משלוח פנימי של אנטי-סנס וליגונו, במערכת העצבים המרכזית של חולדה

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה להעברת תרופות למערכת העצבים המרכזית העכברוש על ידי שתילת קטטר לתוך החלל המותני הפנימי של עמוד השדרה. אנו מתמקדים במסירת מחלת האנטי-הגיונית, למרות ששיטה זו מתאימה גם לאספקה של שיטות טיפוליות אחרות.

Abstract

מחסום מוח הדם (BBB) הוא הגנה חשובה מפני הכניסה של גורמים רעילים או גורמי הרסניות מהדם אל מערכת העצבים המרכזית (CN). עם זאת, קיומה גם מוריד באופן דרמטי את הנגישות של סוכנים רפואיים מנוהלים בצורה מערכתית ל-CN. שיטה אחת להתגבר על זה, היא להזריק את הסוכנים האלה ישירות לתוך הנוזל השדרתי (שדרתי), ובכך לעקוף את BBB. זה יכול להיעשות באמצעות השרשה של קטטר עבור אינפוזיה רציפה באמצעות משאבת אוסמוטי, או עבור משלוח בודד. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול כירורגי למסירה של מערכת היעד האנטי הגיונית פורוזימטר (אסוס) באמצעות קטטר מושתל ישירות לחלל תסמונת זנב של עמוד השדרה למבוגרים חולדה. כתוצאות מייצגות, אנו מראים את היעילות של בודד באמצעות הזרקת הרכב (IT) באמצעות המערכת הזאת מערכת להפיל את RNA היעד באזורים שונים של ה-CN של החולדה. ההליך הוא בטוח, יעיל ואינו דורש ציוד יקר או כלים כירורגיים. ניתן להתאים את הטכניקה המתוארת כאן לאספקת סמים גם באופנים אחרים.

Introduction

מערכת כלי הדם של מערכת העצבים המרכזית (CN) התפתחה כרגולטור קריטי של הומאוסטזיס, שליטה על התנועה של מולקולות, אספקת חומרים מזינים ולהיפטר פסולת. מערכת זו היא גם קו ההגנה הראשון מפני תקיפות של פתוגנים חיצוניים, הודות לחלוקה צפופה של צמתים הדוקים לאורך קירות התאים האנדותל. הצמתים הצמודים האלה מפצות על היבט אחד של מחסום מוח הדם (BBB). בעוד bbb מאפשר את ההובלה של מולקולות הדרושות כדי להגשים דרישות התזונתיים והאנרגיה (g., יוני, גלוקוז), זה גם מגביל באופן סלקטיבי את המעבר של פתוגנים, כמו גם כימיקלים רעילים^1,2,3.

באופן אירוני, אותו תפקיד מגן של BBB כי מגביל מעבר של פתוגנים וכימיקלים רעילים גם הוא המכשול העיקרי ליכולתנו לגשת בקלות את ה-CN עם טיפולים טיפוליים לאחר הממשל מערכתית לאורגניזם^{2, 4,5}. תפקיד זה של BBB מבקש פיתוח של שפע של טכנולוגיות חדשות להפצת סמים וגישות⁶.

אחת הדרכים להתגבר על מכשול זה היא להזריק את התרופות ישירות לתוך הנוזל המוחי-שדרתי (שדרתי) כי ברציפות הן המוח והן חוט השדרה^7,8,9,10. במאמר זה, אנו מתארים שיטה כדי לספק בהצלחה סוכנים לתוך החלל המותני המותניים על ידי הצבת הקצה הפנימי של הקטטר לחלוטין בחלל תסמונת זנב של עמוד השדרה חולדה. תיאור של הליך זה פורסם בעבר על ידי מזור ואח^'.

הפרוטוקול הוא יעיל מאוד ומייצרת גדול מ 90% שיעור הצלחה של antilig, משלוח כמותי (ה-ASO) המסירה ל-CN כאשר מוערך על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ניתוח של היעד הגנטי הסתרה⁸. ההליך גורם אי-נוחות מינימלית לבעלי החיים, כמו 100% של חולדות לשרוד את הניתוח ולהראות נפיחות מינימלית סביב הפצע כירורגי ואין סימנים של מצוקה (למשל, היפראקטיביות, התייבשות, מקיפים, אובדן של איזון, ירידה צריכת המזון, ו התייבשות) במהלך התבוננות שלאחר ניתוח. יתרון נוסף של השיטה המתוארת כאן הוא שהוא אינו דורש ציוד יקר, או כלים מיוחדים.

Protocol

כל בהליכים vivo בוצעו תחת השימוש המוסדי Biogen בעלי חיים והוועדה טיפול (IACUC) מאושר פרוטוקולים אשר לעקוב אחר ההנחיות שנקבעו על ידי ארצות הברית הלאומי המכון לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הכנת חומרים וכלים

1. הכינו את הצינורית המיוחדת למדריך.
   1. השתמש בכלי רוטרי עם גלגל חתוך (או מסור חד) כדי לחתוך את שני הקצוות של המחט G 19, וכתוצאה מכך באמצעות צינורית מדריך ארוך של ~ 1.5-2 ס מ (איור 1aiii). להשתמש בגלגל לטחינת של הכלי רוטרי להחליק את שני הקצוות.
      הערה: ניתן לרכוש באמצעות ספק מסחרי ובאמצעות צינורית מדריך מוכן וסטרילי (רשימת חומרים).
2. הכינו את הקטטר/הרכבת תיל.
   1. גזור פיסת 8 ס"מ ארוך של צינורות PE-10 (פוליאתילן אבובים, קוטר 0.011 אינץ ') כדי לשמש צנתר התוך הפנימי. לעשות סימן 2 ס מ מקצה אחד עם עט הסמן עמידים בפני אתנול. לחתוך כבל מצופה באורך 11 ס מ מחוטי נירוסטה. הכנס את התיל stylet (איור 1הכל) לתוך לומן של הצנתר PE-10 (איור 1Ai).
      הערה: מערכת קטטר/תיל אחת (איור 1באב) נדרשת עבור כל חיה. לחילופין, קטטרים ומוצרי קטלייט ניתנים לרכישה מספק מסחרי (טבלת חומרים).
3. להכין צנתר משלוח הרכבה.
   1. חותכים פיסת קטטר PE-50 (5-10 ס מ, אבובים פוליאתילן, קוטר 0.023 אינץ ') (איור 1Bi). לקצה אחד של הקטטר PE50 להוסיף 23 G אבובים מתאם (איור 1באלה). קצה זה יהיה מחובר למזרק 100 μL (טבלת חומרים) במהלך הניתוח. הוספת המחט שונה 30 G עם הרכזת לחתוך (איור 1biii) לתוך כ 0.5 ס מ בחתיכה של הצינורות Pe-10 (איור 1biii) ולחבר את הצינורות pe-10 לקצה השני של הצנתר.
   2. The 30 המחט הקצה של הרכבה קטטר המסירה (איור 1Bv) יהיה מחובר לקצה המרוחק של הצנתר המושתל PE-10 בחולדה במהלך הניתוח.
      הערה: לחלופין, ניתן לרכוש את הרכבת קטטר המסירה (איור 1Bv) מספק מסחרי (טבלת חומרים).
4. הכינו את מכלול המחט המנחה (איור 1אבי) על-ידי הצבת צינורית מדריך (איור 1aiii) בסוף מחט של 23 גר'.
5. לחטא את כל כלי הניתוח כולל צינורית המדריך ואת ערכות התיל/קטטר באמצעות מעקר תחמוצת אתילן עבור 12 h.
   הערה: כל כלי הניתוח מלבד הקטטר יכול להיות אוטומטית; קטטר ימס בטמפרטורה גבוהה.

2. הכנת כירורגיה

הערה: הליך זה מבוצע באופן שגרתי על גברים ועכברים מג הנשי משחק עם משקולות הגוף בין 200 g ו 400 g. שני חולדות ממוקמים לכלוב תחת 12 h מחזור אור/כהה עם גישה חופשית למזון ולמים.

1. משקל חולדה ומניחים אותו בחדר isofלבנה כדי לגרום להרדמה (1-5% isofלוריאן ב O₂, טיטרציה כדי להשפיע).
   הערה: העכברוש מורדם ברציפות עם isof, כדי לשמור על הרדמה עמוקה באמצעות חרוט אף לאורך כל ההליך. שיטת הרדמה חלופית (למשל, ניהול של קטמין 100 mg/ק"ג ו xylazine 10 מ"ג/ק"ג) ניתן להשתמש כפי שאושרו על ידי IACUC.
2. כאשר החולדה נכשלת להגיב לצביטה בבוהן, לגלח את גבו מן הזנב אל השדרה החזה של caudal ולמקם את העכברוש מגולח על סדין סטרילי הניח על גבי כרית חימום.
3. מיקום שפופרת צנטריפוגה חרוטי 50 ml מתחת לבטן החולדה כדי לכופף את עמוד השדרה באזור המותניים (איור 2א) ולהחיל משחה אופטלמולוגית על העיניים.
4. הכנס בופרינורפין שחרור מתמשך (1.0 מ"ג/ק"ג; רשימת חומרים) . תת-עורי בחולדה לנקות את העור חשוף עם povidone לסירוגין וחלוק אלכוהול ולחזור על זה שלוש פעמים.
   הערה: ניתן להשתמש בשיכוך כאבים חלופיים כמאושרים על-ידי פרוטוקול IACUC.
5. לעטוף את החיה עם העטוף שקוף סטרילי כי כבר מדורגים על האתר כירורגי.

3. כירורגיה

1. עם עכברוש נתמך על ידי צינור 50 mL, לזהות את שני בורות טבעיות בין השרירים מעל האגן (חיצים באיור 2א). עם יד אחת מחזיק את הבורות האלה, להשתמש ביד השנייה כדי ללחוץ בעדינות ולהרגיש את עמוד השדרה של caudal לכיוון rostral ולמצוא את הכניסה הגדולה הראשונה בין החוליות וזה החלל הבין החוליות בין S1 ו L6 חוליות (איור 2B ).
2. העבר מעט rostrally כדי לזהות את ההזחה הבאה, את המרחב הבין החוליות בין L5 ו L6 חוליות ואת אתר ההזרקה (* באיור 2א). השתמש אזמל לעשות חתך לא יותר 2 ס"מ ארוך בעור לאורך קו האמצע מ rostral כדי caudal כך באתר ההזרקה היא במרכז החתך (קומנוקד באיור 2א).
3. השתמשו במספריים לחיתוך כדי לנתח את רקמת החיבור כדי להמחיש את שכבת השריר. ואז לעשות חתך 1 ס מ בקפסולה שריר מיד לרוחב לתהליך השדרה הצדדית של חוליית המותניים L6.
   הערה: העצמות של חוליית המותניים של L6 יכולות להיות מדמיינו בשלב זה.
4. מקמו את מכלול המחט של המדריך בסמוך להיבט הקדמי של חוליית המותניים השישית ודחפו אותו לתוך החלל הבין-חולייתי לאורך ההיבט הקדמי של החוליה השישית, כך שסוף המחט חודר לתעלת השדרה. לחצו על צינורית המדריך במקום לאורך המחט והסירו את המחט של 23 גר' שעוזבת רק את צינורית ההנחיה במקומה.
   הערה: מומלץ להשתמש בלקחיים בוטים כדי לאתר את התהליך הL6 של חוליית המותניים לפני החדרת המחט. באופן כללי, נוזל שדרתי הנוזלים ניתן לראות כניסה לרכזת מחט (נוזל זה עשוי להיות מעובד עם רמז של דם, אבל זה לא מעיד כי הנזק נעשה או כי המחט אינה ממוקמת כראוי). המחברים לא ראו כמות גדולה של דם או דימום חמור במהלך הליך זה. אם זה קורה, יש ליצור קשר עם וטרינר כדי לקבוע את הטיפול המתאים, ואם יש לקבל בעלי חיים מורדמים.
5. הכנס את הרכבת הקטטר. לתוך צינורית המדריך זווית למטה צנתר-תיל הרכבה בקירוב זווית 45 ° לתעלת השדרה ולאלץ את הסוף כ 0.3 ס מ לתוך תעלת השדרה.
6. הסירו את צינורית המדריך, והשאירו את הקטטר במקום. הסר את התיל stylet כ 2.5 ס מ מהקצה הפנימי של הצנתר ולקדם את הקטטר לתוך תעלת השדרה עד 2 ס"מ סימן הוא בכניסה של התעלה (רק גלוי מתחת לשריר) כפי שמוצג באיור 1bvi.
   הערה: הקטטר שהוכנס צריך להאריך rostrally לתוך מרחב התת-מזהה. מיקום מוצלח צריך לאפשר תנועה חופשית של הצנתר בחלל זה.
7. משיכת לחלוטין את חוט התיל, ו שדרתי נראה להיכנס הצנתר מושתל.
8. לחבר את הרכבת קטטר מסירה לקצה המרוחק של הצנתר מושתל דרך המחט 30 G (איור 1Bv, vi).
9. טען 60 μL של תמיסת מלח סטרילית לתוך מזרק 100 μL (מזרק השטיפה). טען את המנה של 30 μL של מתחם הבדיקה (למשל, פתרון ASO) למזרק שני (מזרק הזרקה).
10. לחבר את מזרק השטיפה (טעון עם מלוחים) אל המתאם אבובים הקצה של הרכבת קטטר מסירה (איור 1Bv). הכנס 20 μL של תמיסת מלח סטרילית לתוך המרחב הפנימי (הזרקה לפני ההזרקה).
11. לחבר את מזרק ההזרקה (טעון עם מתחם בדיקה) למתאם אבובים בקצה של הרכבת קטטר מסירה (איור 1Bv). הכנס 30 μL של תרכובת הבדיקה לחלל הפנימי מעל 30 s.
    הערה: נפח ההזרקה השגרתי של ASO הוא 30 μL כדי להשיג הסתרה טוב בחוט השדרה ובקליפת המוח. דווח כי אמצעי האחסון להזרקה עלולים להשפיע על התפלגות מורכבת¹², למרות שאמצעי אחסון שונים של הזרקה לא נבדקו. אם נעשה שימוש בתרכובת או באמצעי אחסון אחרים, הבטיחות והיעילות צריכים להיקבע באמצעות הסדר האמפירי.
12. חזור על שלב 3.10 ו לשטוף את הקטטר עם אחר 40 μL של תמיסת מלח סטרילי (שלאחר הזרקה שטיפה). ואז לנתק את הרכבת קטטר המסירה מן הצנתר מושתל.
    הערה: ריקון מראש ולאחר הזרקה הוא חשב להפחית את הקיבוע על המקומית של תרכובות ולשפר את ההפצה שלהם למבנים rostral¹².
13. חתך aseptically ומחממים את הצנתר מושתל: מקום זוג של מלקחיים לחיתוך סטרילי בתוך עיקור חרוז עד שהם חמים מאוד, אז מלקחיים על אבובים עם קצה חם של מלקחיים.
    הערה: פעולה זו ממיסה את הצנתר. כך, החור בצינור מתמוטט וכל הצדדים נדבקים זה לזה, איטום אבובים באופנה אספטי ולאחר מכן הוא ממוקם לתוך החלל התת עורית.
14. השתמש בתפרים מונופינט לספיגה כדי לאבטח את הצנתר שנותר אטום החום לרקמת החיבור. לאחר מכן השתמש בתפרים מונופינט לא נספגים כדי לסגור את העור על הצנתר המאובטח אטום החום.
    הערה: ניתן להשתמש בקליפי הפצע גם כמאושרים על-ידי פרוטוקול IACUC. הטכניקה תואמת לזריקות חוזרות ונשנות למרות שהיא משמשת רק לזריקות חד פעמי בידינו. הכדאיות של זריקות חוזרות צריך להיות מוערך במידה מדעית עם אישור IACUC.
15. השתמש גזה ותמיסת מלח לשטוף כל דם מן העור ולאפשר לבעל החיים להתאושש מן ההרדמה בחממה מחוממת עד הנייד, ובשלב זה הוא חזר כלוב הבית שלה (שני חולדות לכל כלוב).
    הערה: בעת ביצוע ניתוחים על חולדות מרובות באותו יום, כלים נקיים המשתמשים במים כדי להסיר דם ולעקר מחדש תוך שימוש בעיקור מחומם יבש מחוטא (לפחות 20 s, עם זמן להתקרר) בין בעלי חיים. סט חדש של מכשירים משמש כל 5 בעלי חיים.
16. עקוב אחר בעלי החיים מדי יום לפחות 3 ימים לאחר הניתוח ולהמשיך לעקוב אחר החיות לשבוע לאחר התאוששות מהניתוח בהתאם לפרוטוקול IACUC.
    הערה: אם מתרחשים סיבוכים כלשהם (החזקת שתן, דלקות חתך, הפרעה נוירולוגית כגון תפיסה או שיתוק), יש ליצור קשר עם וטרינר כדי לקבוע את הטיפול המתאים, ואם יש להמתו בעלי חיים. אם שחרור מתמשך בופרנורפין אינו משמש, הקלה בכאב יש להינתן מדי יום לאחר הניתוח בהתאם לפרוטוקול IACUC.

4. הערכה של המחנוק מסוים לאחר הזרקת הנייר

1. שבועיים לאחר הזרקת ההזנה של אסוס, לאסוף אזורים שונים של המוח (כלומר, קליפת מוחין, סטריאטום והמוח) כמו גם קטעים שונים של חוט השדרה (כלומר, צוואר הרחם, החזה, והמותניים). לחלץ את ה-RNA רקמות הכולל באמצעות ערכת החילוץ RNA מסחרי ולבצע תגובת סינתזה cDNA כמתואר בעבר¹³.
   הערה: ריאגנטים רגיל שימשו ל-qPCR עם מספר השורות הבאות: עכברוש Malat1 ועכבר. רמות התעתיק היחסיות חושבו באמצעות השיטה 2^-ΔΔCt (CT = מחזור הסף).

תוצאות

באמצעות השיטה המתוארת כאן, הזרקנו שתי קבוצות של חולדות נשים בוגרות (250-300 גרם; n = 10/קבוצה) עם מנת אחת של מלוחים באגירה של פוספט-PBS או 300 μg של ASO מיקוד ארוך שאינו קידוד (לינק) RNA Malat1; במעבדה שלנו אנו משתמשים באופן שגרתי Malat1 ASO כמו מתחם כלי, כי Malat1 מתבטאת אוביקוויטיות ברמות גבוהות ב?...

Discussion

המאמר הנוכחי מראה שיטה רבת עוצמה כדי לספק סוכנים טיפוליים ישירות לתוך ה-CN של החולדה. בתאוריה, טכניקה דומה יכולה להתבצע גם בעכברים, אם כי במידה הקטנה יותר, השיטה יכולה להיות מאתגרת יותר. לכן, הקבוצה שלנו מבצעת הזרקת המוח התאיים (ICV) בעכברים עבור העברת תרופות ה-CN, המגיעות לאותן מטרות באמצעות תו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3M Steri-Drape Small Drape with Adhesive Aperture	3M		1020
70% ethanol	Decon Laboratories, Inc		8416-160Z
Alcohol swab sticks	Dynarex		NO 1204
BD General Use Syringes 1 mL Luer-Lok tip	BD	1ml TB Luer-Lok tip	BD 302830
BD Intramedic PE Tubing	BD	Polyethylene tubing PE50 Diameter 0.023 in	BD 427400 (10ft, Fischer Scientific 22-204008) or 427401 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12P)
BD Intramedic PE Tubing	BD	Polyethylene tubing PE10 Diameter 0.011 in	BD 427410 (10ft, Fischer Scientific 14-170-11B) or 4274011 (100ft, Fischer Scientific 14-170-12B)
BD Intramedic PE Tubing Adapters	BD	23 gauge intramedic luer stub adaper	BD 427565 or Fisher Scientific 14-826-19E
BD PrecisionGlide Single-use Needles 30G	BD		BD 305128
Buprenorphine Sustained Release-lab	ZooPharm	Prescription required
Ethylene oxide sterilizer	Andersen Sterilizer INC.	AN 74i, gas sterilizer	AN 74i
Guide cannula	BD	19G x 1 WT (1.1 mm x 25mm) needle	BD 305186
Hamilton syringe 100ul	Hamilton company	Hamilton syringe 100ul
Hot bead Sterilizer	Fine Science Tools		STERILIZER MODELNO FST 250
Ophthalmic ointment	Dechra veterranery product		17033-211-38
Pocket Pro Pet Trimmer	Braintree Scientific		CLP-9931 B
Povidone scrub	PDI		S48050
Saline	Baxter	Sodium Chloride 0.9% Intravenous Infusion BP 50ml	FE1306G
Scalpel	Feather	disposable scalpel	No. 10
Small animal heating pad	K&H Manufacturing		Model # 1060
Stylet Wire	McMaster-Carr	1749T14	LH-36233780
Surgery Towel drape	Dynarex		4410
Surgical scissors and forceps	FST and Fisher Scientific
Sutures	Ethicon		4-0 or 5-0
Tool to make the Guide cannular	Grainger	Rotary tool (Dremel)	14H446 (Mfr: EZ456)
		EZ lock cut off Wheel	1PKX5 (Mfr: 3000-1/24)
		Grinding Wheel, Aluminum Oxide	38EY44 (Mfr: EZ541GR)
		EZ lock Mandrel	1PKX8 (Mfr: EZ402-01)
		Diamond wheel floor Tile	3DRN4 (Mfr: EZ545)
Alternative source for pre-made and sterilized materials for this procedure
Dosing catheter system	SAI Infusion Systems		RIDC-01
Guide cannula	SAI Infusion Systems		RIDC-GCA
Internal Catheters	SAI Infusion Systems		RIDC-INC
Stylet Wire	SAI Infusion Systems		RIDC-STY