la mortalité et la morbidité.
5. Pendant la greffe cellulaire, utilisez l'anesthésie inhalante Isoflurane (2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-éthane) pour réduire le temps de récupération de l'animal après la chirurgie de transplantation.
6. Induire et maintenir l'anesthésie par inhalation à l'aide d'un système d'anesthésie personnalisé. Maintenir le débit d'oxygène à 4 L/min. Pour l'utilisation d'induction isoflurane à 4% et pour l'utilisation d'entretien 2-3% pendant l'intervention chirurgicale.

2. Procédures préopératoires

1. Anesthésiez le rat en injectant le mélange kétamine-xylazine décrit à l'étape 3.1 intrapéritone. Confirmer l'anesthésie complète en pinçant l'orteil de l'animal. D'autres procédures ne sont effectuées que lorsqu'il n'y a pas de réflexe de pédale.
2. Pour prévenir la dessiccation cornéenne, appliquez une goutte oculaire à base de méthyle-cellulose carboxy sur les deux yeux.
3. Retenez l'animal anesthésié à un tableau chirurgical à l'aide de ruban adhésif blanc. Placez l'animal avec le côté abdominal vers le haut, en veillant à ce que la bouche soit sur le côté distal de la personne effectuant l'opération.
4. Enlever les cheveux de la zone chirurgicale abdominale supérieure droite à l'aide d'une tondeuse électrique.
5. Désinfecter le site chirurgical par trois gommages alternés d'iode de povidone et 70% d'éthanol à l'aide de tampons de coton stérilisés en mouvement circulaire.

3. Hepatectomy partiel (PHx) pour enlever 70% de la masse du foie

REMARQUE : Effectuez l'ensemble de l'intervention chirurgicale sous un environnement stérile dans une hotte à écoulement laminaire. Utilisez uniquement des instruments chirurgicaux stériles pour minimiser le risque d'infection post-chirurgicale. L'ablation de 70 % de la masse hépatique, appelée 70 % d'hépatectomie partielle (70 % de PHx), a été réalisée comme l'ont décrit C. Mitchell et H. Willenbring, 2008²⁷.

1. Avant le début de la chirurgie, confirmer l'anesthésie complète de l'animal en pinçant son orteil. D'autres procédures ne sont effectuées que lorsqu'il n'y a pas de réflexe de pédale.
2. Marquez la peau à couper juste sous le sternum, perpendiculaire à la xiphoïde, et parallèle à la cage thoracique.
3. Placer une feuille de drapé stérile ayant une ouverture d'environ 3 cm x 1 cm sur la peau marquée.
4. Effectuer une incision transversale d'environ 2 à 3 cm le long de la ligne marquée avec un scalpel. Utilisez la lame chirurgicale no 22. Retirez délicatement l'attachement de la peau à la couche musculaire sous-jacente à proximité de la zone incisée à l'aide de pointes de coton stériles humidifiées.
5. Ensuite, faire une incision transversale à travers la couche péritonéale juste sous le processus xiphoïde.
6. À l'aide de deux bouts de coton salins humidifiés, exposez le lobe gauche du foie en appliquant une pression douce sur le thorax. Placez une pointe de coton sur la région diaphragmatique de la partie incisée et l'autre pointe de coton en dessous de la région incisée pour soulever le lobe du foie.
7. Glissez une boucle de fil de fil de nylon stérile de 8 à 10 cm de long (taille 4-0, 0,15 mm de diamètre) autour du lobe du foie exposé. Prenez la boucle jusqu'à la base du lobe près du hilum à l'aide de forceps microdissés ou de bourgeons de coton humidifiés.
8. Avec l'aide du porte-aiguille de microchirurgie et des microforceps, attachez les deux extrémités de la boucle, en plaçant le noeud aussi près que possible de la base du lobe pour resserrer le vaisseau sanguin et réduire les saignements après l'enlèvement du lobe du foie. Attachez deux noeuds supplémentaires de l'autre côté.
9. Prenez la précaution de ne pas attacher le noeud trop près des vaisseaux sanguins voisins, ce qui pourrait autrement causer une obstruction veineuse (sténose).
10. Utilisez des ciseaux de microchirurgie pour couper le lobe attaché juste au-dessus du noeud, ce qui laisse une masse décolorée de tissu appelé souche ischémique à la place du lobe.
    REMARQUE : Le foie de rat, comme ceux des souris, est divisé en quatre lobes distincts : le lobe médian, le lobe latéral droit, le lobe latéral gauche, et le lobe caudate, qui représentent environ 40%, 20%, 30%, et 7% de la masse totale de foie, respectivement. Toute combinaison de ces lobes peut être enlevée pour exciser 70% de masse hépatique. Dans la présente étude, le lobe médian et les lobes latéraux gauches ont été enlevés.
11. Localisez soigneusement le lobe médian sans endommager la souche restante du lobe latéral gauche. Retirez-le doucement de la cavité abdominale, et à la base du lobe attachez un fil de nylon de 8 à 10 cm de long (taille 4-0) noeud comme mentionné précédemment. Attachez deux noeuds supplémentaires de l'autre côté. Excisez soigneusement et retirez le lobe médian attaché en prenant toutes les précautions mentionnées.
12. Après avoir enlevé les lobes, suturer le péritoine à l'aide d'une suture chromice absorbable 4-0 avec des points continus suivis d'une suture cutanée avec une suture interrompue.
13. Appliquer de l'iode de povidone sur la peau entourant les sutures pour prévenir l'infection.
14. Retirez la feuille de drapé et retirez l'animal du tableau de chirurgie.

4. Soins postopératoires chez les animaux

1. Injecter intraperitoneally l'animal avec une dose de 12 mg d'antibiotique cefotaxime dans 1 ml de solution de glucose de 5% avec une seringue de 1 ml pour le protéger contre le risque d'infection postopératoire.
2. Administrer une injection sous-cutanée de méloxicam analgésique (1 mg/kg de poids corporel) pour soulager la douleur après la chirurgie et le suivre par deux doses de plus, en gardant le régime comme une dose par jour.
3. Loger les animaux exploités dans des conditions standard de cycle lumière/obscurité de 12 h et surveiller à intervalles réguliers.

5. Injection de drogue chez les animaux partiellement hépatectomisés pour induire une insuffisance hépatique

1. Après 24 h de postchirurgie, lorsque les animaux ont récupéré avec succès de 70% PHx, mesurer le poids corporel de l'animal suivie par les injections.
2. Injecter 750 mg/kg de poids corporel de l'APAP intrapéritonenellement chez les animaux partiellement hépatectomisés 24 h après le PHx de 70% suivant le rétablissement réussi des animaux de l'intervention chirurgicale. Répéter la dose après 24 h.
   REMARQUE : Deux doses d'APAP sont administrées par voie intrapéritone à l'animal (c.-à-d. 24 h et 48 h après la procédure de 70 % de PHx, respectivement).
3. À chaque moment après l'injection de l'APAP, mesurer le poids corporel de l'animal en convalescence.
   REMARQUE : L'APAP (biocétamol) est injecté chez les animaux sous forme de solution de 150 mg/mL dans 2 % d'alcool de benzyl.

6. Transplantation d'hépatocytes sains dans les modèles animaux ALF

REMARQUE : Pour étudier la réversibilité de l'ALF chez les rats, transplantez les hépatocytes syngénétiques sains de rat intrasplensiquement dans les animaux ALF-induits avec la^1ère dose d'APAP. Dans la présente étude, pour donner suffisamment de temps aux cellules transplantées pour le homing et l'engraftment, la transplantation a été faite juste après avoir donné la^1ère dose d'APAP. Les hépatocytes de rat sont isolés par un protocole d'abord édité par Berry and Friends et autres²⁸ et plus tard adapté dans diverses autres études^29,30^,31avec quelques modifications. Pour la transplantation intrasplénique des cellules dans le modèle animal d'ALF, suivez les étapes mentionnées ci-dessous.

1. Placez le rat dans une chambre poly (méthyle méthyllate) pour l'induction de l'anesthésie avec 4% d'isoflurane et 4 L/min flux d'oxygène pour un rat de 250-350 g de poids corporel. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie par l'absence de réflexes de pédale lors du pincement de l'orteil de l'animal.
2. Placez le rat anesthésié sur le panneau chirurgical de sorte que sa partie latérale gauche est orientée vers le haut. Maintenir l'anesthésie à 2-3% inhalation d'isoflurane par un embout buccal approprié.
3. Raser la peau sur la région latérale gauche et la stériliser par solution d'iode de povidone.
4. Faire une incision transversale sur la région rasée de la peau.
5. Faire une coupe de 1 à 2 cm dans la couche péritonéale pour exposer la rate.
6. Sortez délicatement la rate de la cavité péritonéale et soulevez-la à l'aide de deux bouts de coton humidifiés.
7. Gardez les cellules (généralement 10⁷ par animal) à transplanter suspendues dans un support IMDM de 50 l dans une seringue à insuline de 1 ml avec une aiguille de 29 G.
8. Percer doucement l'aiguille dans le cortex de la rate et libérer la suspension cellulaire dans la rate dans un délai de 2 à 3 minutes.
9. Une fois la transplantation cellulaire terminée, retirez soigneusement l'aiguille et tamponnez la zone de la ponction de l'aiguille avec une pointe de coton humidifiée pour éviter les fuites de la suspension cellulaire du site.
10. Fermer le péritoine et la peau par une suture absorbable 4-0 avec suturing continu et discontinu respectivement.
11. Appliquer la solution d'iode de povidone sur la peau à la place des sutures pour prévenir l'infection sur le site opéré.
12. Injectez par voie intrapéritone un volume de 1 ml de 12 mg/mL de solution antibiotique (p. ex., cefotaxime) et injectez sous-cutanée analgesic (par exemple, méloxicam) 1 mg/kg de poids corporel à l'animal dans le cadre de soins postopératoires. Déplacer l'animal dans une cage de récupération chaude.
13. Gardez l'animal opéré en isolement dans des conditions normales de 12 h de lumière / cycle sombre jusqu'à ce que les plaies chirurgicales sont complètement guéris. Cela peut prendre de 3 à 4 jours.

7. Caractérisation du développement d'ALF

1. Euthanasier les animaux par surdose de la solution de kétamine-xylazine 2 h après la 2^nd dose de traitement APAP et de recueillir des échantillons de sang et de tissus.
2. Recueillir le sérum du sang pour les études biochimiques³².
3. Traiter les échantillons de tissus hépatiques pour les études d'expression histologique et génique^33,34,35.

Résultats

Pourcentage de survie dans les modèles animaux d'ALF
La dose optimale d'APAP pour causer ALF en combinaison avec 70% PHx a été normalisée comme 750 mg/kg poids corporel. Le régime de traitement a commencé 24 h après 70% PHx, quand les animaux avaient complètement récupéré de la chirurgie, et s'est composé de deux doses d'APAP à des intervalles de 24 h. La mortalité a été observée au taux de 80% après l'administration de la deuxième dose d'APAP, 48 h post-chirurgie. Le pourcentage de...

Discussion

Le développement d'un modèle animal approprié pour ALF est primordial pour une meilleure compréhension de la pathogénie et de la progression de l'ALF. Un modèle animal ALF bien caractérisé offre également l'occasion de développer et d'essai de nouvelles approches thérapeutiques contre ALF. De nombreuses tentatives ont été faites pour développer un modèle cliniquement pertinent de ALF^6,12,21,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetaminophen (Biocetamol)	EG Pharmaceuticals		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Alkaline Phosphatase Kit (DEA)	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Automated analyser	Tulip, Alto Santracruz, India	Screen Maaster 3000	Biochemical analyser for liver functional test
Betadine (Povidon-Iodine Solution)	Win-Medicare; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Biological safety cabinet (Class I)	Kartos international; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Bright Field Microscope	Olympus, Japan	LX51
Cefotaxime (Taxim®)	AlKem; India		cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Cell Strainer	Sigma; US	CLS431752
Collagenase Type I	Gibco by Life Technologies	17100-017
Cotton Buds	Pure Swabs Pvt Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Drape Sheet	JSD Surgicals, Delhi, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
DPX Mountant	Sigma; US	6522
Eosin Y solution, alcoholic	Sigma; US	HT110132
Forceps	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Gas Anesthesia System	Ugo Basile; Italy	211000
Glucose	Himedia, India	GRM077
Hair removing cream (Veet®)	Reckitt Benckiser, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Hematoxylin Solution, Mayer's	Sigma; US	MHS16
Heparin sodium salt	Himedia; India	RM554
Hyaluronidase From Sheep Testes	Sigma; US	H6254
I.V. Cannula (Plusflon)	Mediplus, India	Ref 1732411420
Insulin Syringes	BD; US	REF 303060
Isoflurane (Forane®)	Asecia Queenborough	No B506	Inhalation Anaesthetic
Ketamine (Ketamax®)	Troikaa Pharmaceuticals Ltd.		Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement)
Meloxicam (Melonex®)	Intas Pharmaceuticals Ltd; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Micro needle holders straight & curved	Mercian; England	BS-13-8
Microtome	Histo-Line Laboratories, Italy	MRS3500
Nylon Thread	Mighty; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Paraformaldehyde	Himedia; India	GRM 3660
Percoll®	GE Healthcare	17-0891-01
Refresh Tears/Eyemist Gel	Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India	P3060	No specific Catalog Number
RPMI	Himedia; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scalpel	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Scissors	Major Surgicals; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGOT (ASAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
SGPT (ALAT) KIT	Coral Clinical System, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Shandon Cryotome E Cryostat	Thermo Electron Corporation; US		No specific Catalog Number
Sucrose	Sigma; US	S0389
Surgical Blade No. 22	La Medcare, India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical Board	Locally made		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Surgical White Tape	3M India; India	1530-1	Micropore Surgical Tape
Sutures	Ethicon, Johnson & Johnson, India	NW 5047
Syringes (1ml, 26 G)	Dispo Van; India		No specific Catalog Number (Local Procurement)
Trimmer (Clipper)	Philips	NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
Weighing Machine	Braun		No specific Catalog Number (Local Procurement)
William's E Media	Himedia; India	AT125
Xylazine (Xylaxin®)	Indian Immunologicals Limited		Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant